計(jì)竹娃，金慧芳

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥物制劑專業(yè)，浙江 寧波 315100；2.杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 針灸科，浙江 杭州 310003)

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正交實(shí)驗(yàn)法與多元非線性回歸法優(yōu)化蘇杏二陳糖漿水提工藝的比較分析

計(jì)竹娃1Δ，金慧芳2

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥物制劑專業(yè)，浙江 寧波 315100；2.杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 針灸科，浙江 杭州 310003)

目的 通過正交實(shí)驗(yàn)法與多元非線性回歸法，篩選蘇杏二陳糖漿的最佳水提工藝。方法 以柚皮苷含量和浸膏得率為指標(biāo),運(yùn)用正交試驗(yàn)及多元非線性回歸分析法優(yōu)化提取條件。結(jié)果 運(yùn)用多元非線性回歸法可以得到蘇杏二陳糖漿的最佳水提取工藝為：無需提前浸泡，加7倍量的水提取2次，每次80 min。結(jié)論 蘇杏二陳糖漿水提工藝結(jié)果準(zhǔn)確、高效，適合生產(chǎn)需求。

蘇杏二陳糖漿；柚皮苷；多元非線性回歸法；水提；正交試驗(yàn)

蘇杏二陳糖漿是由化橘紅、茯苓、法半夏、甘草、杏仁等多味藥材提取有效部位制成的中藥制劑，具有宣肺、止咳，化痰的功效，用于風(fēng)寒感冒所致引起的咳嗽，痰多。化橘紅，即化州橘紅，為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮。具有理氣寬中，燥濕化痰的功效，常用于咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶[1]，是蘇杏二陳糖漿處方中的君藥之一?；偌t的主要成分有揮發(fā)油、黃酮類、多糖和氨基酸等[2-5]。中國藥典以柚皮苷含量為化橘紅的質(zhì)量控制指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)以柚皮苷含量和浸膏得率為指標(biāo)，對(duì)比直觀方差分析和多元非線性回歸分析的差異，考察處方的最佳水提工藝，為制劑工藝研究提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Agilent 1260全自動(dòng)高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)(Agilent)，BS210S電子天平(梅特勒-托利多)。

1.1.2 藥品與試劑：柚皮苷對(duì)照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110722-201312，純度為94.7%)；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.1.3 藥材：所用藥材均購自安徽中信中藥飲片廠，經(jīng)寧波市藥品檢驗(yàn)所桑旭峰副主任(中藥師)檢驗(yàn)均符合《中國藥典》2010年版一部標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 柚皮苷的含量測(cè)定[1]

① 色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-冰醋酸-水(35︰4 ︰61)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：283 nm。

② 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定柚皮苷對(duì)照品5.22 mg，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷62.64 μg的溶液，即得。

③ 供試品溶液的制備：按照本文試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，按比例選取處方中五味飲片進(jìn)行提取后，進(jìn)一步濃縮定容至500 mL。精密量取提取液5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

④ 線性關(guān)系考察：精密吸取柚皮苷對(duì)照溶液1、2、5、10、20 μL，分別進(jìn)樣，計(jì)算峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

⑤ 精密度試驗(yàn)：在上述色譜條件下，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定。

⑥ 重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取正交試驗(yàn)3號(hào)提取液6份，按照1.2.1項(xiàng)下③操作，分別制得供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定。

⑦ 回收率試驗(yàn)：精密量取正交試驗(yàn)3號(hào)提取液6份，置50 mL容量瓶中，分別加入對(duì)照品溶液5 mL，按照1.2.1項(xiàng)下②操作，分別制得供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

① 正交試驗(yàn)因素：考慮到可能影響水提取效果的主要有浸泡時(shí)間、加水倍數(shù)、提取的時(shí)間，提取的次數(shù)等4個(gè)主要因素[6-8]，故選取柚皮苷含量和浸膏得率為指標(biāo)，選擇浸泡時(shí)間(A)、提取時(shí)間(B)、加水量(C)和提取次數(shù)(D)4個(gè)影響因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按L9(3)4正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)[9]，優(yōu)選最佳提取工藝。見表1。

表1 因素水平表

② 正交試驗(yàn)方法：按照按處方量稱取9個(gè)處方量的化橘紅、茯苓、法半夏、甘草、杏仁等5味藥材136 g，分別按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行煎煮，濾過，分別收集每次的濾液，濃縮，定容至500 mL，備用。

1.2.3 多元非線性回歸分析[10-12]：回歸分析，是在掌握大量觀察數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法建立因變量與自變量之間的回歸關(guān)系函數(shù)表達(dá)式(稱回歸方程式)。每種回歸又分為線性回歸和非線性回歸。將上述柚皮苷含量和浸膏得率為因變量(Y1、Y2)，將各影響因素的取值作為自變量(X1、X2、X3、X4)，分別做線性和非線性回歸。

1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方組成比例稱取3份藥材，采用優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷的含量測(cè)定

2.1.1 線性關(guān)系：通過計(jì)算其回歸方程為Y=293.3X+2.2768，r=0.9998(n=5)。結(jié)果表明，柚皮苷對(duì)照在0.06264～1.2528 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)：主峰峰面積RSD為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)：峰面積RSD為2.15%，表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.1.4 回收率試驗(yàn)：柚皮苷的回收率分別為97.53%、99.68%、96.85 %、97.23%、99.68%、101.16%，平均回收率為98.69%，RSD為1.75%。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)所得的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行直觀分析和方差分析[13]。見表2。從表2的結(jié)果可以看出，當(dāng)以柚皮苷為考察指標(biāo)，各影響因素的主次順序?yàn)椋?D>B>C>A，即提取次數(shù)對(duì)柚皮苷的含量結(jié)果的影響最大，其次為提取時(shí)間和加水量，浸泡時(shí)間影響最小，最優(yōu)組合為A2B2C3D2。但對(duì)于浸膏得率來說，各影響因素的主次順序?yàn)椋篊>D>B>A，即影響因素最大的是加水量，最小的是浸泡時(shí)間，最優(yōu)組合為A1B3C1D2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

續(xù)表

以柚皮苷為考察指標(biāo)時(shí)，D、B因素對(duì)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余2個(gè)因素沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)，與上述直觀分析的結(jié)論一致。當(dāng)以浸膏得率為考察指標(biāo)時(shí)，除因素A外，其他3個(gè)因素均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4)，與直觀分析結(jié)論中A為影響最小的因素相一致。

表3 柚皮苷含量方差分析表(n=3)

表4 浸膏得率方差分析表(n=3)

2.3 多元非線性回歸分析 回歸方程以及優(yōu)化計(jì)算結(jié)果，見表5、表6、表7。非線性方程中各變量顯著性檢查結(jié)果見表8、表9。由表5的結(jié)果可以看出，2個(gè)指標(biāo)的線性方程調(diào)整后相關(guān)系數(shù)在0.7左右，無論是F值還是P值都無法滿足顯著性檢驗(yàn)要求，方程擬合度不高，預(yù)測(cè)性差。可以證明此次試驗(yàn)結(jié)果非簡單的線性關(guān)系，需考慮使用非線性回歸分析。

經(jīng)過非線性回歸分析，結(jié)果見表6?？梢?個(gè)指標(biāo)的多元非線性回歸方程的調(diào)整后相關(guān)系數(shù)都接近1，P值小于0.05，且Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)量趨近于2，說明方程擬合度高，且殘差間無明顯相關(guān)性。由表7的各變量的顯著性檢查結(jié)果可以看出，柚皮苷回歸方程中，各因素P值均小于0.05，統(tǒng)計(jì)結(jié)果又顯著性差異，包括單因素、因素二次項(xiàng)和交互項(xiàng)。其中X1×X1的P值接近0.05，這與方差分析中A因素顯著性不強(qiáng)結(jié)果一致。由表9的各變量的顯著性檢查結(jié)果可以看出，浸膏得率回歸方程中，各因素P值均小于0.05，統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異。柚皮苷含量與B、C因素有顯著的關(guān)系，且其他各因素的相互作用對(duì)柚皮苷的提取存在一定的影響，其最佳試驗(yàn)條件見表7。另外從表7可知浸膏得率優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件，除浸泡時(shí)間外，與前文中直觀分析所得優(yōu)化條件A1B3C1D2基本一致。

表5 多元線性回歸分析表

表6 多元非線性回歸分析表

表7 最佳試驗(yàn)優(yōu)化分析結(jié)果

表8 柚皮苷含量非線性回歸方程各變量顯著性檢查結(jié)果

表9 浸膏得率非線性回歸方程各變量顯著性檢查結(jié)果

綜合考慮柚皮苷含量和浸膏得率2個(gè)指標(biāo)的優(yōu)化條件，同時(shí)考慮到柚皮苷在處方中的重要性和生產(chǎn)過程中的實(shí)際情況，采取無需提前浸泡，加7倍量的水提取2次，每次80 min的試驗(yàn)方案。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 優(yōu)選工藝驗(yàn)證結(jié)果(%，n=3)

3 討論

考慮到本制劑為口服糖漿劑，浸膏越多，對(duì)制劑的澄清度和穩(wěn)定性的控制難度越大，故優(yōu)選提取工藝在提高柚皮苷含量的同時(shí)，降低浸膏得率。

對(duì)比直觀和方差分析與多元非線性回歸分析的結(jié)果，2者之間有部分的相似，同時(shí)也存在一定的差異。分析其原因，可能在于直觀和方差分析沒有考慮到各變量的相互作用[14-15]，從非線性回歸方程中各變量的顯著性可以看出，各因素間的相互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)有顯著性影響。同時(shí)直觀方差分析只能定性分析各因素的主次關(guān)系，不能給出最優(yōu)化條件下各影響因素的準(zhǔn)確取值，對(duì)結(jié)果無法給出準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。如文中所述，本文的最優(yōu)工藝中7倍量水和80 min的提取時(shí)間都不是原正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件，而是通過回歸方程計(jì)算得來，驗(yàn)證試驗(yàn)表明結(jié)果一致，可以作為生產(chǎn)設(shè)計(jì)的選擇依據(jù)。

通過文中的試驗(yàn)，可以得知對(duì)于處方較為復(fù)雜的中成藥制劑來說，由于藥材種類多，藥材中的性質(zhì)迥異成分更多，無法避免的存在相互影響的因素，如果用線性描述將丟失大量信息，甚至得出錯(cuò)誤結(jié)論，這時(shí)可以用非線性回歸方法分析。結(jié)果表明多元非線性回歸分析法效果明顯優(yōu)于線性回歸，有較高的實(shí)用價(jià)值。

綜上所述，蘇杏二陳糖漿的最優(yōu)水提工藝為: 無需提前浸泡，加7倍量的水提取2次，每次80 min。

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(編校：王冬梅)

Comparison and analysis on water extraction process of the preferred SuXingErChen Syrup by orthogonal test and multivariate nonlinear regression analysis

JI Zhu-wa1Δ, JIN Hui-fang2

(1.Major of Pharmaceutical Preparations, Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China; 2.Department of Acupuncture and Moxibustion, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310003, China)

ObjectiveTo select optimum water extraction process of SuXingErChen Syrup by orthogonal test and multivariate nonlinear regression analysis.MethodsNaringin was extracted by water, Used the naringin content and extraction rate of extractum as indexes.Based on the orthogonal test and multivariate nonlinear regression analysis to make sure the best way for extracting naringin from SuXingErChen Syrup.ResultsThe optimal conditions of water extraction process was that the herbs were added seven times the amount of water without infiltration,extracted two times with 80 min each time,which was selected by multivariate nonlinear regression analysis.ConclusionThe process of water extraction for the preferred Su XingErChen Syrup is exact, high effective and suitable for production needs.

SuXingErChen Syrup; naringin; multivariate nonlinear regression analysis; water extraction; orthogonal test

計(jì)竹娃，通信作者，女，碩士，講師，研究方向；藥物制劑新劑型，E-mail：1513103398@qq.com。

R284.2

A

1005-1678(2015)10-0147-04