李崴嵬，魏琦玲，楊金暉，佟靜，崔秋萍

(河北省唐山工人醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

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OLK患者與OSCC癌患者的原癌基因蛋白差異及相關(guān)性研究

李崴嵬，魏琦玲，楊金暉，佟靜，崔秋萍

(河北省唐山工人醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

目的 探討原癌基因蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)及口腔白斑中(oral leukoplakia，OLK)的意義。方法 選取唐山工人醫(yī)院口腔科已確診為口腔白斑的患者40例作為OLK組，確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌患者40例作為OSCC組，同時(shí)期體檢正常志愿者40例作為對(duì)照組，取病變組織、正?？谇徽衬ぷ鳛闃颖?，研磨后取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測3組研究對(duì)象樣本中MDM2蛋白，p53蛋白，Ki-67蛋白的含量情況，并分析3者的相關(guān)性。結(jié)果 3組間MDM2、p53表達(dá)水平比較均為OSCC組>OLK組>對(duì)照組；3組間Ki-67表達(dá)水平比較，OSCC組>OLK組>對(duì)照組(P<0.05)；MDM2，p53，Ki-67在口腔白斑及口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，在正常粘膜中表達(dá)無相關(guān)。結(jié)論 口腔白斑發(fā)展成為口腔鱗狀細(xì)胞癌與MDM2，p53，Ki-67的高表達(dá)有關(guān)，MDM2、p53、Ki-67 3者之間呈正相關(guān)。

口腔白斑；口腔鱗狀細(xì)胞癌；MDM2；p53；Ki-67

口腔白斑(oral leukoplakia，OLK)是指由于代謝紊亂引起口腔黏膜上皮過度角化形成的白色斑塊[1]，屬于癌前病變，有3%～5%可發(fā)展成為鱗狀細(xì)胞癌?？谇击[狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔科常見的惡性腫瘤，目前，占我國口腔惡性腫瘤的90%以上，占全身腫瘤的3%～5%,而且其惡性程度高，患者預(yù)后差，5年生存率僅為30%～40%[2]，因此，早期診斷、治療，防止病情變化成為目前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)[3]，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失衡有關(guān)，兩者為相互制約關(guān)系，在外界或遺傳因素作用下，原癌基因過度表達(dá)或抑癌基因表達(dá)不足，均可導(dǎo)致細(xì)胞周期異常，細(xì)胞過度增殖發(fā)生癌變。資料顯示[4-5]，MDM2和p53為相關(guān)聯(lián)的抑癌基因，在頭部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤進(jìn)展過程中均有異常表達(dá)，Ki-67的表達(dá)與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，在喉癌、乳腺癌等惡性腫瘤中起到主要作用[6]。目前，關(guān)于口腔鱗狀細(xì)胞癌中MDM2，p53，Ki-67表達(dá)的相關(guān)研究較少，本研究通過檢測觀察MDM2，p53，Ki-67在口腔鱗狀細(xì)胞癌及口腔白斑中的表達(dá)水平及變化，探討其相關(guān)性及意義，為口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集唐山工人醫(yī)院口腔科2013年1月～2015年4月的確診為口腔白斑的患者40例作為OLK組，其中男性26例，女性14例，年齡20～75歲，平均年齡(50.23±7.88)歲；確診為鱗狀細(xì)胞癌的患者40例作為OSCC組，其中男性23例，女性17例，年齡22～70歲，平均年齡(51.43±7.69)歲； 納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為口腔白斑、口腔鱗狀細(xì)胞癌；排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前有化療、放療病史；②合并其他惡性腫瘤；③惡液質(zhì)；④存在嚴(yán)重的內(nèi)科疾?。虎莶v資料不完整。另外選取同時(shí)期體檢正常的志愿者40例作為對(duì)照組，其中男性25例，女性15例，年齡22～74歲，平均年齡(52.12±7.75)歲。3組研究對(duì)象在性別組成、年齡等一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 樣本制作:OLK組及OSCC組均于術(shù)中取病變組織作為樣本，對(duì)照組取正常的口腔黏膜組織作為樣本。所有組織均取適量置入5 mL EP管中，加入裂解液、MDM2，p53，Ki-67蛋白酶抑制劑，采用液氮研磨，冰上孵育40 min后，離心機(jī)速度13000 r/min，離心40 min，取上清液。

1.2.2 指標(biāo)檢測:選用人MDM2 p53結(jié)合蛋白同源物(MDM2)檢測試劑盒(上海滬震生物科技有限公司)、人 p53Elisa試劑盒、人Ki-67 ELISA試劑盒(上海常斤生物科技有限公司)，利用酶聯(lián)免疫檢測儀(JK-MR-5031)，通過酶聯(lián)免疫吸附法測定各組研究對(duì)象組織上清液中MDM2蛋白、p53蛋白、Ki-67蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 3組間MDM2、p53表達(dá)水平比較 研究顯示，3組間MDM2、p53表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1018.93，F(xiàn)=984.87，P<0.05)，OSCC組>OLK組>對(duì)照組，見表1。

*P<0.05，與OLK組相比，compared with OLK group

2.2 3組間Ki-67表達(dá)水平比較 本研究顯示，3組間Ki-67表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1173.58，P<0.05)，OSCC組>OLK組>對(duì)照組，見表2。

表2 3組間Ki-67表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of Ki-67 among three ±s)

*P<0.05，與OLK組相比，compared with OLK group

2.3 MDM2、p53與Ki-67在OLK組中表達(dá)的相關(guān)性 本研究中，MDM2和p53、p53和Ki-67、MDM2和Ki-67在OLK組中的表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表3。

表3 MDM2、p53與Ki-67在OLK組中表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 Relevance of MDM2，p53 and Ki-67 in OLK group

2.4 MDM2、p53與Ki-67在OSCC組中表達(dá)的相關(guān)性 本研究中，MDM2和p53、p53和Ki-67、MDM2和Ki-67在OSCC組中的表達(dá)，均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 MDM2、p53與Ki-67在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性Tab.4 Relevance of MDM2，p53 and Ki-67 in OSCC group

2.5 MDM2、p53與Ki-67在對(duì)照組表達(dá)的相關(guān)性 本研究中，MDM2和p53、p53和Ki-67、MDM2和Ki-67在正常粘膜中的表達(dá)無相關(guān)性。見表5。

表5 MDM2、p53與Ki-67在對(duì)照組表達(dá)的相關(guān)性Tab.5 Relevance of MDM2，p53 and Ki-67 in control group

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率占面部惡性腫瘤的第1位，常常由口腔白斑發(fā)展而來，尤其好伐與男性吸煙者，給患者帶來較大的痛苦[7]。口腔鱗狀細(xì)胞癌具有早期轉(zhuǎn)移、侵襲力強(qiáng)、預(yù)后差的特點(diǎn)，一旦發(fā)生，則沒有良好的控制手段，目前，學(xué)者多將研究的重點(diǎn)放在及早診斷，減緩其發(fā)展過程方面[8]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)從癌前病變進(jìn)展為癌癥與基因調(diào)控有關(guān)，原癌基因被激活，抑癌基因變異是癌癥發(fā)生的主要原因[9]。資料顯示[10]，p53是一種位于17號(hào)染色體的抑癌基因，具有抑制細(xì)胞生長及促凋亡作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其出現(xiàn)突變與癌癥的發(fā)生關(guān)系密切；MDM2[11]與p53基因具有關(guān)聯(lián)性，能夠調(diào)節(jié)p53基因表達(dá)，同時(shí)具有致癌作用與抑癌作用；Ki-67[12]則是半衰期較短的核抗原，出現(xiàn)在細(xì)胞周期中，可以反應(yīng)細(xì)胞增殖活性，近年來作為癌癥增殖活性的指標(biāo)進(jìn)行檢測。在本實(shí)驗(yàn)中，通過檢測觀察MDM2，p53，Ki-67在口腔鱗狀細(xì)胞癌及口腔白斑中的表達(dá)水平及變化，探討其與口腔鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性及意義，明確其對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響，為口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷提供依據(jù)。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組間MDM2、p53表達(dá)水平比較均為OSCC組>OLK組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MDM2、p53的強(qiáng)表達(dá)在OSCC發(fā)展中起到重要作用。曾有研究報(bào)道[13]，p53基因位于17號(hào)染色體，其外顯子N端由aa殘基組成，能夠調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成過程，而MDM2可以通過aa殘基與p53進(jìn)行結(jié)合，抑制p53的抑癌作用，促進(jìn)癌細(xì)胞繁殖生長，加速口腔白斑發(fā)展為口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)程。

本研究顯示，3組間Ki-67表達(dá)水平比較，OSCC組>OLK組>對(duì)照組(P<0.05)，提示OSCC具有更高的增殖活性。Ki-67是細(xì)胞增殖抗原，與細(xì)胞周期關(guān)系密切，調(diào)控著細(xì)胞的增殖活性，與病變惡性程度相關(guān)，有報(bào)道稱[14]，Ki-67與口腔白斑的浸潤和上皮角化增生關(guān)系密切，與本研究結(jié)果一致。

相關(guān)性研究表明，在口腔白斑與口腔鱗狀細(xì)胞癌中，MDM2，p53，Ki-67 表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，在正常粘膜中表達(dá)無明顯相關(guān)。資料顯示[15-16]，DNA受損后，能夠使p53表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步激活MDM2，2者結(jié)合形成MDM2-p53化合物，阻斷細(xì)胞周期；p53表達(dá)降低時(shí)，MDM2表達(dá)隨之減少，p53的抑癌作用可得到恢復(fù)。MDM2與p53作用的最終階段都是細(xì)胞，Ki-67主宰著細(xì)胞周期的變化，研究顯示[17]，MDM2和突變的p53能夠誘導(dǎo)Ki-67轉(zhuǎn)化，使得Ki-67水平上調(diào)，而p53能夠在Ki-67的幫助下抑制信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與本研究觀點(diǎn)相同。

本研究通過對(duì)口腔白斑與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者M(jìn)DM2，p53，Ki-67的表達(dá)情況及相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)口腔白斑發(fā)展成為口腔鱗狀細(xì)胞癌與MDM2，p53，Ki-67的高表達(dá)有關(guān)，MDM2、p53、Ki-67 3者之間呈正相關(guān)關(guān)系，為口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷提供了方向。在下一步研究中，將對(duì)不同分期的口腔鱗狀細(xì)胞癌MDM2，p53，Ki-67表達(dá)情況進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討3者與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的關(guān)系。

[1] Bánóczy J.Oral leukoplakia[M].Springer Science & Business Media, 2012.

[2] 鄭家偉, 李金忠, 鐘來平, 等.口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J].中國口腔頜面外科, 2007, 5(2): 83-90.

[3] 王璇, 黃紹輝, 於麗喬, 等.DEK 原癌基因與口腔鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系[J].上?？谇会t(yī)學(xué), 2014, 23(1): 75-79.

[4] 趙振懷, 任曉勇, 趙俊杰.MDM2, p53, SPIN1mRNA 在口腔癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 40(10): 1293-1294.

[5] 項(xiàng)芳芳, 毛高平.大腸癌與抑癌基因相關(guān)性的研究現(xiàn)狀[J].世界華人消化雜志, 2012, 20(5): 394-398.

[6] 水若鴻, 楊文濤.乳腺癌 Ki-67 陽性指數(shù)的檢測和評(píng)估[J].中華病理學(xué)雜志, 2013, 42(6): 420-423.

[7] 高嶺, 郅克謙.microRNA 與口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究進(jìn)展[J].口腔醫(yī)學(xué)研究, 2013, 29(6): 586-589.

[8] 馬開宇, 馬開陽, 黎明, 等.基于形態(tài)學(xué)特征提取的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷中的應(yīng)用[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 33(1): 29-32.

[9] 李茵, 溫穎, 周進(jìn)學(xué), 等.口腔鱗狀細(xì)胞癌中 EGR3 基因表達(dá)缺失對(duì)細(xì)胞行為的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 93(32): 2549-2552.

[10] 韓冰, 殷沛.Bcl-2 及 p53 在口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)的研究[J].中國實(shí)用醫(yī)刊, 2013, 39(24): 24-26.

[11] Fornari F, Milazzo M, Giovannini C, et al.271 MIR-221/MDM2/p53 control loop sensitizes hepatocellular carcinoma cell to anti-cancer treatments[J].J Hepatol, 2012, 56: S113.

[12] 徐亞娟, 張艷秋, 金志巍, 等.中老年頰黏膜癌組織中 Ki-67 蛋白的表達(dá)及臨床意義[J].中國老年學(xué)雜志, 2014, 34(3): 630-631.

[13] 何保昌, 陳法, 劉芳萍, 等.福建地區(qū)口腔癌患者 p53 基因 72 密碼子多態(tài)性與口腔癌易感性的研究[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 48(6): 372-377.

[14] Yu Y H,Morales J, Feng L, et al.CD147 and Ki-67 overexpression confers poor prognosis in squamous cell carcinoma of oral tongue: A tissue microarray study[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2015, 119(5): 553-565.

[15] 聞梅娟.MDM2, p53, Ki-67 在口腔鱗狀細(xì)胞癌及口腔白斑中的表達(dá)及意義[D].蘇州大學(xué), 2013.

[16] Mohtasham N, Babakoohi S, Shiva A, et al.Immunohistochemical study of p53, Ki-67, MMP-2 and MMP-9 expression at invasive front of squamous cell and verrucous carcinoma in oral cavity[J].Pathol Res Pract, 2013, 209(2): 110-114.

[17] Guo Z, Li B, Dzubiella J, et al.Heterogeneous Hydration of p53/MDM2 Complex[J].J Chem Theory Comput, 2014, 10(3): 1302-1313.

(編校：譚玲)

Correlation and differences in proto oncogene protein of patients with OLK and OSCC

LI Wei-wei, WEI Qi-ling, YANG Jin-hui, TONG Jing, CUI Qiu-ping

(Department of Stomatology, Tangshan Worker Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo analyse the significance of proto oncogene protein in oral squamous cell carcinoma and oral leukoplakia.Methods40 patients who were diagnosed with oral leukoplakia (OLK)，40 patients who were diagnosed with oral squamous cell carcinoma(OSCC)，and at the same time, 40 healthy volunteers as control group were collected.the lesions and normal oral mucosa were taken as samples, left supernatant after grinding, MDM2 protein, p53 protein and Ki-67 protein were detected by ELISA in three groups,and analyse the correlation between three groups.ResultsAmong three groups,MDM2, p53 expression:OSCC group>OLK group>control group (P<0.05).Ki-67 expression level among three groups, OSCC group>OLK group>control group (P<0.05).MDM2, p53, Ki-67 expression had a positive correlation in OSCC group and OLK group (P<0.05), but there was no obvious correlation in control group.ConclusionWhen oral leukoplakia developes into oral squamous cell carcinoma, MDM2, p53, Ki-67 shows high expression, and there is a positive correlation between MDM2, p53, Ki-67.

oral leukoplakia; oral squamous cell carcinoma; MDM2; p53; Ki-67

2012年唐山市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(121302119a)

李崴嵬，男，碩士,主治醫(yī)師,研究方向：口腔修復(fù)，E-mail: kqlwwei@sina.com。

R739.8

A

1005-1678(2015)06-0065-03