李曉佳，趙迎杰，孫廣臣

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，廣西 桂林 541000；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院 骨科，山西 太原 030001；3.桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 541000)

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甲氨蝶呤聯(lián)合復(fù)方風(fēng)濕寧對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞Treg/Th17免疫平衡的影響

李曉佳1，趙迎杰2，孫廣臣3Δ

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，廣西 桂林 541000；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院 骨科，山西 太原 030001；3.桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 541000)

目的 研究復(fù)方風(fēng)濕寧(compound Fengshining，F(xiàn)SN)聯(lián)合甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)Treg/Th17免疫平衡的影響。方法 體外培養(yǎng)RA FLS，分別用FSN和MTX處理，分為FSN 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mL FSN)，MTX 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mL MTX)，聯(lián)合1、2、3組(0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX、0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX、1.0 mg/mL FSN+1.0 mg/mL MTX)，并以未加藥的培養(yǎng)基作為對照組，共10組。采用MTT法檢測各組RA FLS增殖情況，Real-time PCR法檢測各組IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt mRNA表達(dá)，ELISA檢測各組IL-10、IL-17、IL-22水平。結(jié)果 FSN各組、MTX各組和聯(lián)合各組FLS增殖OD值均低于對照組，尤以聯(lián)合2組降低最顯著(P<0.05)。FSN2組、MTX2組和聯(lián)合2組IL-10 mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)均高于對照組，ROR-γt mRNA表達(dá)低于對照組，尤以聯(lián)合2組變化顯著(P<0.05)。FSN2組和聯(lián)合2組IL-17mRNA表達(dá)均低于對照組，以聯(lián)合2組降低顯著(P<0.05)。FSN2組、MTX2組和聯(lián)合2組IL-10水平均高于對照組、IL-22水平均低于對照組，以聯(lián)合2組變化明顯(P<0.05)。聯(lián)合2組IL-17水平低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 FSN聯(lián)合MTX能夠抑制RA FLS增殖，升高IL-10、Foxp3表達(dá)，降低IL-17、ROR-γt表達(dá)，調(diào)節(jié)Treg/Th17免疫平衡，以0.1 mg/mLFSN+0.1 mg/mL MTX的效應(yīng)最為明顯。

甲氨蝶呤；復(fù)方風(fēng)濕寧；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎及對稱性關(guān)節(jié)骨、軟骨破壞為主要特征。多數(shù)患者發(fā)病時(shí)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)存在病理性增生。RA病因尚不清楚，但多項(xiàng)研究表明它的發(fā)生與免疫異常有關(guān)，CD4+T細(xì)胞免疫功能紊亂是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)和輔助性T淋巴細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是近年來發(fā)現(xiàn)的新型T細(xì)胞亞群，在分化、發(fā)育以及功能發(fā)揮的過程中受到Th1型、Th2型效應(yīng)細(xì)胞以及自身分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，參與自身免疫病、感染、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展[2]。已有研究證實(shí)[3]，在RA中存在一個(gè)重要平衡，即Treg/Th17 平衡，平衡一旦被破壞，將引發(fā)疾病，維持Treg/Th17的平衡對于RA 的治療非常重要。通過對Treg和Th17分化發(fā)育和功能發(fā)揮過程中關(guān)鍵因子進(jìn)行增強(qiáng)或抑制，可以調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡關(guān)系，用于RA預(yù)防和治療。

復(fù)方風(fēng)濕寧和甲氨蝶呤均為臨床上治療RA常用藥物。其中FSN有效成分從七葉蓮、寬筋藤、兩面針等中藥提取，具有祛風(fēng)、除濕、止痛的作用，同時(shí)還能發(fā)揮活血、散瘀、解毒功能[4]；MTX是一種葉酸還原酶抑制劑，能夠抑制二氫葉酸還原為有生理活性的四氫葉酸，進(jìn)而抑制DNA的生物合成，可有效抑制自身免疫反應(yīng)過度激活[5]。FSN和MTX均為臨床上治療RA的核心藥物，但其抗RA的機(jī)制是否與調(diào)節(jié)Treg/Th17免疫平衡有關(guān)目前尚未明確。為此，本課題將探討FSN聯(lián)合MTX對RA FLS Treg/Th17免疫平衡的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人關(guān)節(jié)滑膜組織取自桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治并行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者，采集后保存于無菌含雙抗Hank’s液中，并于30 min之內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。RA患者符合中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診治指南》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)，告知患者研究事項(xiàng)，且患者均簽署知情同意書。收住院后完善術(shù)前檢查，進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑：低溫高速離心機(jī)(TGL20M，麥尚儀器)；酶標(biāo)分析儀(318C，上海精科)；梯度 PCR 擴(kuò)增儀(600，Takara)。

甲氨蝶呤注射劑(齊魯制藥，國藥準(zhǔn)字H20045628)、復(fù)方風(fēng)濕寧注射劑(廣東羅浮山國藥，國藥準(zhǔn)字Z20027146)，溶于無菌生理鹽水，調(diào)整初濃度均為10 mg/mL，臨用前稀釋成所需要的濃度。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶及I型膠原蛋白酶(GIBCO)；β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt引物(上海玉博生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(上海生工)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；IL-10、IL-17、IL-22 ELISA試劑盒(CUSABIO公司)。

1.2.2 RA FLS細(xì)胞培養(yǎng)：滑膜組織在無菌條件下PBS液沖洗3次，剪取滑膜時(shí)剔除連帶血管、脂肪及軟組織，取出滑膜后用PBS液沖洗3次。將滑膜剪到最小為止，1000 r/min離心5 min，棄上清，用4 mg/mL的I型膠原蛋白酶消化120 min(37 ℃、5% CO2恒溫孵育)后1000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸，再次1000 r/min離心10 min，棄上清，最終懸浮于含青-鏈霉素(100 U/mL)及10%FBS DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2恒溫孵育。72 h后更換培養(yǎng)液，第一次換液時(shí)采取半量換液法，此后隔天換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)原代細(xì)胞長滿瓶底時(shí)，以胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。并留取3～4代穩(wěn)定細(xì)胞用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組及干預(yù)：取對數(shù)生長期的RA FLS，用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，按照不同藥物處理方法設(shè)置10個(gè)分組：FSN 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mLFSN)，MTX 1、2、3組(0.01、0.1、1.0 mg/mL MTX)，聯(lián)合1、2、3組(0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX、0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX、1.0 mg/mLFSN+1.0 mg/mL MTX)，并以未加藥培養(yǎng)基作為對照組。

1.2.4 FLS增殖檢測方法：采用MTT法測定細(xì)胞增殖能力，方法如下：給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，待培養(yǎng)基顏色變?yōu)樯钏{(lán)色后吸除液體，加入150 μL DMSO溶液，在搖床上快速震蕩10 min使細(xì)胞充分裂解，而后在酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：IR(%)=(1-A給藥/A對照)×100%，6個(gè)復(fù)孔均值作為一組結(jié)果。

1.2.5 mRNA含量檢測方法：采用RT-PCR方法檢測，取對數(shù)生長期的RA FLS，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，接種于24孔板，每孔500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基加入含藥培養(yǎng)基進(jìn)行藥物干預(yù)，據(jù)1.2.3結(jié)果選取聯(lián)合2組，F(xiàn)SN2組，MTX2組及不加藥培養(yǎng)基作為對照組，共4組。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，5000 r/min 4 ℃離心5 min吸出上清液(ELISA備用)，加入Trizol，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取RNA，并采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定其分子質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作)，檢測mRNA含量時(shí)，采用RT-PCR試劑盒分別擴(kuò)增β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt，PCR循環(huán)擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s；β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt分別58 ℃、55 ℃、55 ℃、57 ℃、56 ℃1 min；72 ℃ 1 min)34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min,4 ℃ 30 min。

所用引物序列如下：

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primers sequences

取PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線下識別電泳條帶，用凝膠成像分析軟件分析，以特異性產(chǎn)物擴(kuò)增條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值之比為半定量數(shù)據(jù)，分析4組基因表達(dá)水平，計(jì)算目的基因mRNA的相對含量，3個(gè)均值作為一組結(jié)果。

1.2.6 IL-10、IL-17、IL-22水平：以3000 r/min離心20 min取上清液(取1.2.5中提取RNA前吸出的上清液)，用ELISA法對IL-10、IL-17、IL-22水平進(jìn)行檢測,嚴(yán)格按照說明書操作，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-10、IL-17、IL-22濃度，8個(gè)復(fù)孔均值作為一組結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測OD值及抑制率比較 MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)NS各組、MTX各組和聯(lián)合各組FLS增殖OD值均降低(P<0.05)，但以聯(lián)合2組增殖OD值降低最明顯(P<0.05)，抑制率最高。見表2。

表2 各組纖維樣滑膜細(xì)胞增殖OD值與抑制率比較(n=6)Tab.2 Comparison of OD values of FLS proliferation and inhibition rate(n=6)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與聯(lián)合2組比較，compared with combination group 2

2.2 IL-10、IL-17、Foxp3，ROR-γt的mRNA含量 各組RT-PCR凝膠電泳圖見圖1。與對照組比較，聯(lián)合2組、MTX 2組、FSN 2組IL-10、Foxp3 mRNA含量明顯升高(P<0.05)；聯(lián)合2組、FSN 2組IL-17、ROR-γt mRNA含量明顯降低(P<0.05)；MTX 2組ROR-γt mRNA 含量明顯降低(P<0.05)。與聯(lián)合2組比較，MTX 2組、FSN 2組IL-10、Foxp3 mRNA含量明顯降低(P<0.05)；IL-17、ROR-γt mRNA含量明顯升高(P<0.05)。見表3。

圖1 各組RT-PCR凝膠電泳圖1-2：對照組，3-4：聯(lián)合2組，5-6：MTX2組，7-8：FSN2組Fig.1 RT-PCR gel electrophoresis figure of each group1-2：control group，3-4：combination group 2，5-6：MTX group 2，7-8：FSN group 2

組別IL-10IL-17Foxp3ROR-γt對照組0.12±0.030.89±0.020.13±0.011.09±0.04聯(lián)合2組0.48±0.06*0.35±0.01*0.44±0.03*0.36±0.02*MTX2組0.29±0.05*#0.92±0.090.28±0.02*#0.90±0.04*#FSN2組0.28±0.02*#0.65±0.03*#0.27±0.05*#0.69±0.07*#

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與聯(lián)合2組比較，compared with combination group 2

2.3 IL-10、IL-17、IL-22水平 與對照組相比，聯(lián)合2組、MTX 2組、FSN 2組IL-10水平增高(P<0.05)；與聯(lián)合2組相比，MTX 2組、FSN 2組IL-10水平降低(P<0.05)。與對照組相比，聯(lián)合2組IL-17水平降低(P<0.05)。與對照組相比，聯(lián)合2組、MTX 2組、FSN 2組IL-22水平降低(P<0.05)；與聯(lián)合2組相比，MTX 2組、FSN 2組IL-22水平增高(P<0.05)。見表4。

組別IL-10IL-17 IL-22對照組35.50±3.93149.91±26.62188.13±13.67聯(lián)合2組77.25±7.21*107.72±21.86*109.53±12.69*MTX2組62.52±4.90*#129.85±19.98147.98±5.86*#FSN2組65.12±8.10*#128.60±20.96154.51±9.70*#

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與聯(lián)合2組比較，compared with combination group 2

3 討論

FLS過度增生和局部炎性反應(yīng)是RA的兩大臨床病理特征，研究表明[7]，RA發(fā)病過程中，F(xiàn)LS可由正常水平的1～3層細(xì)胞增至15 層以上；且增生的FLS具有類似腫瘤細(xì)胞的高侵襲性，凋亡反應(yīng)受到抑制，持續(xù)分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶，破壞軟骨組織。因此治療RA最重要的是要保護(hù)滑膜。本次實(shí)驗(yàn)以RA FLS為研究對象，探討FSN聯(lián)合MTX是否可抑制骨破壞及其可能機(jī)制。并采用MTT法分析了滑膜細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示：FSN和MTX治療后均能抑制FLS的增殖(P<0.05)，但以2者聯(lián)合使用時(shí)抑制率最為明顯，且以0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX抑制率最高。

輔助性T細(xì)胞亞群Th1和Th2是最先被認(rèn)識的T細(xì)胞亞群，Th1/Th2比例失衡是導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。Th1細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子具有促炎、加強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用，而Th2型細(xì)胞因子則能抑制Th1細(xì)胞的功能。RA患者多存在Th2細(xì)胞功能減弱、無法有效抑制自身免疫反應(yīng)的情況[9]。Treg 和Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞型，已有文獻(xiàn)報(bào)道[13]表明，Treg和Th17細(xì)胞在RA的致病過程中發(fā)揮著極為重要的作用，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡已逐漸成為治療RA的新途徑，進(jìn)一步推進(jìn)了對RA 發(fā)病機(jī)制的研究階段，成為治療RA研究的又一熱點(diǎn)。

Treg是一群包含了CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞的一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，其中以CD4+CD25+Treg最為重要[10]。CD4+CD25+Treg能夠抑制抗原遞呈細(xì)胞的功能、降低致炎因子分泌、維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能[11]。Foxp3是Treg細(xì)胞表面最可靠的標(biāo)志物，在絕大多數(shù)CD4+CD25+Treg細(xì)胞中均有表達(dá)[12]，F(xiàn)oxp3發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，能夠促進(jìn)免疫抑制因子IL-10等的分泌，具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)以及維持自身免疫耐受的功能。Th17細(xì)胞是一群能夠分泌白細(xì)胞介素-17的CD4+T細(xì)胞亞群，不僅可以大量分泌IL-17，還能產(chǎn)生IL-21、IL-22，具有極強(qiáng)的促炎作用，能夠促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子、抑制軟骨基質(zhì)合成、增強(qiáng)破骨細(xì)胞的功能，最終造成骨質(zhì)破壞[13]。在RA患者體內(nèi)，ROR-γt的轉(zhuǎn)錄因子功能增強(qiáng)、IL-17含量增多，且Foxp3的轉(zhuǎn)錄因子功能減弱[14]。然而，目前有關(guān)FSN聯(lián)合MTX治療RA與Treg/Th17之間的關(guān)系還未見報(bào)道，為此本實(shí)驗(yàn)采用FSN和MTX聯(lián)合干預(yù)RA FLS后，Real-time PCR法檢測各組細(xì)胞IL-10及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、IL-17及其轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt的mRNA表達(dá)，并用ELISA法檢測各組IL-10、IL-17水平。結(jié)果顯示，MTX與FSN聯(lián)合用藥可以顯著增加IL-10、Foxp3表達(dá)并降低IL-17、ROR-γt的表達(dá)，達(dá)到調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡的目的。

Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生的另一種炎癥因子IL-22，在炎癥免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中介導(dǎo)了重要環(huán)節(jié)。IL-22能促進(jìn)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及趨化因子的分泌，是RA發(fā)病中一種重要的炎性因子[15]。新近研究顯示，RA患者的滑膜液中存在大量的IL-22，IL-22缺陷的CIA模型鼠，關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和炎癥嚴(yán)重程度降低[16]，且IL-22能促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞增殖，提示IL-22在RA中的致病性[17]。IL-22高表達(dá)還可促進(jìn)纖維細(xì)胞膜表面RANKL增加，加速破骨細(xì)胞生成。故IL-22可作為RA早期骨侵蝕的血清學(xué)標(biāo)志，預(yù)測發(fā)病程度。本研究在前期實(shí)驗(yàn)中對IL-22做過重點(diǎn)考察，發(fā)現(xiàn)MTX和FSN均能降低RAFLS IL-22 mRNA表達(dá)水平，且聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果最佳。本次實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測各組IL-22水平發(fā)現(xiàn)，2者聯(lián)合用藥顯著降低IL-22水平，這與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)提示，F(xiàn)SN聯(lián)合MTX能夠抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖，并可能通過增高IL-10、Foxp3提高Treg，降低IL-17、ROR-γt及IL-22的表達(dá)降低Th17，調(diào)節(jié)Treg/Th17免疫平衡，從而抑制破骨細(xì)胞形成，防止骨質(zhì)破壞，控制RA病情，但是本實(shí)驗(yàn)由于樣本量較小并且尚未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對照，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(編校：王儼儼)

Effect of compound Fengshining combined with methotrexate on Treg/Th17 immune balance in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

LI Xiao-jia1, ZHAO Ying-jie2, SUN Guang-chen3Δ

(1.Department of Immunology, Guilin Medical University, Guilin 541000, China; 2.Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 3.College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541000, China)

ObjectiveTo study the effect of compound Fengshining (FSN) combined with methotrexate (MTX) on Treg/Th17 immune balance in fibroblast-like synoviocytes (FLS) with rheumatoid arthritis (RA).MethodsRA FLS were cultured in vitro and treated with FSN and MTX.They were divided into ten groups: FSN 1, 2, 3 groups (0.01, 0.1, 1.0 mg/mL FSN), MTX 1,2,3 groups (0.01, 0.1, 1.0 mg/mL MTX), combination 1,2,3 groups (0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX, 0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX, 1.0 mg/mL FSN+1.0 mg/mL MTX) and the medium without drugs as control group.FLS proliferation was detected by MTT method. IL-10,IL-17, Foxp3, ROR-γt mRNA were detected by real-time PCR method. IL-10, IL-17，IL-22 levels were detected by ELISA method.ResultsOD values of FLS proliferation in FSN groups, MTX groups and combination groups were significantly lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-10 mRNA, Foxp3 mRNA in FSN 2 group, MTX 2 group and combination 2 group were higher and ROR-γt mRNA were lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-17 mRNA in FSN 2 group and combination 2 group were lower than those in control group, especially the combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-10 level in FSN 2 group, MTX 2 group and combination 2 group were higher and IL-22 levels were lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-17 level in combination 2 group were lower than those in control group (P<0.05).ConclusionCompound Fengshining combined with methotrexate could inhibit RA FLS proliferation, elevate IL-10 and Foxp3 expression, reduce the IL-17 and ROR-γt expression and adjust Treg/Th17 immune balance; effect of 0.1 mg/mL FSN +0.1 mg/mL MTX is the most obvious.

methotrexate; compound Fengshining; rheumatoid arthritis; regulatory T cells

國家自然科學(xué)基金(81260462，81460474)

李曉佳，女，碩士，研究方向：免疫藥理，E-mail：417517652@qq.com；孫廣臣，通訊作者，男，博士，研究員，研究方向：免疫藥理，E-mail：sungc2004@aliyun.com。

R593.2

A

1005-1678(2015)06-0006-04