陳躍平，董盼鋒，章曉云，袁振中，饒毅

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧530011；2廣西中醫(yī)藥大學(xué))

·論著·

人類軟骨糖蛋白-39對成人膝關(guān)節(jié)軟骨祖母細(xì)胞增殖的影響

陳躍平1，董盼鋒1，章曉云2，袁振中2，饒毅2

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧530011；2廣西中醫(yī)藥大學(xué))

目的 觀察人類軟骨糖蛋白-39(HCgp-39)對成人膝關(guān)節(jié)軟骨祖母細(xì)胞增殖的影響。方法 取正常及OA關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，向分離培養(yǎng)所得的軟骨祖母細(xì)胞中分別加入0、25、50、100、500 ng/mL的HCgp-39。收集培養(yǎng)0、24、48、72 h的細(xì)胞，加入10 μL的MTS檢測液，酶標(biāo)儀檢測各孔光的吸收值(OD值)，比較各組細(xì)胞對HCgp-39的敏感性。結(jié)果 OA組：48 h時(shí)加入25、50、100、500 ng/mL組的OD值分別為0.81±0.01、0.88±0.02、0.93±0.01、1.03±0.04；72 h分別為1.02±0.05、1.12±0.01、1.21±0.01、1.28±0.01；與未加入HCgp-39組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或<0.01)；正常軟骨組：48 h時(shí)加入25、50、100、500 ng/mL組的OD值分別為0.67±0.01、0.63±0.01、0.61±0.01、0.58±0.01；72 h分別為1.18±0.02、1.1±0、1.08±0.01、0.97±0.02；與未加入HCgp-39比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 在成人的關(guān)節(jié)軟骨中存在軟骨祖母細(xì)胞；HCgp-39能夠促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨中軟骨祖母細(xì)胞的增殖。

骨關(guān)節(jié)炎；軟骨祖母細(xì)胞；人類軟骨糖蛋白-39；細(xì)胞增殖

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以病變累及關(guān)節(jié)軟骨、并繼發(fā)的骨質(zhì)增生為特點(diǎn)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。OA在60歲以上人群中的發(fā)病率高達(dá)49%，好發(fā)于膝關(guān)節(jié)[1]。以往認(rèn)為，成人軟骨中僅含有終末分化的軟骨細(xì)胞，而缺乏具有多向分化潛能的干細(xì)胞，但近年研究表明，在軟骨表層可能存在具有分化功能的細(xì)胞系[2]。人類軟骨糖蛋白-39(HCgp-39)是關(guān)節(jié)軟骨自身分泌的細(xì)胞因子，主要來源于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，OA時(shí)患者血清和關(guān)節(jié)液中HCgp-39含量明顯增加，因此推測，HCgp-39異常增高可能與軟骨組織的病理變化有關(guān)，并在一定程度上參與了軟骨組織的重建和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。2012年7月～2013年12月，我們觀察了HCgp-39對成人膝關(guān)節(jié)軟骨祖母細(xì)胞增殖的影響，探討HCgp-39參與OA的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 正常標(biāo)本與OA關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本分別取自1例股骨髁骨折行手術(shù)治療的青年患者(男，34歲,右股骨髁粉碎性骨折，行切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù))和1例因OA行關(guān)節(jié)置換的老年患者(女，61歲，左膝骨關(guān)節(jié)炎，行左膝人工關(guān)節(jié)置換術(shù))。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集受試者股骨髁間窩非負(fù)重區(qū)的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，立即送實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)格按照無菌要求剔除軟骨組織上的軟組織及血瘀塊，并將其剪切成大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的軟骨塊，置4%多聚甲醛中固定5 d，再置于15% EDTA溶液中脫鈣4周。常規(guī)乙醇脫水，包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行蘇木精伊紅染色與番紅O染色。光鏡下觀察，每張切片選擇3個(gè)不同視野，參照Mankin[3]軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

1.2.2 軟骨祖母細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 將軟骨組織剪碎成2 mm×2 mm的小塊，加入0.125%的胰酶消化，將消化處理后的軟骨組織塊重新剪碎成1 mm×1 mm的小塊，平鋪于含有H-DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，倒置培養(yǎng)4 h后翻瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 軟骨祖母細(xì)胞的表型鑒定及分離培養(yǎng) 將傳至2代的細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/100 μL進(jìn)行培養(yǎng)，并行CD166和CD105抗原流式檢測，確定軟骨祖母細(xì)胞(CD166+和CD105+的細(xì)胞)的百分率后，對其再次進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞傳至第3代時(shí)，采用流式分選的方法分離提取能夠表達(dá)CD105/CD166的細(xì)胞(軟骨祖母細(xì)胞)并進(jìn)行純度檢測。

1.2.4 HCgp-39處理軟骨祖母細(xì)胞 向分離培養(yǎng)的軟骨祖母細(xì)胞中分別加入0、25、50、100、500 ng/mL的HCpg-39，消化細(xì)胞后吹打散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，加入96孔板中，100 μL/孔；待細(xì)胞貼壁后，收集HCgp-39作用0、24、48、72 h的細(xì)胞檢測，并加入比例為1∶10的MTS，孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀板，讀取MTS檢測OD490數(shù)據(jù)。不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測3次。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞及傳代后形態(tài)觀察 分離培養(yǎng)正常原代軟骨細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞呈多角型，扁平狀，胞質(zhì)豐富，可見清晰、圓形的細(xì)胞核，部分區(qū)軟骨細(xì)胞集落樣生長；OA原代軟骨細(xì)胞形態(tài)多不規(guī)則，似成纖維細(xì)胞，貼壁較正常軟骨細(xì)胞晚，生長速度也明顯較正常軟骨細(xì)胞慢，且多為單層生長，結(jié)節(jié)樣細(xì)胞群和集落樣生長少見。正常軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)后細(xì)胞仍似橢圓形,細(xì)胞胞質(zhì)豐富，隨傳代次數(shù)不斷增加,細(xì)胞集落中的梭形細(xì)胞數(shù)目逐漸增多；OA軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)后大部分會恢復(fù)到原來的梭形或短梭形，細(xì)胞突起會逐漸變長并向多角形演化，最終形成多角形，融合時(shí)間明顯延長。

2.2 軟骨祖母細(xì)胞的流式分選及純度檢測 在正常關(guān)節(jié)來源的軟骨細(xì)胞中和OA關(guān)節(jié)來源的軟骨細(xì)胞中均能分離出能夠表達(dá)CD105及CD166的細(xì)胞(軟骨祖母細(xì)胞)分別為2.29%和2.68%。對從正常關(guān)節(jié)和OA關(guān)節(jié)來源的軟骨祖母細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對最終培養(yǎng)所得的OA軟骨祖細(xì)胞和正常軟骨祖母細(xì)胞分選后細(xì)胞純度檢測分別為96.96%和92.97%。

2.3 不同濃度HCgp-39對兩組軟骨祖母細(xì)胞增殖的影響 見表1、表2。

2.4 不同濃度HCgp-39作用于兩組軟骨祖母細(xì)胞后祖母細(xì)胞增殖率的變化趨勢 見圖1、圖2。

3 討論

Chen等[4]利用電子掃描顯微鏡對從軟骨和骨髓中分離得到的直徑<5 mm的小細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來自軟骨的小細(xì)胞與來自骨髓的小細(xì)胞一樣，均具有分化成軟骨細(xì)胞的潛能。Barbero等[5]對人關(guān)節(jié)軟骨中提取的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對成軟骨、成骨和成脂細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示，人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，有一部分細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞，且其分化能力的大小受細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1及成纖維細(xì)胞生長因子2的影響。這些研究進(jìn)一步說明，軟骨中可能具有多向分化潛能的軟骨祖母細(xì)胞存在。國際細(xì)胞治療學(xué)會對干細(xì)胞的界定包括3點(diǎn)：在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下有黏附可塑性；表達(dá)CD105、CD90和CD73；缺乏CD34、CD45、CD14、CD79α、CD11b或CD19及HLA-DR表面分子的表達(dá)。Alsalameh等[6]采用免疫磁珠分離的方法也證實(shí)，無論是人的正常軟骨組織還是發(fā)生OA的軟骨中，均存在表達(dá)CD105/CD166的細(xì)胞(軟骨祖母細(xì)胞)，且此類細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后能夠被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞，而且在發(fā)生OA的軟骨中表達(dá)CD105/CD166的細(xì)胞要明顯多于正常軟骨組織中的細(xì)胞。以上研究均說明，在關(guān)節(jié)軟骨中存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞。HCgp-39是殼質(zhì)酶家族成員，相對分子量約為39 000，由分布于8 kb區(qū)域上的10個(gè)外顯子構(gòu)成。HCgp-39主要來源于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，但其并不具備殼質(zhì)酶活性[7]。目前認(rèn)為，其可能與組織重建和細(xì)胞外基質(zhì)的合成有關(guān)。HCgp-39在炎癥性關(guān)節(jié)疾病患者血液和關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)高于正常關(guān)節(jié)，且在成人骨與關(guān)節(jié)重塑過程中能夠階段性和特異性表達(dá)[8]。Johansen等[9]對476例健康兒童、260例健康成人和63例創(chuàng)傷患者、54例OA患者進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)70歲以上人群和重度膝OA患者血清和關(guān)節(jié)液中HCgp-39水平明顯增高，推測HCgp-39的增高可能與軟骨的病理變化有關(guān)，可在一定程度反映炎癥反應(yīng)的程度和關(guān)節(jié)軟骨降解破壞的程度，是關(guān)節(jié)破壞的一個(gè)診斷性標(biāo)記物。在細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)HCgp-39對豚鼠軟骨細(xì)胞和兔軟骨細(xì)胞具有促有絲分裂作用，且具有劑量依賴性[10]，說明HCgp-39在組織重塑過程中具有一定作用。

表1 不同濃度 HCgp-39對OA軟骨祖母細(xì)胞增殖 的影響

表2 不同濃度 HCgp-39對正常軟骨祖母細(xì)胞增殖 的影響

圖1 不同濃度HCgp-39對OA軟骨祖母細(xì)胞 增殖率的影響

圖2 不同濃度HCgp-39對正常軟骨祖母細(xì)胞 增殖率的影響

本研究顯示，向OA組關(guān)節(jié)軟骨祖母細(xì)胞中加入HCgp-39后，檢測各孔的OD值，結(jié)果第2天及第3天各劑量組與未加入HCgp-39相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；OA軟骨祖母細(xì)胞的增殖率隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長而呈增大趨勢。有研究表明，HCgp-39主要在OA軟骨的表層和中層表達(dá)，而在正常人的軟骨中并不表達(dá)[11]。也有研究證實(shí)，OA患者血清HCgp-39水平與IL-6和CRP水平呈正相關(guān)，且隨著病程延長及患者活動功能受限，血清HCgp-39濃度也會相應(yīng)增加。在正常軟骨組織中，軟骨細(xì)胞的基質(zhì)中各種成分的新陳代謝是一種緩慢的過程，軟骨細(xì)胞基質(zhì)分解與合成處于動態(tài)的平衡狀態(tài)，但當(dāng)這種內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài)被打破，軟骨細(xì)胞就會產(chǎn)生大量HCgp-39。有學(xué)者[12]研究了軟骨細(xì)胞中HCgp-39的分泌規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在分離的正常軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的早期，作為對細(xì)胞外環(huán)境的反應(yīng)，HCgp-39的分泌也會明顯升高。因此推測，當(dāng)由于不同原因?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨受損，誘發(fā)OA或者軟骨周圍的環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，可能會激活軟骨組織重建修復(fù)過程，在重建修復(fù)過程中刺激HCgp-39的分泌增多。在向正常軟骨組的關(guān)節(jié)軟骨祖母細(xì)胞中加入HCgp-39后，經(jīng)過72 h培養(yǎng)，檢測各孔光的OD值。結(jié)果第2天及第3天各劑量組與未加入HCgp-39相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常軟骨祖母細(xì)胞的增殖率隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長而呈減小的趨勢。說明HCgp-39作用于正常軟骨祖母細(xì)胞后，在一定時(shí)間內(nèi)能夠促進(jìn)祖母細(xì)胞的增殖，而升高到一定程度時(shí)又表現(xiàn)為增殖受抑制的效應(yīng)。Knorr等[13]發(fā)現(xiàn)，正常關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在一定水平的HCgp-39，但其在正常軟骨中的作用并不清楚。我們推測，HCgp-39在正常軟骨組織中可能具有與TGF-β相似的作用，即在一定程度上能夠抑制軟骨細(xì)胞的增生肥大和鈣化，使得軟骨中始終保持一定數(shù)量具有潛在分化功能的母細(xì)胞，而當(dāng)這種細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)，便會產(chǎn)生負(fù)反饋效應(yīng)，使得HCgp-39的促軟骨祖母細(xì)胞分裂增殖的作用減弱，與開始加入HCgp-39時(shí)相比，軟骨祖母細(xì)胞的增殖率明顯下降。

OA的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長期、慢性和逐步漸進(jìn)的過程，涉及全身和局部的許多因素。其始動環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨的退變，包括軟骨細(xì)胞增殖與凋亡、合成能力的改變、降解增快、骨贅形成及細(xì)胞表型改變等。HCgp-39作為軟骨自身分泌的細(xì)胞因子，無論對來自于OA患者軟骨中的軟骨祖母細(xì)胞還是來自于正常軟骨中的軟骨祖母細(xì)胞，均在一定時(shí)間內(nèi)具有促進(jìn)其增殖的作用。然而，這兩種來源的細(xì)胞對HCgp-39的反應(yīng)又有所不同，其具體的影響因素及機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

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Effect of human cartilage glycoprotein-39 on proliferation of precartilaginous stem cells of adult articulear cartilage

CHENYue-ping1,DONGPan-feng,ZHANGXiao-yun,YUANZhen-zhong,RAOYi

(1RuikangHospitalAffiatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China)

Objective To investigate the effect of HCgp-39 on adult articular cartilage precartilagincus stem cells proliferation. Methods HCgp-39(0, 25, 50, 100, 500 ng/mL) were added into precartilaginous stem cells. After 0, 24, 48, 72 h, stem cells were collected, and subjected to 10 μL MTS, and then detecting OD490, comparing the cell sensibility to HCgp-39 in all groups. Results OA group: After 24 hours, the mean and standard deviation of cells subjected to 25, 50, 100, 500 ng/mL HCgp-39 were 0.81±0.01, 0.88±0.02, 0.93±0.01, 1.03±0.04, separately; after 72 hours, the mean and standard deviation were 1.02±0.05, 1.12±0.01, 1.21±0.01, 1.28±0.01, separately. When Compared with stem cells without subjecting to HCgp-39, there was no statistically differences; normal group: after 24 hours, the mean and standard deviation were 0.67±0.01, 0.63±0.01, 0.61±0.01, 0.58±0.01; after 72 hours, the mean and standard deviation were 1.18±0.02, 1.1±0, 1.08±0.01, 0.97±0.02; comparing with cells without subjecting to HCgp-39, the differences were statistically significant. Conclusions There are articular cartilage cell proliferation in the adult articular cartilage; HCgp-39 had the promotional effects on proliferation of precartilaginous stem cells.

osteoarthritis; precartilaginous stem cells; human cartilage glycoprotein-39; proliferation of cells

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2010097)。

陳躍平(1970-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣晒穷^缺血壞死的診治。E-mail: chenyueping007@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.001

R684.3

A

1002-266X(2015)01-0001-04

2014-08-22)