張欣然，劉翠，錢智勇，徐紅梅，郭希民，郭紅延

創(chuàng)傷、燒傷等常導(dǎo)致組織細(xì)胞壞死，皮膚的防御功能遭到破壞，創(chuàng)面感染是其最常見的并發(fā)癥及導(dǎo)致愈合延遲的主要原因[1]。金黃色葡萄球菌是創(chuàng)面感染最常見的病原體，可分泌大量蛋白酶和毒力因子，溶解中性粒細(xì)胞，使創(chuàng)面愈合延遲[2]。已有大量研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過趨化、分化參與創(chuàng)傷組織的修復(fù)[3-4]。人β防御素3(human beta defensins 3，hBD3)與殺菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)均為內(nèi)源性抗菌肽，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌均有較強(qiáng)的殺傷作用[5-6]。前期研究結(jié)果表明，基因重組的rhBD3-BPI融合蛋白具有強(qiáng)烈的抗菌作用和內(nèi)毒素中和活性[7]。本研究利用重組腺病毒載體pAdxsi-BPI-BD3轉(zhuǎn)染鼠胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2，使其能夠分泌具有活性的內(nèi)源性抗菌肽BPI-BD3，并在動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，以期為大面積創(chuàng)傷、燒傷后感染的防治提供一種新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和主要試劑 KM小鼠30只，雌雄各半，體重30±3g(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。重組腺病毒載體pAdxsi-BPI-BD3、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、C3H10T1/2細(xì)胞(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所全軍干細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)；胎牛血清(FBS)、α-MEM培養(yǎng)基、胰酶(美國Gibco公司)；預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、BCA蛋白定量Kit(Thermo公司，美國)；兔抗人BPI、兔抗人hBD3(美國Santa Cruz公司)；β-actin(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒、蛋白濃縮試劑盒(北京普利萊試劑公司)；創(chuàng)面塑料圈自行制備；血常規(guī)分析儀(日本Sysmex公司)熒光倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.2 重組腺病毒pAdxsi-BPI-BD3轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞的初步研究

1.2.1 C3H10T1/2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染前1d將C3H10T1/2細(xì)胞按5×105個(gè)接種于75cm2培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞長至50%～60%融合時(shí)，以pAdxsi-BPI-BD3轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，并以未轉(zhuǎn)染的C3H10T1/2為對(duì)照，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后更換含10%FBS的α-MEM，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.2.2 RT-PCR法檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后的表達(dá) 轉(zhuǎn)染72h后，棄上清收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以BPIBD3為目的基因，進(jìn)行PCR反應(yīng)。參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)BPI-BD3引物，BPI-BD3上游引物為：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'；下游引物P5：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為750bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 20s、51℃ 20s、72℃ 20s，35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.3 Western blotting法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后的表達(dá) 轉(zhuǎn)染72h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。按蛋白濃縮試劑盒說明對(duì)細(xì)胞上清蛋白進(jìn)行濃縮，BCA法測蛋白濃度，變性后行SDSPAGE電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2h后，分別滴加BD3、BPI兔抗人多克隆抗體(1:200)，并以β-actin(1:1000)為對(duì)照，4℃封閉過夜，TBST洗膜，再以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉2h；ECL發(fā)光試劑盒顯色，掃描分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 感染創(chuàng)面模型制備及指標(biāo)觀察

1.3.1 感染模型制備及分組 參照文獻(xiàn)[8]制備金黃色葡萄球菌感染模型，小鼠背部備皮，打孔器在其背部制作一直徑1cm的圓形皮膚全層缺損創(chuàng)面，以3-0線間斷縫合塑料圈于創(chuàng)緣外4～5mm處深部肌肉，取對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌菌液0.1ml(1×109cfu/ml)均勻涂抹于整個(gè)創(chuàng)面，無菌紗布及繃帶包扎。30只KM小鼠隨機(jī)均分為3組：T組注射pAdxsi-BPI-BD3轉(zhuǎn)染的C3H10T1/2細(xì)胞；C組注射正常的C3H10T1/2細(xì)胞；N組注射等量PBS。接受細(xì)胞注射的小鼠于創(chuàng)傷后4h內(nèi)在無菌條件下通過尾靜脈注射細(xì)胞，濃度5×106個(gè)/ml，注射量200μl。

1.3.2 一般情況觀察 術(shù)后動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每周更換2次紗布，觀察其活動(dòng)、進(jìn)食、創(chuàng)面大小、感染程度和有無化膿等。

1.3.3 痂下菌量測量 傷后3、7d，無菌條件下取痂下組織100mg后置玻璃勻漿器中研磨，加入無菌PBS后混勻，取10μl用PBS行10倍倍比稀釋后，取10μl分別涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃孵育過夜后，選取目的菌進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。該小鼠每克組織的菌落數(shù)(個(gè)/g)=計(jì)數(shù)菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1000。

1.3.4 創(chuàng)面愈合速度 以創(chuàng)面殘留百分比進(jìn)行計(jì)算。分別于致傷后0、3、7、10、14d對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行照相，并將圖片輸入計(jì)算機(jī)，運(yùn)用Image J圖像分析軟件測量創(chuàng)面面積，計(jì)算殘留面積百分比(殘留面積百分比=殘留面積/原始面積×100%)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。痂皮脫落和上皮完全形成時(shí)，視為傷口愈合。盡管毛發(fā)未長好時(shí)，也視其殘余面積為零。

1.3.5 常規(guī)HE染色觀察 于創(chuàng)傷后3、7、14d，每組分別取創(chuàng)緣與正常交界處組織，用4%多聚甲醛固定，隨后用石蠟將創(chuàng)面組織標(biāo)本包埋、切片，片厚4μm。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察創(chuàng)面皮膚動(dòng)態(tài)愈合、毛囊再生、炎性浸潤情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析進(jìn)行分析。計(jì)量資料以s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒pAdxsi-BPI-BD3轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后的初步鑒定 RT-PCR結(jié)果表明，pAdxsi-BPIBD3轉(zhuǎn)染后72h，獲得與目的基因BPI-BD3長度一致的產(chǎn)物，大小750bp，而未轉(zhuǎn)染pAdxsi-BPI-BD3的細(xì)胞，其BPI-BD3表達(dá)為陰性(圖1A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，BPI-BD3融合蛋白在C3H10T1/2細(xì)胞中成功表達(dá)(圖1B)。

圖1 C3H10T1/2細(xì)胞BPI-BD3表達(dá)檢測Fig.1 Expression of BPI-BD3 in C3H10T1/2 cells

2.2 整體情況觀察 致傷后3d，注射PBS組(N組)、正常C3H10T1/2組(C組)和轉(zhuǎn)染腺病毒組(T組)創(chuàng)面殘留面積大體觀察沒有明顯變化，創(chuàng)緣紅腫，伴有滲出，創(chuàng)面呈感染征象；N組、C組有明顯的痂下膿腫，T組感染較輕。7d后，T組創(chuàng)緣紅腫基本消退，殘留面積明顯縮小，感染程度減輕；N組、C組仍可見紅腫，并有液體滲出。14d后，T組創(chuàng)面基本愈合，盡管毛發(fā)未長好，一旦結(jié)痂脫落，上皮形成，就視為傷口愈合；而N組、C組仍有明顯的創(chuàng)面，但C組創(chuàng)面殘留面積小于N組(圖2)。

2.3 痂下細(xì)菌計(jì)數(shù) 傷后3、7d時(shí)，無菌條件下取痂下組織100mg，稀釋后進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)后顯示，3d時(shí)，T組痂下菌量明顯低于N組、C組(P＜0.05)，7d時(shí)，各組菌量均下降，但T組菌量仍明顯低于N組、C組(P＜0.05，圖3)。

2.4 創(chuàng)面愈合速度 通過比較各組不同時(shí)點(diǎn)殘留面積百分比來分析各組創(chuàng)面愈合速度，結(jié)果顯示，傷后3d，N組、C組和T組創(chuàng)面殘留面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，7、14d后，T組殘留面積百分比明顯小于N組、C組(P＜0.05，圖4)。

圖2 感染后各組創(chuàng)面大體情況Fig.2 Representative pictures of wound healing after infection

圖3 各組傷后不同時(shí)間點(diǎn)痂下細(xì)菌計(jì)數(shù)的比較Fig.3 Comparison of bacterial count under the scar at different time point of each group

圖4 各組傷后不同時(shí)間點(diǎn)殘留面積百分比比較Fig.4 Comparison of percentage of residual wound area at different time point of each group

2.5 皮膚創(chuàng)面組織的病理學(xué)觀察 感染7d后，N組與C組表面仍可見由細(xì)胞碎片、滲出物和細(xì)菌等構(gòu)成的壞死層，壞死層下有大量炎細(xì)胞浸潤，液體滲出，而T組炎癥較輕，且創(chuàng)緣開始有新生表皮向創(chuàng)面移行生長。感染14d后，T組新生上皮進(jìn)一步增多，創(chuàng)面完全被新生的上皮組織覆蓋并有再生的皮膚附件產(chǎn)生，C組上皮基本覆蓋創(chuàng)面，但無皮膚附件產(chǎn)生，N組上皮仍未連續(xù)，修復(fù)情況明顯較其余兩組差(圖5)。

圖5 創(chuàng)緣組織切片觀察(HE ×100)Fig.5 Histopathological examination of wound area (HE×100)

3 討 論

大面積皮膚創(chuàng)傷或燒傷等會(huì)引起局部皮膚全層損傷，并常伴有感染，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲。感染可造成修復(fù)細(xì)胞的數(shù)量及功能均顯著下降，這是阻礙創(chuàng)面愈合的主要原因[9]。研究表明，每克組織中，任何種類微生物≥106時(shí)，與愈合受損密切相關(guān)[10]。傳統(tǒng)的抗感染方法分為局部應(yīng)用化學(xué)消毒劑[11]及全身應(yīng)用抗生素，效果均不理想。局部化學(xué)消毒劑的有效濃度難以保持，抗生素的應(yīng)用所面臨的問題更為嚴(yán)峻。近年來，細(xì)菌耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)抗生素治療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在尋找新的抗感染策略過程中，內(nèi)源性抗生物多肽家族引起了各國學(xué)者的極大興趣，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制提示其作為新型抗菌藥物應(yīng)用于臨床將發(fā)揮重要的作用[12]。

hBD3作為一種內(nèi)源性抗菌肽，在人體皮膚、黏膜中廣泛存在。當(dāng)這些部位受到炎癥刺激時(shí)，hBD3被大量誘導(dǎo)表達(dá)并釋放，從而發(fā)揮抗感染作用[13]。我們根據(jù)hBD3分子量較小，抗革蘭陽性菌較強(qiáng)的特點(diǎn)，將hBD3與另一種同樣具有抗菌作用的蛋白BPI融合表達(dá)。BPI是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的既能非特異性殺傷革蘭陰性菌，又能中和內(nèi)毒素，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗菌物質(zhì)[14]。因此我們將BPI較強(qiáng)的抗革蘭陰性菌性能與hBD3較強(qiáng)的抗革蘭陽性菌性能相結(jié)合，使表達(dá)產(chǎn)物具有更廣泛的抗菌譜和更強(qiáng)的抗菌活性。正常人體中BPI以及hBD3含量較少，通過分離提純獲得生物活性較高的抗菌肽有一定的技術(shù)難度，同時(shí)化學(xué)合成成本高，使用劑量大，費(fèi)用昂貴。因此，我們?cè)O(shè)想可利用轉(zhuǎn)基因等細(xì)胞修飾和改造技術(shù)，尋找一種即能高表達(dá)BPI-BD3融合蛋白，又能促進(jìn)創(chuàng)面愈合的細(xì)胞載體，賦予其新的特性并加以利用。

已有大量研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞是良好的種子細(xì)胞，能夠移行到創(chuàng)傷或炎癥部位，向成纖維細(xì)胞、肌肉和神經(jīng)細(xì)胞等分化，參與受損組織的再生與重建，分泌有關(guān)的細(xì)胞因子和生長因子，參與創(chuàng)面愈合[15]。C3H10T1/2作為胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞系，可分化為骨、軟骨、脂肪等細(xì)胞，在剪切力作用下可分化為內(nèi)皮細(xì)胞[16]，并且能夠遷移至創(chuàng)傷或炎癥部位，分泌各種生長因子，促進(jìn)受損細(xì)胞的恢復(fù)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與抗炎作用[17]，是一種良好的修復(fù)細(xì)胞和(或)外源基因的表達(dá)載體。因此，本研究通過BPI-BD3腺病毒表達(dá)載體，將BPI-BD3轉(zhuǎn)染至C3H10T1/2細(xì)胞中，使其高表達(dá)BPI-BD3并用于感染創(chuàng)面，發(fā)揮BPI-BD3強(qiáng)大的抗菌效應(yīng)以及C3H10T1/2的修復(fù)作用，以更好地促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

本實(shí)驗(yàn)中，我們使用重組腺病毒pAdxsi-BPIBD3轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后，RT-PCR可見有750bp的特異片段，表明腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞C3H10T1/2后，有外源性BPI-BD3的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示，重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，BPI-BD3可以分泌蛋白的形式在細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)，說明腺病毒載體pAdxsi-BPI-BD3轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞可有效表達(dá)目的基因。我們期望重組腺病毒載體修飾的C3H10T1/2細(xì)胞應(yīng)用到動(dòng)物感染創(chuàng)面時(shí)，可持續(xù)分泌BPI-BD3，促進(jìn)肉芽組織形成，提高機(jī)體免疫能力，很好地發(fā)揮抗菌及促愈效果。

此外，我們進(jìn)一步制作了小鼠全層皮膚缺損模型，并于傷后即刻在創(chuàng)面上滴加金黃色葡萄球菌液，制成創(chuàng)傷感染模型。將轉(zhuǎn)染BPI-BD3重組腺病毒載體的C3H10T1/2(T組)通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，T組3、7d痂下菌量明顯少于C組、N組，可能與BPI及hBD3調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，提高機(jī)體防御能力，在創(chuàng)面局部起到殺菌作用有關(guān)。3d時(shí)，T組和C組創(chuàng)面及殘留面積無明顯差異，N組可見創(chuàng)面感染現(xiàn)象，各組創(chuàng)面殘留面積無明顯差異；7、14d時(shí)，T組感染較另兩組明顯較輕，殘留面積也明顯減少。HE染色同樣顯示，7d時(shí)T組創(chuàng)面就有一薄層上皮覆蓋，14d時(shí)，創(chuàng)面完全被上皮覆蓋并有皮膚附件再生。我們推測BPI-BD3修飾的C3H10T1/2促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能為：①C3H10T1/2具有趨化作用，可趨化至創(chuàng)面，并分化為皮膚組織的各種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，參與創(chuàng)面修復(fù)[18]；②hBD3與BPI強(qiáng)大的抗菌作用，降低了創(chuàng)面的感染程度，促進(jìn)傷口愈合；③BPI是唯一可中和內(nèi)毒素，與細(xì)菌脂多糖結(jié)合的蛋白，在感染性疾病中有重要的臨床意義；④BPI-BD3不受鹽濃度的影響，使其在微環(huán)境改變的情況下仍能保持其抗菌活性；⑤防御素hBD3在參與創(chuàng)面愈合過程中，能促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子等的表達(dá)，促進(jìn)血管生成[19]。

BPI-BD3修飾的C3H10T1/2細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能是多方面的，本課題組下一階段將在體內(nèi)示蹤和分化等方面進(jìn)一步深入研究，并闡明BPIBD3在創(chuàng)緣表面表達(dá)量與細(xì)胞注射劑量的相關(guān)性，從而為大面積創(chuàng)傷、燒傷后感染的預(yù)防及治療提供新的途徑和方法。

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