池絮影，崔曰新，張蜀，鄧紅

(廣東藥學(xué)院 藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

?

一測多評法測定板藍(lán)根顆粒中4種成分的含量

池絮影，崔曰新，張蜀，鄧紅Δ

(廣東藥學(xué)院 藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

目的 建立同時(shí)測定板藍(lán)根顆粒中腺苷、尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春的一測多評法。方法 以腺苷為內(nèi)標(biāo)物，確定板藍(lán)根中其他3種成分相對于腺苷的校正因子，通過相對校正因子(relative correction factor,RCF)對尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)一測多評(計(jì)算法)；同時(shí)采用外標(biāo)法測定板藍(lán)根顆粒中4種成分的含量(實(shí)測值)，并比較一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的差異。結(jié)果 各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好。尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春按一測多評方法與外標(biāo)法測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 本研究建立的一測多評法簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

一測多評；腺苷；尿苷；鳥苷；(R,S)-告依春；UPLC；HPLC

板藍(lán)根顆粒是國家基本藥物，收載于《中國藥典》2010年版一部，為板藍(lán)根經(jīng)水提醇沉等步驟制成的單方中藥顆粒劑，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無定量控制指標(biāo)[1]，而《中國藥典》2010年版一部收載的板藍(lán)根[2]僅使用(R，S)-告依春單一檢測指標(biāo)。按照傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的“整體觀”，中藥藥效是藥品中多個(gè)藥效成分的綜合效應(yīng)[3-4]，因此有必要建立板藍(lán)根顆粒的多成分同步質(zhì)量控制方法。然而現(xiàn)實(shí)中的對照品供需矛盾和多指標(biāo)質(zhì)控高昂的檢測成本又限制了多指標(biāo)質(zhì)量控制模式在實(shí)際生產(chǎn)、科研、監(jiān)督中的應(yīng)用。一測多評技術(shù)(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)是當(dāng)前解決這一矛盾的重要途徑之一[5-7]。本研究以相對穩(wěn)定且對照品廉價(jià)易得的腺苷為內(nèi)標(biāo)物，考察建立一測多評法測定板藍(lán)根顆粒中尿苷、鳥苷、(R，S)-告依春的量的可行性，以期為板藍(lán)根顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，實(shí)現(xiàn)板藍(lán)根顆粒的多成分質(zhì)量評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 ：超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；分析柱為phenomen Kinetex(100×4.6 mm， 2.6 μm)；XSELECTM HSS T3(100×2.1 mm，2.5 μm)；Ecosil C18(250×4.6 mm，5 μm)。CP225D型電子分析天平(德國Sartorius公司)；BS224S型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.1.2 藥品與試劑：板藍(lán)根顆粒(批號見表5，規(guī)格為3 mg/袋)；(R，S)-告依春，腺苷對照品(批號111753-201304、110876-200204，中國食品藥品檢定研究所)；尿苷對照品(批號8-SCC-56-1，Toronto Research Chemicals Inc.)；鳥苷對照品(批號LE20O31，北京百靈威科技有限公司)；甲醇(HPLC級，Merck)，水(屈臣氏蒸餾水)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

① 混合對照品溶液的制備：取尿苷對照品、鳥苷對照品各約10 mg、(R，S)-告依春對照品約20 mg及腺苷對照品約12.5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備液；精密量取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

② 板藍(lán)根顆粒供試品溶液的制備：取板藍(lán)根顆粒，研細(xì)，取約0.67 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲5 min，放冷，再稱定重量，用5%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

③ 陰性對照溶液的制備：按板藍(lán)根顆粒制備方法，制備不含板藍(lán)根藥材的陰性樣品，并按供試品溶液配制方法制成陰性對照溶液。

1.2.2 專屬性試驗(yàn)：分別取“1.2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液和供試品溶液，按“②”和“③”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。

1.2.3 線性關(guān)系的考察：精密量取“1.2.1”項(xiàng)下①混合對照品貯備液，分別加水稀釋，搖勻，配制成尿苷濃度為2.058、4.116、10.29、15.44、20.58、30.87、51.45、102.9 μg/mL，鳥苷濃度為2.070、4.140、10.35、15.53、20.70、31.05、51.75、103.5 μg/mL，(R，S)-告依春濃度為4.086、8.172、20.43、30.65、40.86、61.29、102.2、204.3 μg/mL，腺苷濃度為2.506、5.012、12.53、18.80、25.06、37.59、62.65、125.3 μg/mL的系列對照品溶液。在“②”項(xiàng)下色譜條件下，分別進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。

1.2.4 一測多評法方法學(xué)考察

① 一測多評法原理[8-11]：在一定的范圍內(nèi)(線性范圍內(nèi))成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比，即：W=f·A。在中藥多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)時(shí)，以待測組分中某一成分(有對照品供應(yīng)者)為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子(relative correction factor， RCF)，通過校正因子計(jì)算其他組分的含量。

校正因子f=(As/Cs)/(Ar/Cr)

①

式中As為內(nèi)標(biāo)物對照品峰面積；Cs為內(nèi)標(biāo)物濃度；Ar為某待測成分對照品峰面積；Cr為某待測成分對照品濃度。

含量Cx=f×Ax/(As/Cs)

②

式中Cx為供試品中某待測成分濃度；f為內(nèi)標(biāo)物s對待測成分x的校正因子；Ax為供試品中待測成分x的峰面積；As為供試品中內(nèi)標(biāo)物s的峰面積；Cs為供試品中內(nèi)標(biāo)物s的濃度；Ax為供試品中待測成分x的峰面積。

② UPLC色譜條件：色譜柱為phenomen Kinetex (100 mm×4.6 mm， 2.6 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水，梯度洗脫(0～3 min，1%～3%甲醇；3～11 min，3%～5%甲醇；11～13 min，5%～70%甲醇；13～13.5 min，70%～1%甲醇；13.5～16 min，1%～1%甲醇)。流速為0.600 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為254%nm；進(jìn)樣量為2 μL。

③ HPLC色譜條件：色譜柱為Ecosil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水，梯度洗脫(0～3 min，3%～3%甲醇；3～20 min，3%～10%甲醇；20～40 min，10%～70%甲醇；40～50 min，70%～70%甲醇；50.01～60 min，3%～3%甲醇)。流速為0.800 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.5 穩(wěn)定性考察：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測定，計(jì)算RSD值。

1.2.6 精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批號板藍(lán)根顆粒(批號：140812-2)，按“1.2.1”項(xiàng)下平行制備供試品溶液6份，依法測定。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的板藍(lán)根顆粒(批號：140812-2)，研細(xì)，取約0.34 g，精密稱定6份，準(zhǔn)確加入含一定量的尿苷、鳥苷、(R，S)-告依春和腺苷的混合對照溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試液，依法進(jìn)樣，測定含量。

1.2.9 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較：精密稱取板藍(lán)根顆粒，按“1.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測定，用外標(biāo)法(external standard method，ESM)對4個(gè)待測成分定量測定，與一測多評法測定結(jié)果比較，驗(yàn)證一測多評法用于板藍(lán)根顆粒中4種成分測定的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn) 尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的分離度良好，供試品溶液中各待測成分峰不受其他峰干擾。

圖1 混合對照品和供試品的UPLC及HPLC圖1.尿苷；2.鳥苷；3.(R，S)-告依春；4.腺苷A:混合對照品(UPLC)；B:供試品(UPLC)； C:混合對照品(HPLC)；D:供試品(HPLC)Fig.1 Comparison of UPLC and HPLC Chromatograms of mixed reference substances and samples1.uridine;2.guanosine;3.(R，S)-goitrin;3.adenosineA: Mixed standard (UPLC) B: The test (UPLC) C: Mixed standard (HPLC) D: The test (HPLC)

2.2 線性關(guān)系考察 以對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸曲線

2.3 相對校正因子和相對保留時(shí)間測定

2.3.1 校正因子計(jì)算：在建立一測多評法對板藍(lán)根顆粒進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)時(shí)，根據(jù)斜率校正法[12-14]，以腺苷為內(nèi)標(biāo)物，將各待測組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距校正為0后，得各待測組分經(jīng)校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A=kc，由公式①得

③

式中ks為腺苷對照品經(jīng)校正后的回歸方程的系數(shù)；kr為其他待測成分對照品經(jīng)校正后的回歸方程的系數(shù)。

表2 校正因子

2.3.2 校正因子的耐用性考察[15]：本研究通過測定校正因子在不同品牌儀器、不同規(guī)格色譜柱、不同流速、不同柱溫的重現(xiàn)性，考察其耐用性。結(jié)果顯示，校正因子的耐用性良好。見表3。

表3 校正因子的耐用性試驗(yàn)

2.3.3 待測組分色譜峰的定位：腺苷通過對照品定位，其他待測組分采用相對腺苷保留時(shí)間(relative retention time；RRT值)進(jìn)行定位。使用一測多評法進(jìn)行含量測定時(shí)，通過腺苷峰的保留時(shí)間計(jì)算其他待測成分峰的RRT值，根據(jù)RRT值及光譜吸收可對尿苷、鳥苷及(R，S)-告依春準(zhǔn)確定位。本實(shí)驗(yàn)測定了相對保留值在不同品牌儀器、不同規(guī)格色譜柱、不同流速、不同柱溫的重現(xiàn)性，結(jié)果尿苷、鳥苷、(R，S)-告依春的相對保留時(shí)間分別為0.2476、0.4488、0.6363，RSD均<5%。

2.4 穩(wěn)定性考察 在室溫條件下，峰面積無明顯變化，供試品溶液中尿苷、鳥苷、(R，S)-告依春和腺苷的RSD分別為0.071%，0.17%，0.75%和0.30%，表明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn) 供試品中尿苷峰面積的RSD為0.067%，鳥苷峰面積的RSD為1.2%，(R，S)-告依春峰面積的RSD為0.076%，腺苷峰面積的RSD為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 供試品中尿苷、鳥苷、(R，S)-告依春和腺苷4種成分含量平均值分別為1.519 mg/袋，0.7775 mg/袋，1.699 mg/袋，1.220 mg/袋，RSD分別為1.5%，1.9%，0.41%，0.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 尿苷的平均回收率為99.7%(RSD=0.39%)，鳥苷的平均回收率為102.4%(RSD=0.50%)，(R，S)-告依春的平均回收率為99.7%(RSD=0.89%)，腺苷的平均回收率為101.1%(RSD=0.34%)，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.8 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較 結(jié)果表明2種方法所得含量無顯著性差異(相對偏差<2%)，說明建立的一測多評法可用于板藍(lán)根及其顆粒劑的多成分質(zhì)量評價(jià)研究。見表4。

表4 一測多評法與外標(biāo)法測定板藍(lán)根顆粒中4種成分的含量

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇 板藍(lán)根顆粒中的核苷類成分中較難得到，只有腺苷購自中國食品藥品檢定研究所，而較于(R，S)-告依春，腺苷較穩(wěn)定且廉價(jià)易得，故選其為內(nèi)標(biāo)物，能更好地體現(xiàn)QAMS法簡便、易操作、低成本的特點(diǎn)。

3.2 本文采用高分離效率、高靈敏度和高分辨率的UPLC色譜分離系統(tǒng)，10 min即可實(shí)現(xiàn)4個(gè)目標(biāo)成分的分離，方便快捷，大大縮短了分析檢測時(shí)間。同時(shí)考察了HPLC色譜體系，結(jié)果表明在不同色譜分析體系中，相對校正因子及相對保留時(shí)間的重現(xiàn)性良好，可用于方法的互相轉(zhuǎn)換。

本研究初步建立了一測多評法用于板藍(lán)根顆粒中4種成分的同步測定，與外標(biāo)法實(shí)測值無顯著性差異(相對偏差<2%))，說明建立的不同成分之間的校正因子具有較高的可信度，與外標(biāo)法相比，能較大程度地節(jié)約多成分含量測定的檢測成本，并為板藍(lán)根藥材及制劑的多指標(biāo)質(zhì)量控制模式提供新方法。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國人民共和國藥典(2010年版第二增補(bǔ)本)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2013： 132.

[2] 國家藥典委員會(huì).中國人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：191.

[3] 邱詠薇，楊懷瑾.中醫(yī)藥的特色——整體觀[J].河北中醫(yī)，2004，26(12)：945.

[4] Qiu J.Traditional medicine: a culture in the balance[J].Nature,2007,448:126-128.

[5] 王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價(jià)模式方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2006(23)：1925-1928.

[6] 陸兔林，石上梅，蔡寶昌，等.基于一測多評的中藥多成分定量研究進(jìn)展[J].中草藥，2012，43(12)：2525-2529.

[7] 文乾映，龍芳，楊華，等.中藥質(zhì)量控制中一測多評法的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥房，2014，25(23)：2185-2188.

[8] Zhu JJ,Wang ZM, Ma XY, et al.A quantitative method for simultaneous determination of four anthraquinones with one marker in Rhei Radix et Rhizoma [J].Chin Herb Med, 2012, 4(2): 157-163.

[9] 王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測多評法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011(6)： 657-658.

[10] 逄瑜，孫磊，金紅宇，等.替代對照品法在中藥多指標(biāo)含量測定中的應(yīng)用與技術(shù)要求探討[J].藥物分析雜志，2013，33(1)：169-177.

[11] 高慧敏，宋宗華，王智民，等.適合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量評價(jià)模式-QAMS研究概述[J].中國中藥雜志，2012，37(4)：405-416.

[12] 何兵，楊世艷，張燕.一測多評中待測成分校正和定位的新方法研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2012(12)：1653-1659.

[13] Zhu JJ,Wang ZM,Kuang YH,et al.A quantitative method using one marker for simulataneous assay of ginsenosides in Panax ginseng and P.notoginseng [J].Acta Pharm Sin,2008,43:1211-1216.

[14] 趙一懿，郭洪祝，陳有根，等.中藥多組分含量測定中相對校正因子計(jì)算方法的比較與建議[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2014，15(4)：245-251.

[15] 馮偉紅，楊菲，王智民，等.不同色譜條件對QAMS相對校正因子及相對保留值影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].2012，37(21)：3264-3267.

(編校：譚玲)

Quantitative analysis of 4 components in Isatidis Radix granules using single marker by QAMS

CHI Xu-ying, CUI Yue-xin, ZHANG Shu, DENG HongΔ

(Institute of Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS) for determination of four components (adenosine, uridine, guanosine, (R,S)-goitrin) in Isatidis Radix granules.MethodThe QAMS for Isatidis Radix granules was established and validated and adenosine was selected as the internal reference substance.The relative correction factor(RCF)of other three components were calculated.The contents of four components were determined by both external standard method and QAMS.The QAMS method was validated through comparison of the results obtained by the two different methods.ResultsThe RCFs of uridine, guanosine and (R, S)-goitrin all showed good reproducibility within certain ranges.For Isatidis Radix granules, uridine, guanosine and (R, S)-goitrin, there was no significant difference between the quantitative results of the two methods.ConclusionsThe QAMS method is simple, feasible and credible to be used for comprehensive quality control of Isatidis Radix granules.

QAMS; adenosine; uridine; guanosine; (R, S)-goitrin; UPLC; HPLC

池絮影，女，碩士在讀，研究方向：中藥制劑研究與開發(fā)，E-mail：cxysheen@163.com；鄧紅，通信作者，女，本科，教授級高級工程師，研究方向：中藥新劑型和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：dengh361@sohu.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)10-0137-04