孔青, 遲晨, 單世華, 李琦玉

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島266003;2.山東省花生研究所,山東 青島 266100)

花生中巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素合成相關(guān)基因的抑制

孔青1*, 遲晨1, 單世華2, 李琦玉1

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島266003;2.山東省花生研究所,山東 青島 266100)

分別在UF 715133-1和Jinhua 1012花生仁上接種黃曲霉和巨大芽孢桿菌,高壓液相色譜法測(cè)定花生中黃曲霉毒素含量,借助生物芯片和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)測(cè)定巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素生物合成途徑基因表達(dá)的影響,并用基因本體(gene ontology, GO)功能分類(lèi)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路方法對(duì)基因進(jìn)行分類(lèi)分析。在實(shí)驗(yàn)組Jinhua 1012 和UF 715133-1中,黃曲霉毒素B1的含量降低了85%以上,一些編碼蛋白質(zhì)酶的基因顯著下調(diào),如短鏈脫氫酶、非核糖體多肽合成酶等。結(jié)果表明,從海洋中分離出的巨大芽孢桿菌可顯著抑制黃曲霉毒素在花生上的合成,黃曲霉中多種基因的表達(dá)受到抑制,但這些基因在黃曲霉毒素生物合成中的作用并未闡明,其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

巨大芽孢桿菌; 黃曲霉毒素; 抑制; 基因表達(dá); 花生

花生和玉米是最容易受黃曲霉毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品[4]。為了減少人類(lèi)接觸黃曲霉毒素的可能,已經(jīng)采取多種措施來(lái)控制黃曲霉的生長(zhǎng)、抑制黃曲霉毒素的形成[5]。物理方法和化學(xué)降解的方法由于處理不完全、成本比較高等原因不被大眾接受[6]。而采用拮抗微生物或天然提取物的生物方法是一種高效率、低危險(xiǎn)的去除毒素方法[7]。Brown等[8]、Cotty等[9]測(cè)試了在玉米,棉籽、花生等作物中,培養(yǎng)不產(chǎn)毒素黃曲霉菌株來(lái)抑制產(chǎn)毒菌株的生長(zhǎng)。木霉屬真菌也可作為某些植物病原真菌的生物拮抗劑,包括生物防治黃曲霉[10]。已有研究表明,一些細(xì)菌可以降解黃曲霉毒素,如黃桿菌屬NRRL b-184能在受污染的作物中去除黃曲霉毒素[11];從加州杏仁樣品和玉米土壤分離出的桿菌、假單胞菌、伯克氏菌株、青枯菌,可以完全抑制黃曲霉生長(zhǎng)和黃曲霉毒素合成[12-13]。放線菌也可以降解黃曲霉毒素,從分枝桿菌提取的2種F420H2-依賴(lài)性還原酶,可以催化降解黃曲霉毒素[14]。

前期研究[15]表明,海洋巨大芽孢桿菌可以抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和黃曲霉毒素B1的生物合成,還需要進(jìn)一步的研究巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素生物合成的機(jī)制。生物芯片技術(shù)已經(jīng)成為檢查成千上萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)的好方法,這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同溫度下,黃曲霉毒素的生物合成中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律[16-17]。這些研究發(fā)現(xiàn),在不同的溫度條件下,黃曲霉不同基因的表達(dá)水平是不一樣的。但是,生物拮抗劑對(duì)花生上黃曲霉全基因組中各基因表達(dá)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中,我們首次利用基因芯片的方法,研究巨大芽孢桿菌在花生中對(duì)黃曲霉毒素生物合成途徑的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 海洋巨大芽孢桿菌分離自黃海東部,利用形態(tài)、生理生化、16S rRNA的方法對(duì)其菌種鑒定[18]。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)在牛肉膏蛋白胨肉湯培養(yǎng)基(beef extract and peptone broth,BEPB)(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,蒸餾水1 L)中,200 r/min在37 ℃培養(yǎng)24 h后,8 000 r/min離心45 s收集菌體,無(wú)菌蒸餾水洗2次去掉殘留培養(yǎng)基。細(xì)菌用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)水樣中的細(xì)菌計(jì)數(shù),然后用無(wú)菌蒸餾水稀釋到所需的含量。

病原菌黃曲霉NRRL3357保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)(200 g土豆煮后的濾液,葡萄糖20 g，瓊脂20 g,蒸餾水1 L)。用0.1% Tween-80溶液洗滌黃曲霉PDA培養(yǎng)基,過(guò)濾制成孢子懸浮液。孢子用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),然后用0.1% Tween-80溶液稀釋。

1.1.2 花生仁 花生品種UF 715133-1和Jinhua 1012由山東省花生研究所提供。UF 715133-1是一種抗黃曲霉侵染的花生品種,而Jinhua 1012是易被黃曲霉侵染的花生品種。處理前,花生仁用自來(lái)水清洗,然后用0.1%次氯酸鈉消毒表面1 min,打孔前用自來(lái)水清洗和風(fēng)干。

粗顆粒的凍融循環(huán)試驗(yàn)不僅與試驗(yàn)時(shí)的含水率有關(guān)，還與顆粒的級(jí)配有關(guān)。袁俊平等[21]認(rèn)為粗粒土凍融變形量受其顆粒粒徑大小的影響，如圖5所示。顆粒粒徑大小影響水分充滿(mǎn)孔隙的多少和水分的遷移通道，以及影響凍融過(guò)程中顆粒排列和孔隙分布。試樣凍脹變形量隨顆粒粒徑增大而逐漸減小; 而凍脹融沉后試樣總變形率隨限制粒徑呈現(xiàn)先增大再減小趨勢(shì)。此外，凍融循環(huán)還可以使土的顆粒級(jí)配發(fā)生變化[4]。

1.1.3 主要試劑和儀器 冷凍離心機(jī)3-18R(美國(guó)TOMOS公司);人工氣候箱(QHX-300BS-Ⅲ,上海新苗醫(yī)療器械有限公司);黃曲霉毒素B1免疫親和柱(AflaT-est,美國(guó)VICAM公司);安捷倫1100系列高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Zorbax C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,美國(guó)Agilent公司);黃曲霉全基因組“8×15 K”基因芯片(美國(guó)Agilent公司);RNeasy mini kit(美國(guó)Invitrogen公司);熒光染料Cy3-dCTP(美國(guó)GE Healthcare公司);基因芯片掃描儀G2505C(美國(guó)Agilent公司);SYBR PremixExTaqkit(大連寶生物工程有限公司);ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 在花生上接種海洋巨大芽孢桿菌和黃曲霉

花生仁使用無(wú)菌打孔器打孔(直徑6 mm,約3 mm深),然后分別在已打孔的花生仁上接種20 μL的巨大芽孢桿菌(108CFU/mL)。接種細(xì)菌2 h后,將10 μL的黃曲霉孢子懸浮液(106個(gè)/mL)接種到每個(gè)孔中?；ㄉ手糜谌斯夂蛳?在28 ℃高濕度(85%)培養(yǎng)7 d。每處理重復(fù)3次,每個(gè)測(cè)試20?；ㄉ省Ｔ诘?天收集花生仁上的菌絲,立即在液氮下冷凍,磨成粉,儲(chǔ)存在-80℃。

1.2.2 黃曲霉毒素的提取和HPLC分析 從10 g花生提取黃曲霉毒素,用免疫親和柱純化,三氟乙酸衍生,使用安捷倫1100系列高效液相色譜儀測(cè)定,熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360 nm、發(fā)射波長(zhǎng)440 nm,色譜柱為Zorbax C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=50∶40∶10,流速為0.8 mL/min,檢測(cè)時(shí)間為15 min。

1.2.3 基因芯片 黃曲霉全基因組芯片(8×15 K)上至少用1個(gè)60-mer寡核苷酸探針為每個(gè)黃曲霉基因測(cè)試,寡核苷酸探針和基因芯片由美國(guó)安捷倫公司設(shè)計(jì)并制造。

1.2.4 RNA分離和基因芯片分析 每個(gè)樣本用總RNA抽提試劑盒提取總RNA,并根據(jù)說(shuō)明用試劑盒(RNeasy mini Kit)進(jìn)一步純化。總RNA模板通過(guò)分光光度法進(jìn)行量化,并用1.0%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其檢測(cè)。

cDNA逆轉(zhuǎn)錄于5 μg的RNA,然后根據(jù)制造商的說(shuō)明加上熒光染料(Cy3-dCTP)。在80 μL雜交溶液中進(jìn)行雜交,雜交液含3×SSC(氯化鈉檸檬酸鈉緩沖液,saline sodium citrate),0.2%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、5×Denhardt的溶液和25%甲酰胺,然后在65 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。在雜交后,切片用洗滌溶液清洗(0.2% SDS,分別加2×SSC和2×SSC),在37 ℃放置5 min。芯片用軟件掃描(Agilent G2505C Scanner),圖像用GeneSpring軟件(Agilent Technologies Co., Ltd.)進(jìn)行分析。用Cluster 3.0軟件進(jìn)行平均信號(hào)強(qiáng)度分析。利用BlastX來(lái)搜索同源物和基因本體(gene ontology,GO)功能分類(lèi)[19],GO使用BGI-WEGO網(wǎng)絡(luò)服務(wù)(http://wego.genomics.org.cn)進(jìn)行分類(lèi)。log2比率(log2ratio)用來(lái)衡量相對(duì)表達(dá)水平的變化,如果log2>2或log2<-2,認(rèn)為基因表達(dá)有差異;如果log2比率>5或<-5,則認(rèn)為基因表達(dá)差異顯著。

1.2.5 途徑分析 由于對(duì)黃曲霉合成途徑的信息了解有限,所有基因的注釋使用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為參考。使用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路方法(http://www.genome.jp/kegg/)對(duì)基因進(jìn)行分類(lèi)和分析。

1.2.6 定量RT-PCR 使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)確認(rèn)基因芯片數(shù)據(jù)。序列的引物合成于上海生工生物工程有限公司(表1),β-微管蛋白(β-tubulin)基因作為管家基因。使用生物染料熒光定量試劑盒(SYBR PremixExTaqkit)完成qRT-PCR,每個(gè)反應(yīng)制備液25 μL,包含互補(bǔ)DNA 2 μL,SYBR預(yù)混料Taq試劑12.5 μL,10 mmol/L引物0.5 μL(上游與下游)。根據(jù)說(shuō)明來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)：在95 ℃ 預(yù)變性2 min,94 ℃變性10 s,60 ℃退火40 s,60 ℃延伸40 s,反應(yīng)運(yùn)行了40個(gè)周期。qRT-PCR重復(fù)3次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.0對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),顯著水平設(shè)置在P=0.05?；蛐酒Y(jié)果已提交到美國(guó)NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：GSE51469)。

2 結(jié)果與分析

2.1 在花生Jinhua 1012和UF 715133-1中黃曲霉基因表達(dá)的差異

在黃曲霉基因組已知的13 487個(gè)基因中,Jinhua 1012實(shí)驗(yàn)組上的黃曲霉有817個(gè)基因表達(dá)有差異,453個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào),而364基因表達(dá)水平下調(diào);其中13個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),而7個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。在Jinhua 1012對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量比分別為(1 683.60±75.27) μg/kg和(206.15±19.18) μg/kg(表2)。

類(lèi)似的結(jié)果在UF 715133-1中出現(xiàn)。用海洋巨大芽孢桿菌處理后,黃曲霉中201個(gè)基因表達(dá)有差異,其中125個(gè)基因表達(dá)上調(diào),而76個(gè)基因表達(dá)下調(diào);其中2個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),1個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組黃曲霉毒素B1質(zhì)量比分別為(149.45±12.87) μg/kg和(1 040.79±41.62) μg/kg(表2)。經(jīng)GO分析,大多數(shù)表達(dá)差異的基因參與運(yùn)輸(36.2%)和代謝過(guò)程(28.6%)(圖1)。

2.2 京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)注釋和分析

KEGG途徑分析Jinhua 1與Jinhua 2、UF 1與UF 2表明,大部分表達(dá)差異的基因參與次生代謝物(占30%以上)生物合成和代謝途徑(占80%以上)(圖2)。

表2 不同方法處理后黃曲霉毒素B1的質(zhì)量比

圖1 基因本體分析表達(dá)差異基因參與的生物過(guò)程Fig.1 Gene ontology analysis of the differentially expressed genes in biological process

2.3 qRT-PCR分析

laeA、veA、aflR、aflS和rolA的表達(dá)由qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖3)。相比Jinhua 1012對(duì)照組(Jinhua 2),實(shí)驗(yàn)組Jinhua 1012(Jinhua 1)的基因rolA、laeA、veA、aflR和aflS表達(dá)未達(dá)到顯著差異水平(P>0.05)。相似的結(jié)果在花生UF 715133-1中出現(xiàn),與對(duì)照組UF 715133-1(UF 2)比較,實(shí)驗(yàn)組UF 715133-1(UF 1)中基因aflR表達(dá)接近差異顯著,而基因rolA、laeA、veA和aflS的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

Jinhua 1012和UF 715133-1上的研究結(jié)果表明,經(jīng)海洋巨大芽孢桿菌處理,黃曲霉毒素生物合成基因簇中各基因表達(dá)差異不明顯(表3)。相應(yīng)地,測(cè)定實(shí)驗(yàn)組Jinhua 1012和UF 715133-1的黃曲霉毒素B1質(zhì)量比,黃曲霉毒素B1的質(zhì)量比降低了85%以上(表2)?；ㄉ⒉皇呛Ｑ缶薮笱挎邨U菌生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基,而實(shí)驗(yàn)條件(28℃,相對(duì)濕度85%)是黃曲霉毒素生物合成的最優(yōu)條件,這是花生中巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素生物合成基因簇中基因表達(dá)抑制作用較低的主要原因。因此我們推斷,黃曲霉毒素的生物合成不僅受到毒素生物合成基因簇中基因的調(diào)控,還受到其他一些基因的調(diào)控。

相比UF 715133-1對(duì)照組,Jinhua 1012對(duì)照組更多的基因表達(dá)是上調(diào)的,在Jinhua 1012對(duì)照組產(chǎn)生黃曲霉毒素B1比UF 715133-1對(duì)照組多(表2)。此外,Jinhua 1012經(jīng)海洋巨大芽孢桿菌處理,一些黃曲霉素生物合成途徑的基因表達(dá)上調(diào);UF 715133-1經(jīng)海洋巨大芽孢桿菌處理,黃曲霉毒素生物合成途徑?jīng)]有基因表達(dá)上調(diào)(表3)。相應(yīng)地,黃曲霉毒素B1質(zhì)量比在Jinhua 1012顯著高于UF 715133-1(表2)。

圖2 京都基因與基因組百科全書(shū)分析表達(dá)差異基因參與的生物過(guò)程Fig.2 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis of the differentially expressed genes in biological process

圖3 qRT-PCR 證明aflR,aflS,laeA,veA和rolA的基因表達(dá)Fig.3 qRT-PCR analysis of the expression of aflR, aflS, laeA, veA and rolA

表3 巨大芽孢桿菌影響黃曲霉毒素生物合成基因和laeA與veA的表達(dá)

續(xù)表3 巨大芽孢桿菌影響黃曲霉毒素生物合成基因和laeA與veA的表達(dá)

這個(gè)結(jié)果與UF 715133-1是抗黃曲霉品種而Jinhua 1012是易感黃曲霉品種相吻合。

基因芯片數(shù)據(jù)顯示海洋巨大芽孢桿菌也可抑制某些參與環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)生物合成的基因表達(dá)(表4)。CPA的產(chǎn)生總是與霉菌毒素的產(chǎn)生特別是黃曲霉毒素的產(chǎn)生有關(guān)[20]。我們推斷海洋巨大芽孢桿菌也可抑制環(huán)匹阿尼酸的產(chǎn)生。

除了黃曲霉毒素生物合成基因簇的基因(表3),此項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)了一些有效控制黃曲霉毒素生物合成的目標(biāo)基因,如非核糖體多肽合成酶(NRPSs)、短鏈脫氫酶和翻譯延伸因子(EF-1)。非核糖體肽合成酶具有多種對(duì)微生物生存、生長(zhǎng)繁殖等所必需的生理功能,比如可作為調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、繁殖和分化的信號(hào)分子等[21];短鏈脫氫酶是一類(lèi)NADPH依賴(lài)型氧化還原酶家族,具有相似的序列模型及催化機(jī)制,短鏈脫氫酶在脂質(zhì)、碳水化合物、氨基酸、輔酶和異物的代謝中具有關(guān)鍵性作用;翻譯延伸因子是一個(gè)主要的翻譯因子,它不僅僅是翻譯必需的蛋白質(zhì),而且是一個(gè)重要的多功能蛋白質(zhì),參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程和疾病,包括信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯控制、凋亡、細(xì)胞骨架組成等[22]。

此外,AFLA_063980,AFLA_059490,AFLA_073880,AFLA_116480,AFLA_000910,AFLA_117420,AFLA_042140,AFLA_064240,AFLA_114330,AFLA_039240,AFLA_082260,AFLA_075300,AFLA_136890,AFLA_075950,AFLA_107060,AFLA_104430,AFLA_040740,AFLA_110190,AFLA_035900,AFLA_008770,AFLA_110170等基因通過(guò)海洋巨大芽孢桿菌處理,在UF 715133-1實(shí)驗(yàn)組和Jinhua 1012實(shí)驗(yàn)組都顯著下調(diào)(表5),可以推斷這些基因直接或間接影響黃曲霉毒素的生物合成(表2)。目前,這些基因的作用是未知的,進(jìn)一步的研究將增加我們對(duì)控制黃曲霉毒素生物合成的理解。

表4 巨大芽孢桿菌影響環(huán)匹阿尼酸生物合成基因的表達(dá)

表5 海洋巨大芽孢桿菌顯著抑制黃曲霉中表達(dá)差異的基因(前20個(gè)基因)

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Journal of Zhejiang University (Agric. & Life Sci.), 2015,41(5)：567-576

Kong Qing1*, Chi Chen1, Shan Shihua2, Li Qiyu1

(1.SchoolofFoodScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,Shandong,China; 2.ShandongPeanutInstitute,Qingdao266100,Shandong,China)

Previous studies in our laboratory demonstrated that a marineBacillusmegateriumcould inhibit the growth ofAspergillusflavusand turn off the biosynthesis of aflatoxin B1. In order to investigate the mechanisms of inhibition byB.megateriumonA.flavusgrowth and aflatoxin production in peanuts and to evaluate the possible application ofB.megateriumas a biocontrol agent, genes expression analysis using wholeA.flavusgenome gene chip whenA.flavuswas co-cultured withB.megateriumin peanuts were performed.

The aim of this research was to study the inhibitory effect ofB.megateriumon aflatoxin biosynthetic pathway genes expression inA.flavus. The effects ofB.megateriumon aflatoxin biosynthesis and genes expression inA.flavuswere tested in two types of peanut varieties, UF 715133-1 and Jinhua 1012 by the aid of high performance liquid chromatography (HPLC), gene chip and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). UF 715133-1 is a kind of peanut that could resist toA.flavusinvasion, while Jinhua 1012 is susceptible to the infection ofA.flavus.

The results showed that though more than 85% of aflatoxin B1was inhibited by the treatment ofB.megateriumin UF 715133-1 and Jinhua 1012, no important aflatoxin biosynthetic pathway gene was differentially expressed. Peanuts unsuitable for the growth ofB.megateriumwas the main reason forB.megateriumunthoroughly inhibit the biosynthesis of aflatoxin like in minimal medium (MM) or potato dextrose broth (PDB). Furthermore, the experimental condition (28 ℃, relative humidity 85%), which is the optimal condition for aflatoxin biosynthesis, wasn’t suitable for the growth ofB.megateriumneither. So we inferred thatB.megateriuminhibited aflatoxin biosynthesis by inhibiting the growth ofA.flavusin peanuts, and the secondary metabolites inB.megateriumaccounted for the inhibition. Furthermore, the results showed some coding protease genes were highly downregulated, such as short-chain dehydrogenase, and non-ribosomal peptide synthetase, which may relate to aflatoxin biosynthesis.

In conclusion, this strain of marineB.megateriumisolated from the Yellow Sea of East China could significantly inhibit the aflatoxin biosynthesis in peanuts through inhibiting genes expression inA.flavus. While the role of most highly downregulated genes in aflatoxin biosynthesis hasn’t been clarified, the mechanism remains to be further studied.

Bacillusmegaterium; aflatoxin; inhibitory; genes expression; peanut

國(guó)家自然科學(xué)基金(31471657;31000823)。

2015-03-06;接受日期(Accepted)：2015-06-17;網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online)：2015-09-18

S 565.2; Q 939.92

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*通信作者(Corresponding author)：孔青(http://orcid.org/0000-0002-5147-7832),Tel:+86-532-82031851;E-mail:kongqing@ouc.edu.cn

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.s.20150918.1800.016.html