楊輝++++++徐笑紅

[摘要] 目的 探討靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖、凋亡及化療敏感性的影響。 方法 針對(duì)VEGF-C的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，另設(shè)立轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)載體組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。觀察各組細(xì)胞的VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組VEGF-C mRNA表達(dá)率無(wú)顯著差異（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組各組的表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)A組的表達(dá)又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組（P<0.01）。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組培養(yǎng)液上清中VEGF-C蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組各組蛋白水平均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)A組蛋白水平又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組（P<0.01）。 結(jié)論 靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體能夠顯著降低人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C的基因和蛋白表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 人乳腺癌細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C；蛋白

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）10-0001-04

Effect of siRNA expression vector of targeting the VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression

YANG Hui1 XU Xiaohong2

1.Cancer Chemotherapy Center， Ningbo Yinzhou People's Hospital， Ningbo 315000， China； 2.Cancer Chemotherapy Center， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To discuss the effect of siRNA expression vector of targeting VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression. Methods The siRNA expression vector of targeting VEGF-C transfected breast cancer cells， and another groups of expression vector transfected and transfected with negative were established. Each group set up five wells. VEGF-C mRNA and protein expression of all groups were compared. Results VEGF-C mRNA expression of negative control group and the control group showed no significant difference （P>0.05）. VEGF-C mRNA expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group （P<0.01）； expression of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C （P<0.01）. VEGF-C protein levels in culture supernatant of negative control group and the control group showed no significant difference（P>0.05）； VEGF-C protein levels in culture supernatant of expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group （P<0.01）； Level of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C （P<0.01）. Conclusion siRNA expression vector of targeting the VEGF-C can apparently decrease VEGF-C mRNA and protein expression on breast cancer cells.

[Key words] Breast cancer cells； Vascular endothelial growth factor-C； Protein

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤的發(fā)病中占首位。手術(shù)治療是根治乳腺癌的主要方法，但是術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、化療耐藥可影響最終的治療效果。近年來(lái)隨著分析生物學(xué)的迅速發(fā)展，分子靶向治療成為新的熱點(diǎn)[1，2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF家族的成員之一，與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2、3結(jié)合，促進(jìn)血管及淋巴管的增生，參與腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程[3，4]。VEGF-C結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的受體后，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并能阻止細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，靶向抑制VEGF-C基因的表達(dá)，對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的臨床意義。本研究主要探討靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間：2013年4月～2014年12月。MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。靶向VEGF-C的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，陰性對(duì)照質(zhì)粒。主要試劑：培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000、Trizol試劑、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker Ⅱ、人VEGF-C ELISA試劑盒、SABC 組化試劑盒、DBA試劑盒、瓊脂糖、DEPC等。主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、核酸蛋白檢測(cè)儀、離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、PCR儀、酶標(biāo)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代 乳腺癌細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞80%融合時(shí)，進(jìn)行傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 （1）轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒DNA純化、定量。質(zhì)粒抽提試劑盒提取靶向VEGF-C重組質(zhì)粒（pRNAT-VEGF-C-1、pRNAT-VEGF-C-2、pRNAT-VEGF-C-3）及陰性對(duì)照質(zhì)粒（P-N）。（2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板，每孔3×105個(gè)，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞達(dá)到90%融合。分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組：空白對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒；實(shí)驗(yàn)A組轉(zhuǎn)染pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒；實(shí)驗(yàn)B組轉(zhuǎn)染pRNAT-VEGF-C-2質(zhì)粒；實(shí)驗(yàn)C組轉(zhuǎn)染pRNAT-VEGF-C-3質(zhì)粒。制備脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA混合物。洗凈培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液，采用DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2遍，加入DMEM培養(yǎng)基500 μL，加入脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，總體積600 μL。每組5個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)基。37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)6 h，換液，加1 mL含10%FCS的DMEM過(guò)夜。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 采用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá) （1）提取總RNA。（1～5）×106細(xì)胞移入EP管中，離心，去上清。加入Trizol 1 mL混勻，室溫下放置5 min，加入氯仿200 μL，震蕩15 s，室溫下放置3 min。4℃離心15 min，將水相轉(zhuǎn)移到EP管中，加入等體積異丙醇混勻，放置20～30 min，4℃離心10 min，去上清，加75%乙醇1 mL洗滌沉淀。4℃離心5 min，倒出液體再次離心后，槍頭吸出少量液體，留下沉淀。室溫晾干，重復(fù)溶解RNA。4 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。（2）PCR擴(kuò)增。VEGF-C引物和β-actin引物由上海博雅生物公司合成提供。反應(yīng)體系12.5 μL。瓊脂糖點(diǎn)凝膠電泳，分析電泳結(jié)果，VEGF-C表達(dá)率采用其吸光度值與內(nèi)參照β-actin吸光度值比例表示。

1.3.2 采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C蛋白的表達(dá) （1）每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組、實(shí)驗(yàn)C組，同mRNA檢測(cè)。每組5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后48 h，收集上清，采用ELISA法檢測(cè)上清液中的VEGF-C蛋白水平。

1.3.3 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的乳腺癌細(xì)胞，每孔3×105個(gè)接種于放有載玻片的培養(yǎng)板內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。細(xì)胞布滿80%后，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，步驟和分組同上。每組5個(gè)復(fù)孔。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48 h，取出培養(yǎng)板，吸凈培養(yǎng)液，加甲醛固定，PBS沖洗3遍。取出載玻片，去離子水孵育，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加封閉液，加一抗過(guò)夜，加生物素化山羊抗小鼠IgG，孵育20 min。PBS沖洗共3次，加SABC，孵育20 min，PBS沖洗共4次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯脫水，封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析及t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞VEGF-C mRNA表達(dá)的影響

空白對(duì)照組表達(dá)率為（98.6±2.4）%，陰性對(duì)照組表達(dá)率為（98.1±2.0）%，實(shí)驗(yàn)A組表達(dá)率為（38.2±1.6）%，實(shí)驗(yàn)B組表達(dá)率為（64.2±1.8）%，實(shí)驗(yàn)C組表達(dá)率為（67.9±1.9）%。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組VEGF-C mRNA表達(dá)率無(wú)顯著差異（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組各組的表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)A組的表達(dá)又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組（P<0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF-C蛋白水平的影響

陰性對(duì)照組VEGF-C蛋白水平為（383.51±30.26）pg/mL，空白對(duì)照組為（368.80±38.91）pg/mL，實(shí)驗(yàn)A組為（116.38±25.16）pg/mL，實(shí)驗(yàn)B組為（277.42±30.11）pg/mL，實(shí)驗(yàn)C組為（291.46±33.15）pg/mL。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組培養(yǎng)液上清中VEGF蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組各組蛋白水平均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)A組蛋白水平又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組（P均<0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白表達(dá)的影響

各組乳腺癌細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖3～7。VEGF-C蛋白陽(yáng)性可見(jiàn)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染色顏色均較深，為棕黃色，實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組染色均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組淺，而又以實(shí)驗(yàn)A組染色最淺。

3討論

VEGF-C是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員，具有促進(jìn)血管增生的作用，在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。而癌癥細(xì)胞分泌VEGF-C與其自身膜受體結(jié)合，能夠促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡，降低癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。VEGF-C在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)[5]。目前針對(duì)VEGF-C為靶點(diǎn)的治療主要有抑制VEGF-C受體的酪氨酸激酶活性、抗體封閉、降低VEGF-C及其受體的表達(dá)，但這些技術(shù)或方法均有一定的局限性。RNA干擾由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異的同源基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的基因沉寂現(xiàn)象，其作用機(jī)制是小干擾RNA（siRNA）作為中介分子，與其他一些蛋白質(zhì)構(gòu)成沉默復(fù)合物，按照堿基互補(bǔ)規(guī)律，識(shí)別降解與siRNA同源的mRNA[6-8]。siRNA干擾是一種高效的、特異的基因表達(dá)抑制技術(shù)，廣泛用于基因治療相關(guān)的研究。該技術(shù)經(jīng)人工合成靶向的siRNA，或者構(gòu)建相應(yīng)的載體，導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，能夠特異性抑制基因的表達(dá)。

1996年VEGF-C首次從前列腺腫瘤細(xì)胞中被分離出來(lái)，與VEGF家族其他成員具有同源性。VEGF-C在人類多種惡性腫瘤中均有高表達(dá)。VEGF-C在腫瘤組織中的高表達(dá)，結(jié)合腫瘤周圍組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF-R3，誘發(fā)形成腫瘤相關(guān)淋巴管，增加淋巴管與腫瘤細(xì)胞的接觸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移[9，10]。表達(dá)VEGF-C的乳腺癌細(xì)胞更具有侵襲性，更容易經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移。正常的乳腺組織并不表達(dá)VEGF-C及VEGFR-3，而乳腺癌組織中會(huì)出現(xiàn)不同程度表達(dá)率，并且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)者。研究顯示，腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-C，特異性結(jié)合自身表面受體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，上調(diào)Bcl-2/Bax值，抑制癌細(xì)胞的凋亡，降低癌細(xì)胞的化療敏感性。目前針對(duì)VEGF-C及其受體的抗腫瘤治療方法有多種方式。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使具有正常免疫力的小鼠MT-450乳腺癌模型中的乳腺癌細(xì)胞異位表達(dá)VEGFR-3-Ig，具有阻斷VEGF-C活性的效果，抑制局部轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移?？估w維蛋白溶酶能夠抑制VEGF-C水解，阻止其不能結(jié)合VEGF-R3。這些基因靶向治療方法能夠發(fā)揮作用，但具有一定的局限性。

RNA干擾具有高效、高特異性的效果，采用該技術(shù)抑制VEGF-C的基因表達(dá)，為腫瘤治療提供了一種新的方法。siRNA為與目的基因同源的RNA，通常19～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，與內(nèi)切酶形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，以siRNA為模板，識(shí)別并剪切、降解同源基因mRNA，形成瀑布效應(yīng)，使細(xì)胞表現(xiàn)為目的基因缺陷表型。RNA干擾技術(shù)具有高效、特異、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，能夠高效抑制特定基因的表達(dá)，與反義核苷酸技術(shù)比較，具有更簡(jiǎn)易、方便的特點(diǎn)[11，12]。

MCF-7乳腺癌細(xì)胞株屬于高表達(dá)VEGF-C細(xì)胞株，因此本次研究選擇此細(xì)胞株作為研究對(duì)象。siRNA的干擾作用具有劑量和時(shí)間依賴性，轉(zhuǎn)染后24～48 h，干擾效應(yīng)逐漸明顯，48～72 h達(dá)到最高，因此本次實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)染后48 h為檢測(cè)點(diǎn)[13，14]。RT-PCR是測(cè)定目的基因表達(dá)情況的常用方法，具有簡(jiǎn)便、半定量的效果。VEGF-C/β-actin比值表示VEGF-C基因的相對(duì)表達(dá)量。本次研究中，陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組VEGF-C基因表達(dá)相當(dāng)，而實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組表達(dá)明顯降低，又以實(shí)驗(yàn)A組的基因表達(dá)率最低。VEGF-C屬于分泌蛋白，對(duì)培養(yǎng)液上清液中VEGF-C水平的檢測(cè)采用ELISA法，以檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞VEGF-C的分泌情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組上清液中VEGF-C水平顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，又以實(shí)驗(yàn)A組水平最低。這兩個(gè)結(jié)果均提示RNA干擾后乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)及分泌水平顯著下降，又以pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的抑制作用最強(qiáng)。本次研究觀察各組細(xì)胞中VEGF-C蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示細(xì)胞漿中可見(jiàn)呈棕黃色顆粒。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染色較深，而RNA干擾后實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組染色程度均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組淺，而以實(shí)驗(yàn)A組的染色更淺。提示RAN干擾能夠抑制乳腺癌細(xì)胞VEGF-C蛋白的表達(dá)，尤其以pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的抑制作用最強(qiáng)。

綜上所述，靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體可抑制人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因、蛋白的表達(dá)，對(duì)蛋白分泌有抑制作用，而不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果也存在一些差異，以pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒的抑制效果最顯著。

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（收稿日期：2014-12-03）