劉張玲，胡晶，黃崢蘭，李會，劉毅，馮文莉

AKT抑制劑對慢粒急變期K562細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響及其效應(yīng)觀察

劉張玲，胡晶，黃崢蘭，李會，劉毅，馮文莉

目的探討PI3K-AKT信號通路靶向抑制劑AKTi Ⅳ對慢性粒細(xì)胞白血病(CML)急變期細(xì)胞K562的影響及其對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用。方法取處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，分別加入0、2.5、5、10μmol/L 的AKTi Ⅳ進(jìn)行處理，采用MTT法檢測其對細(xì)胞增殖的影響，甲基纖維素克隆形成實驗檢測細(xì)胞的克隆形成能力，Western blotting檢測K562細(xì)胞中pAKT(Thr308)、pGSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)情況，熒光定量PCR和Western blotting檢測β-catenin及其下游靶基因c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果AKTi Ⅳ作用6、10、16h后，K562細(xì)胞的增殖能力以及克隆形成能力明顯受抑，且作用10h時抑制效果最好。2.5、5、10μmol/L AKTi Ⅳ處理K562細(xì)胞10h后，PI3KAKT通路明顯受到抑制，pAKT(Thr308)蛋白表達(dá)依次減少。5μmol/L AKTi Ⅳ作用K562細(xì)胞10h后，pGSK-3β(Ser9)及β-catenin蛋白表達(dá)明顯減少，而β-catenin mRNA表達(dá)水平無明顯改變。5μmol/L AKTi Ⅳ作用K562細(xì)胞10h后，β-catenin下游靶基因c-myc、cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低。結(jié)論AKTi Ⅳ可抑制慢粒急變期K562細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，其機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路阻斷細(xì)胞的生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

白血病，髓系，慢性，BCR-ABL陽性；β連環(huán)素；Wnt信號通路；K562細(xì)胞

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是起源于造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，以t(9;22)(q34;q11)形成的BCR/ABL融合基因為發(fā)病特征，該基因編碼的BCR/ABL融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性[1]，能激活細(xì)胞內(nèi)多條信號通路，使白血病細(xì)胞惡性增殖、凋亡受阻[2-3]，其中PI3K-AKT、JAK-STAT5、MAPK-ERK、RAS-RAF等為最重要的信號通路，在CML中異?；罨?，與CML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。CML在臨床上分為慢性期、加速期和急變期，絕大部分CML患者最終進(jìn)入急變期，且預(yù)后不良。因此，探明慢粒急變的具體分子機(jī)制具有重要意義。β連環(huán)素(β-catenin)是Wnt信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與造血細(xì)胞的發(fā)育及成熟，決定造血細(xì)胞的自我更新及分化[5]。研究顯示，β-catenin在慢粒急變期患者體內(nèi)的表達(dá)量隨bcr/abl基因的擴(kuò)增而增高，抑制β-catenin表達(dá)能夠降低慢粒的耐藥性并延緩其進(jìn)入急變期[6-7]。但慢粒急變期細(xì)胞中BCR/ABL調(diào)控β-catenin的具體分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究擬探討PI3K-AKT信號通路靶向抑制劑AKTi Ⅳ對慢粒急變期細(xì)胞K562的作用，以明確PI3K-AKT信號通路對慢粒急變期的影響及其對Wnt/β-catenin通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 K562細(xì)胞由本實驗室保存，用含有10%胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。AKTi Ⅳ、總AKT、pAKT(Thr308)、pGSK-3β(Ser9)、總GSK-3β和β-catenin抗體購自美國CST公司，熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，c-myc、cyclin D1抗體購自O(shè)rigene公司，β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自Santa Cruz公司。MTT試劑、甲基纖維素、二甲基亞砜購自Sigma公司。

1.2 MTT法檢測AKTi Ⅳ對K562細(xì)胞增殖能力的影響 取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，按5×103個/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別給予0(PBS處理組)、2.5、5、10μmol/L的AKTi Ⅳ處理，同時設(shè)試劑對照組以減少試劑本身吸光度值對實驗的影響。每組設(shè)5個復(fù)孔。分別培養(yǎng)6、10、16h后，加入50μl 2mg/ml MTT溶液，避光培養(yǎng)4h，2000r/min離心10min，吸棄上清，每孔加入100μl二甲基亞砜，搖勻溶解后，在490nm處測量各孔吸光度(A)值，并按以下公式計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1－(藥物處理組A值－試劑對照組A值)/(PBS處理組A值－試劑對照組A值)]。

1.3 克隆形成實驗檢測AKTi Ⅳ對K562細(xì)胞克隆形成能力的影響 收集處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，分別加入0、2.5、5、10μmol/L的AKTi Ⅳ處理10h，處理后的K562細(xì)胞加入含0.9%甲基纖維素的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)(500個/孔)，每組設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)10d后計數(shù)克隆數(shù)，50個細(xì)胞以上定義為一個集落，比較各組克隆形成數(shù)的差異。

1.4 熒光定量PCR檢測β-catenin、c-myc、cyclin D1 mRNA的表達(dá) 收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，用5μmol/L AKTi Ⅳ處理10h后，常規(guī)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，退火20s(β-catenin 54℃，c-myc 和cyclin D1 51℃)，72℃延伸30s，共39個循環(huán)。65～95℃記錄融解曲線，獲得初始循環(huán)數(shù)(Ct)值，以2-ΔΔCt法計算β-catenin、c-myc、cyclin D1 mRNA的相對表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。

1.5 Western blotting法檢測蛋白水平的表達(dá) 采用0、2.5、5、10μmol/L AKTi Ⅳ處理K562細(xì)胞10h后，提取細(xì)胞總蛋白測定其濃度，經(jīng)8% SDSPAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，分別孵育總AKT、pAKT(Thr308)、pGSK-3β(Ser9)、總GSK-3β和β-catenin抗體，抗體以1:1000稀釋，4℃孵育6～8h，洗膜后，室溫孵育IgG-HRP二抗1h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白表達(dá)情況。采用Quantity One軟件對Western blotting條帶進(jìn)行定量分析。

表1 擴(kuò)增基因引物序列Tab. 1 The sequence of PCR primers for each gene

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AKTi Ⅳ對K562細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，2.5、5、10μmol/L AKTi Ⅳ對K562細(xì)胞生長均有抑制作用，處理后6h即出現(xiàn)明顯的抑制作用，10h時抑制作用最強(qiáng)，16h后抑制效果減弱，表明PI3K-AKT靶向抑制劑處理K562細(xì)胞10h時抑制作用最強(qiáng)(圖1)，藥物處理組與PBS處理組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同濃度AKTi Ⅳ處理K562細(xì)胞6、10、16h后對細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 K562 cells growth treated with different concentrations of AKTi Ⅳ for 6, 10, 16 hours (MTT assay)

2.2 AKTi Ⅳ對K562細(xì)胞克隆形成能力的影響 克隆形成實驗結(jié)果顯示，2.5、5、10μmol/L AKTi Ⅳ處理10h后，K562細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為258±20、164±13、81±16個/孔，與PBS處理組(325±30個/孔)比較明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.3 AKTi Ⅳ對PI3K-AKT信號通路的抑制作用 Western blotting結(jié)果顯示，用2.5、5、10μmol/L AKTi Ⅳ處理K562細(xì)胞10h后，PI3K-AKT信號通路被抑制，pAKT(Thr308)蛋白表達(dá)明顯減少，與PBS處理組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。選擇AKTi Ⅳ的最佳作用濃度5μmol/L處理K562細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4 AKTi Ⅳ對β-catenin mRNA和蛋白及pGSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響 熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)5μmol/L AKTi Ⅳ處理10h后，K562細(xì)胞中β-catenin mRNA表達(dá)水平無明顯改變，與PBS處理組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而β-catenin、pGSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，圖4)。

圖2 AKTi Ⅳ對K562細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig. 2 Effect of AKTi Ⅳ on the colony forming ability of K562 cells

圖3 AKTi Ⅳ處理后K562細(xì)胞中pAKT(Thr308)和總AKT的蛋白表達(dá)變化Fig. 3 The protein levels of pAKT(Thr308) and total AKT in AKTi Ⅳ treated K562 cells (1)P<0.05 compared with 0μmol/L (PBS group)

2.5 AKTi Ⅳ對β-catenin下游靶基因c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)5μmol/L AKTi Ⅳ處理10h后，K562細(xì)胞中c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，與PBS處理組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖4 AKTi Ⅳ處理后K562細(xì)胞中β-catenin mRNA和蛋白及pGSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的變化Fig. 4 Influence of AKTi Ⅳ on the expressions of β-catenin mRNA and protein and pGSK-3β(Ser9) protein in K562 cells (1)P<0.05 compared with 0μmol/L (PBS group)

圖5 AKTi Ⅳ處理后K562細(xì)胞中c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化Fig. 5 The mRNA and protein levels of c-myc and cyclin D1 in K562 cells pre-treated with AKTi Ⅳ(1)P<0.05 compared with 0μmol/L (PBS group)

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路激活發(fā)生于各種類型的白血病中，是白血病細(xì)胞惡性增殖及凋亡受阻的一個重要原因，對于白血病細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有重要的調(diào)控作用[8]。β-catenin是該通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[9]，它在蛋白水平上受Wnt信號蛋白的調(diào)控。通常情況下，β-catenin與軸蛋白(AXIN1)、酪蛋白激酶1(CK1)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、大腸腺瘤息肉(APC)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)GSK-3β 對β-catenin的磷酸化，使β-catenin在胞質(zhì)中發(fā)生蛋白酶體依賴的降解，最終使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離量保持在較低水平[10]。當(dāng)細(xì)胞癌變或者受到刺激時，Wnt信號通路的相關(guān)蛋白無法使β-catenin被磷酸化而降解[11]，導(dǎo)致胞質(zhì)中的β-catenin大量積累并轉(zhuǎn)位入核，與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF-4結(jié)合，激活c-myc、cyclin D1、纖維連接蛋白(fibronectin)等下游效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[12-14]。既往對β-catenin的研究主要集中在BCR/ABL本身與β-catenin的直接或者間接作用，并未從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度探討B(tài)CR/ABL下游信號通路對β-catenin的作用。

PI3K-AKT信號通路是BCR/ABL下游的關(guān)鍵信號通路之一，其持續(xù)激活貫穿于CML病程的各個時期[15]。該通路的重要成分AKT可以通過磷酸化GSK-3β第9位的絲氨酸而使GSK-3β失活，失活的GSK-3β無法使胞質(zhì)中的β-catenin被磷酸化而降解，從而使β-catenin入核增加，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[16]。已有研究證實PI3K-AKT信號通路與β-catenin之間存在一定聯(lián)系[17-19]。Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過PI3KAKT信號通路調(diào)控β-catenin的轉(zhuǎn)錄可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和LN229的生長與增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路可通過調(diào)控β-catenin/GSK-3β的活性而調(diào)節(jié)ZEB1基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[18]。Milward等[19]報道丙型肝炎病毒(HCV)的NS5A蛋白可通過激活PI3K-AKT通路而致GSK-3β失活，從而激活β-catenin，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。因此，我們推測在CML中PI3K-AKT信號通路可能以GSK-3β為連接橋梁調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，從而影響細(xì)胞的增殖與存活。

本研究采用PI3K-AKT信號通路的靶向抑制劑AKTi Ⅳ處理慢粒急變期細(xì)胞K562，觀察其對慢粒細(xì)胞增殖以及克隆形成能力的影響，同時檢測其對β-catenin及其下游靶基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，AKTi Ⅳ可抑制K562細(xì)胞的增殖及克隆形成能力，其原因考慮與抑制β-catenin蛋白的表達(dá)有關(guān)，但本研究中β-catenin mRNA的表達(dá)水平無明顯改變，提示AKT抑制劑從翻譯水平而非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控β-catenin的生物學(xué)活性。同時，AKT抑制劑處理細(xì)胞后，GSK-3β的磷酸化水平降低，使活化的GSK-3β對β-catenin的磷酸化降解能力增強(qiáng)，從而使β-catenin蛋白表達(dá)下降，表明AKT抑制劑可通過抑制AKT的磷酸化而增強(qiáng)GSK-3β的活性，從而降低β-catenin蛋白的表達(dá)。此外，經(jīng)AKTi Ⅳ處理后，Wnt/β-catenin/GSK-3β通路的下游靶分子c-myc、cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯降低，進(jìn)一步說明了在慢粒中PI3K-AKT信號通路對Wnt/β-catenin通路的抑制作用。

綜上所述，本研究從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度在慢粒急變期細(xì)胞中證實PI3K-AKT信號通路的靶向抑制劑AKTi Ⅳ能夠通過活化GSK-3β而抑制Wnt/ β-catenin信號通路的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成，為進(jìn)一步研究CML急變的具體分子機(jī)制提供了新思路。

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Influence of AKT inhibitor on Wnt/β-catenin pathway in chronic myeloid leukemia K562 cells

LIU Zhang-ling, HU Jing, HUANG Zheng-lan, LI Hui, LIU Yi, FENG Wen-li*
Key Laboratory of Medical Diagnostics of Ministry of Education, Faculty of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: fengwlcqmu@sina.com

, E-mail: fengwlcqmu@sina.com
This work was supported by Natural Science Foundation of Chongqing Science and Technology Commission (cstc2012jjA10013)

ObjectiveTo investigate the impact of PI3K-AKT pathway inhibitor (AKTi Ⅳ) on the acute crisis of chronic myeloid leukemia (CML) and its regulatory effect on PI3K-AKT pathway in Wnt/β-catenin signal pathway.MethodsK562 cells were cultured to logarithmic growth phase, and they were treated with 0, 2.5, 5, 10μmol/L AKTi Ⅳ respectively. Cell growth was determined with MTT test. The ability of cell colonization was assessed by colony-forming assay. The protein expression of pAKT (Thr308) and pGSK-3β(Ser9) was determined by Western blotting. The protein expression and mRNA levels of β-catenin and its down-stream targets c-myc and cyclin D1 were analyzed by Western blotting and realtime fluorescence quantitative polymerse chain reaction (Q-PCR), respectively.ResultsCell growth and colony-forming ability of K562 cells were inhibited significantly after treatment with AKTi Ⅳ for 6, 10, 16h, and the best exposure time for K562 cells was 10h. PI3K-AKT pathway was inhibited obviously and the protein level of pAKT (Thr308) was lowered apparently after 2.5, 5, 10μmol/L AKTi Ⅳ treatment. When K562 cells were treated by 5μmol/L AKTi Ⅳ for 10h, pGSK-3β (Ser9) and β-catenin protein levels were lowered significantly, while the mRNA of β-catenin was not affected. The mRNA and protein levels of c-myc and cyclin D1 in the downstream of β-catenin were also decreased obviously after treatment with 5μmol/L AKTi Ⅳ for 10h.ConclusionAKTi Ⅳ can inhibit the proliferation and colony-forming ability of K562 cells in critical stage of CML. The mechanism may be related to down-regulation of expression of Wnt/β-catenin pathway by blocking the signal transduction of cell growth.

leukemia, myelogenous, chronic, BCR-ABL positive; β-catenin; Wnt signaling pathway; K562 cells

R733.722

A

0577-7402(2015)09-0710-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.09.05

2015-01-15；

2015-06-28)

(責(zé)任編輯：李恩江)

重慶市科委自然科學(xué)基金項目(cstc2012jjA10013)

劉張玲，碩士研究生。主要從事白血病發(fā)病機(jī)制及基因治療方面的研究

400016 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室(劉張玲、胡晶、黃崢蘭、李會、劉毅、馮文莉)

馮文莉，E-mail：fengwlcqmu@sina.com