陳思偉，唐哲，劉莉，鄒志鵬，陳育堯，林曉春

小兒腹瀉外敷散對腹瀉大鼠小腸Cajal細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及血管活性腸肽受體1表達(dá)的影響

陳思偉，唐哲，劉莉，鄒志鵬，陳育堯，林曉春

目的探討小兒腹瀉外敷散對腹瀉大鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)和血管活性腸肽受體1(VIP-R1)表達(dá)的影響。方法30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、藥物組，每組10只。采用番瀉葉水煎液灌胃(2ml/100g)的方法建立腹瀉模型，藥物組給予小兒腹瀉外敷散貼敷。采用透射電鏡觀察藥物對腹瀉大鼠小腸ICC超微結(jié)構(gòu)的影響，免疫組化法觀察VIP-R1在腹瀉大鼠小腸內(nèi)的分布，RT-PCR和Western blotting測定VIP-R1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果藥物貼敷可使ICC形態(tài)和縫隙連接基本恢復(fù)正常。VIP-R1主要分布在小腸組織環(huán)形肌與縱形肌之間、小腸組織肌間神經(jīng)叢處、結(jié)腸黏膜層上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞的周圍。小兒腹瀉外敷散可抑制VIP-R1分泌并下調(diào)VIP-R1 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)論小兒腹瀉外敷散可修復(fù)腹瀉大鼠損傷的ICC細(xì)胞，同時可通過下調(diào)VIP-R1表達(dá)而治療腹瀉。

小兒腹瀉外敷散；腹瀉；Cajal小腸細(xì)胞；受體，血管活性腸多肽，Ⅰ型

“小兒腹瀉外敷散”收載于《中國藥典》，由丁香、肉桂、吳茱萸、胡椒組成，具有溫中散寒、止痛止瀉之功，外敷臍部，用于小兒脾胃虛寒所致泄瀉。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腹瀉與胃腸動力紊亂有關(guān)，胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是胃腸平滑肌的起搏細(xì)胞，能產(chǎn)生胃腸道慢波，控制平滑肌收縮節(jié)律、蠕動方向和速度[1]。血管活性腸肽(VIP)為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與胃腸道的血管活性腸肽受體1(VIP-R1)結(jié)合后，可激活cAMP依賴性蛋白激酶，對胃腸運(yùn)動起調(diào)節(jié)作用。VIP-R1也是目前發(fā)現(xiàn)的胃腸道ICC細(xì)胞膜上的主要受體之一[2]。本研究觀察了小兒腹瀉外敷散對番瀉葉所致脾虛泄瀉大鼠小腸組織ICC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及VIP-R1表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及主要儀器 SPF級雄性Wistar大鼠30只，3～4周齡，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供[許可證號scxk(粵)2011-0015]。透射電子顯微鏡(Hitachi，H-7500，日本)，石蠟切片機(jī)(Leica，德國)，蛋白紫外分光光度計(Eppendorf，德國)，iQTM5多重實(shí)時熒光定量PCR儀、Mini-PROTEAN垂直電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.2 主要藥品與試劑 小兒腹瀉外敷散貼敷劑(自制，吳茱萸9份、胡椒6份，丁香6份、肉桂6份，粉碎成細(xì)粉，混勻，臨用前取藥粉0.4g，以食醋l0ml調(diào)和成直徑1cm大小的藥餅)。VIP-R1抗體(Biorbyt orb100402，100μg)，免疫組化二步法EnvisionTM試劑盒(丹麥DAKO公司)，總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Trizol試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒(廣州貝奧吉因生物科技有限公司)，β-actin(美國Santa Cruz)，兔抗羊IgG-HRP、SuperSignal? West Dura Extended Duration Substrate (美國Pierce)，RNase-Free DNase Ⅰ(美國Qiagen)，Power SYBR? Master Mix(美國Invitrogen)，甲醇、冰乙酸等常規(guī)試劑購于華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.3 動物分組 30只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、藥物組，每組10只。大鼠單籠飼養(yǎng)，籠底墊有濾紙，對照組采用蒸餾水灌胃，其余兩組先用20%番瀉葉水煎液灌胃，劑量2ml/100g，4d后形成虛瀉模型。藥物組大鼠從第5天開始敷藥，連續(xù)5d，1次/d，其中敷藥4d后，將大鼠饑餓12h，至第5天最后一次敷藥后處死。

1.4 透射電鏡觀測ICC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗大鼠處死后，迅速取距幽門2.5cm的上段小腸，沿系膜緣剖開去除內(nèi)容物，切成0.1cm×0.1cm大小片段，于2.5%戊二醛中固定。標(biāo)本固定后切成小塊，PBS漂洗，1%鋨酸后固定，PBS漂洗，脫水，Spurr樹脂滲透包埋，半薄切片，2%甲苯胺藍(lán)染色，定位，超薄切片，載于200目或400目銅柵網(wǎng)上。鈾-鉛雙染色，置于電子透射電鏡下觀測。

1.5 免疫組化法觀察VIP-R1在小腸內(nèi)的分布4%多聚甲醛緩沖液固定組織標(biāo)本，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，3%H2O2PBS溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗(稀釋度為1:100)，37℃下孵育60min。PBS洗3次，滴加山羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育40min，PBS沖洗3次，DAB顯色液顯色3min，Harris蘇木素液復(fù)染1min， 95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽性反應(yīng)。

1.6 Real-time PCR法測定VIP-R1 mRNA表達(dá)水平小腸組織充分研磨后取80mg提取總DNA，采用分光光度計測定含量和純度。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：30℃ 10min，42℃ 30min，70℃ 15min。采用Primer Premier 6.0和Beacon Designer 7.8軟件進(jìn)行定量PCR引物設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。VIP-R1(基因序列號NM_012685.2)：上游5'-GTGCAAGGCAGCGGTGGTTTTCT-3'，下游5'-GAGACGGCCAGCAGGGTGTAT-3'，擴(kuò)增片段長度99bp。內(nèi)參18S(基因序列號M11188)：上游5'-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3'，下游5'-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3'，擴(kuò)增片段長度105bp。采用25μl擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件：95℃ 1min；95℃ 10s；64℃ 25s(收集熒光)，40個循環(huán)。熔點(diǎn)曲線分析55～95℃。各基因相對表達(dá)水平以2–ΔΔCt表示。

1.7 Western blotting檢測VIP-R1蛋白表達(dá) 提取小腸組織總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。T-TBS(含5%脫脂奶粉)室溫封閉1h，T-TBS漂洗，加anti-VIP-R1一抗(1:500)4℃孵育過夜，兔抗羊IgG-HRP二抗(1:5000)，室溫1h，上述各步驟間均以T-TBS洗膜。加入發(fā)光劑，曝光，顯影。采用Bandscan 5.0軟件分析條帶光密度值(A)，以β-actin為內(nèi)參計算VIP-R1的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡觀測ICC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 對照組ICC細(xì)胞多分布于環(huán)形肌與縱行肌之間、環(huán)行肌與縱行肌肌束內(nèi)以及環(huán)形肌與腸肌神經(jīng)叢內(nèi)。ICC區(qū)別于平滑肌細(xì)胞，多呈紡錘形或者不規(guī)則形，基膜完整，細(xì)胞核大，核周胞質(zhì)較少。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等。ICC細(xì)胞之間以及ICC與平滑肌之間通過突起及縫隙相互連接，共同發(fā)揮對胃腸道的調(diào)節(jié)作用。模型組ICC細(xì)胞皺縮，突起減少或者明顯消失，細(xì)胞膜不連續(xù)，細(xì)胞質(zhì)形成空泡，出現(xiàn)核周隙，異染色質(zhì)匯聚于核膜下，細(xì)胞器數(shù)量減少。ICC與肌纖維細(xì)胞之間間隙加大，連接松散。ICC之間以及ICC與肌細(xì)胞之間連接縫隙變小或者消失。治療組ICC細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)較好，有少量空泡，突起損傷不明顯。部分細(xì)胞異染色質(zhì)有些趨邊，明顯好于模型組。ICC之間、ICC與肌纖維細(xì)胞之間縫隙連接仍然存在(圖1)。

2.2 免疫組化法觀察VIP-R1在小腸內(nèi)的分布 VIPR1表達(dá)部位主要集中在小腸組織環(huán)形肌與縱形肌之間、肌間神經(jīng)叢處、結(jié)腸黏膜層上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞核的周圍(圖2)。

2.3 VIP-R1 mRNA及蛋白表達(dá)的檢測 模型組大鼠小腸組織VIP-R1 mRNA及蛋白表達(dá)水平(分別為30.44±2.19，23.92±1.07)與對照組(分別為10.20±0.82，12.89±0.76)比較明顯上調(diào)，而治療組VIP-R1 mRNA及蛋白表達(dá)水平(分別為16.40±1.31，17.18±1.28)與模型組比較顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)，提示番瀉葉所致大鼠脾虛腹瀉可能與VIP-R1水平增加有關(guān)。

圖1 藥物對腹瀉大鼠小腸ICC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of the drug on ultrastructure of ICC in the small intestine of diarrheic rats

圖2 藥物對腹瀉大鼠小腸VIP-R1表達(dá)的影響(免疫組化×100)Fig.2 Effect of the drug on the expression of VIP-R1 in the small intestine of diarrheic rats by immunohistochemistry (×100)

圖3 藥物對腹瀉大鼠小腸VIP-R1 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of the drug on the expression of VIP-R1 mRNA (A) and protein (B) in the small intestine of diarrheic rats

3 討 論

小兒腹瀉外敷散中所含藥物均為溫里藥，用于脾胃虛寒、運(yùn)化失調(diào)所致的寒瀉、虛瀉。番瀉葉作為大腸的緩瀉劑，其所致腹瀉緩和，糞便稀溏而無異臭，近似寒瀉、虛瀉。故用此泄瀉模型，可以觀察到溫里方藥的溫中止瀉功效[3]。

近年來的研究表明，胃腸道內(nèi)的ICC是胃腸平滑肌的起搏細(xì)胞，能產(chǎn)生胃腸道慢波，而慢波頻率被認(rèn)為是反映完整肌肉起搏活動的指標(biāo)。ICC有多個突起，相互連接成網(wǎng)絡(luò)狀，與壁內(nèi)神經(jīng)及平滑肌間存在密切聯(lián)系。目前普遍認(rèn)為胃腸神經(jīng)、ICC以及平滑肌細(xì)胞間形成的網(wǎng)絡(luò)狀連接是胃腸動力的基本功能單位[4]。ICC數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)損傷可引發(fā)多種胃腸運(yùn)動疾病[5-7]。本實(shí)驗中，小兒腹瀉外敷散可修復(fù)損傷的ICC以及ICC與肌細(xì)胞間的連接，使胃腸動力恢復(fù)正常。

VIP廣泛分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道肌間、黏膜下神經(jīng)叢，既可作為神經(jīng)遞質(zhì)又可作為胃腸激素，影響消化道分泌和胃腸道平滑運(yùn)動[8]。VIP-R1是VIP受體家族的一種亞型，是G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布于外周組織如肺、小腸、肝、脾等[9-11]，也是目前所知的ICC細(xì)胞膜上的主要受體之一。有研究表明，番瀉葉所致脾虛寒瀉的發(fā)病機(jī)制與結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞水通道蛋白(AQPs)的表達(dá)發(fā)生明顯改變有關(guān)[12]。針對AQPs表達(dá)調(diào)控的研究表明，VIP是調(diào)控人結(jié)腸上皮細(xì)胞AQPs表達(dá)的主要腦-腸肽物質(zhì)之一[13]，VIP-R1與VIP具有高親和力，二者結(jié)合后激活G蛋白偶聯(lián)受體，可能通過cAMP-PKA跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響了AQPs的表達(dá)[14]。小兒腹瀉外敷散可使VIP-R1表達(dá)下調(diào)，減輕對AQPs的影響，使結(jié)腸內(nèi)水液轉(zhuǎn)運(yùn)功能得以恢復(fù)，并降低內(nèi)臟敏感性的異常，從而發(fā)揮治療作用，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步驗證。

[1] Kim HK, Choi YH, Erkelens C,et al. Metabolic fingerprinting of Ephedra species using1H-NMR spectroscopy and principal component analysis[J]. Chem Pharm Bull, 2005, 53(1): 105-109.

[2] Liang GG. Morphological changes in network of enteric nerveinterstitial cells of Cajal-smooth muscle in Yang Ming Fu Shi syndrome and therapeutic mechanism of purgative therapy[D]. Dalian: Dalian Medical University, 2010. [梁國剛. 陽明腑實(shí)證大鼠小腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)的損傷和下法施治機(jī)制研究[D]. 大連: 大連醫(yī)科大學(xué), 2010.]

[3] Wei W. Experimental methodology of pharmacology[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 2010. 1124-1125. [魏偉. 藥理實(shí)驗方法學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010. 1124-1125.]

[4] Lian ZC, Lian F, Zhang SZ. Great progress of gastrointestinal dynamics-expectation of research states and clinical significance of interstitial cells of Cajal[J]. Med Healthc Appa, 2006, 4(1): 4-6. [連至誠, 連帆, 張書征. 胃腸動力學(xué)重大進(jìn)展—胃腸起搏者Cajal間質(zhì)細(xì)胞研究狀況與臨床意義展望[J]. 醫(yī)療保健器具, 2006, 4(1): 4-6.]

[5] Wu GJ, Luo Y, Lin L. Role of heme oxygenase and interstitial cells of Cajal in colonic dysmotility of diabetic rats[J]. Chin J Gastroenterol, 2010, 15(3): 133-138. [吳高玨, 羅云, 林琳. 血紅素氧合酶與Cajal間質(zhì)細(xì)胞在糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙中的作用[J]. 胃腸病學(xué), 2010, 15(3): 133-138.]

[6] Liang GG, Li Y, Qi QH. Ultrastructure characters of enteric nerve- interstitial cells of Cajal- smooth muscle cells network in rats [J]. J Dalian Med Univ, 2009, 31(1): 5-8. [梁國剛, 李毅, 齊清會. 大鼠小腸神經(jīng)-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2009, 31(1)5-8.]

[7] Wu QY, Lin ZL, Wu MX,et al. Alterations of interstitial cells of Cajal and connexin 43 in stomach of hemorrhagic shock rats before and after resuscitation[J]. Chin J Gen Surg, 2013, 22 (2): 165-169. [吳巧藝, 林振呂, 吳敏霞, 等. 失血性休克大鼠復(fù)蘇前后胃Cajal 間質(zhì)細(xì)胞及Cx43的變化[J]. 中國普通外科雜志, 2013, 22(2): 165-169.]

[8] Zhou L, Ke MY. Textbook of gastrointestinal motility-basic and clinical aspects[M]. Beijing: Science Press, 1999. 4.[周呂, 柯美云. 胃腸動力學(xué)基礎(chǔ)與臨床[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999. 4.]

[9] Shi YH, Tan TZ. Research status of VIP receptor[J]. Foreign Med Sci Radio Med Nucl Med, 1998, 22(4):148-152. [史育紅,譚天秩. 血管活性腸肽受體研究現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)學(xué)放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊, 1998, 22(4): 148-152.]

[10] Li RF, Wang DS, Wang YJ,et al. Pinaverium bromide for diarrhea- predominant irritable bowel syndrome rat model with colonic tissue vasoactive intestinal peptide and its expression of receptor 1[J]. Chin J Integr Tradit West Med Dig, 2010, 18(2): 89-92. [李任鋒, 王德山, 王艷杰, 等. 匹維溴胺對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸組織血管活性腸肽及受體1表達(dá)的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2010, 18(2): 89-92.]

[11] Xu HJ. The influence of Tong Xie Yao Fang to D-IBS model rats' colon tissue's VIP, VIP1-R, AQP8[D]. Shenyang: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2012. 5. [許惠娟.痛瀉藥方對D-IBS模型大鼠結(jié)腸VIP及AQP8表達(dá)的影響[D].沈陽: 遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 2012. 5.]

[12] Wang DS, Wang YJ, Liu HH. Effects of eye-acupuncture therapy on VIPR1 expression in irritable bowel syndrome model rats [J]. Chin J Gerontol, 2013, 33(3): 1076-1079. [王德山, 王艷杰, 劉慧慧. 眼針療法對D-IBS模型大鼠結(jié)腸VIPR1表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(3): 1076-1079.]

[13] Feng J, Wang JP, Jia ZM. Regulation of AQP8 expression in HT29 cells by VIP[J] .Chin J Mod Med, 2007, 19(17): 2345-2348. [馮璟, 王俊平, 賈澤明. 血管活性腸肽 VIP 對人結(jié)腸上皮細(xì)胞系HT29 細(xì)胞AQP8 表達(dá)調(diào)節(jié)的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 19(17): 2345-2348.]

[14] Gradilone SA, Garcia F, Huebert RC. Glucagon induce the plasma mem-brane insertion of functional aquaporin-8 water channel in isolated rat hepatocytes[J]. Hepatology, 2003, 37(6): 1435-1441.

Effect of Xiaoer Fuxie Waifu powder on the ultrastructure of intestinal Cajal cells and expression of neurotransmitter receptor VIP-R1 in rats with diarrhea

CHEN Si-wei1, TANG Zhe2, LIU Li1*, ZOU Zhi-peng1, CHEN Yu-yao1, LIN Xiao-chun11School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
2Department of Pharmacy, 303 Hospital of PLA, Nanning 530021, China

*Corresponding author, E-mail: shyshll@163.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81102823)

ObjectiveTo investigate the effect ofXiaoer Fuxie Waifupowder on intestinal Cajal cells (ICC) and the expression of vasoactive peptide receptor 1 (VIP-R1) in rats with diarrhea.MethodsThirty Wistar rats were divided randomly into three groups: control group, model group, and treatment group (10 each).Folium sennae(2ml/100g) was gavaged to reproduce the diarrheal model.Xiaoer Fuxie Waifupowder was applied topically in the treatment group. Transmission electron microscope was used to observe the changes in ultrastructure of ICC after application of the drug. Immunohistochemistry was used to observe the distribution of VIP-R1 in the intestine of diarrheic rats. RT-PCR and Western blotting were used to determine the expressions of mRNA and protein of VIP-R1.ResultsThe ultrastructure of ICC showed that the drug treatment could normalize the cellular morphology and gap junction. VIP-R1 was found to be distributed mainly between circular muscle and longitudinal muscle, in the myenteric nerve plexus of the small intestine, and was found around the epithelial cells in the mucosal layer of the colon and lamina propria cells.Xiaoer Fuxie Waifupowder inhibited the secretion of VIP-R1 and down-regulated the mRNA and protein expression of VIP-R1. ConclusionXiaoer Fuxie Waifupowder can repair the injured ICC of diarrheic rats and cure diarrhea by down-regulating the expression of VIP-R1.

Xiaoer Fuxie Waifupower; diarrhea; interstitial cells of Cajal; receptors, vasoactive intestinal polypeptide, type Ⅰ

R285.5；R442.2

A

0577-7402(2015)01-0022-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.05

2014-05-13；

2014-07-22)

(責(zé)任編輯：李恩江)

國家自然科學(xué)基金(81102823)

陳思偉，碩士研究生。主要從事藥理學(xué)與制劑學(xué)方面的研究

510515 廣州 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院(陳思偉、劉莉、鄒志鵬、陳育堯、林曉春)；530021 南寧 解放軍303醫(yī)院藥劑科(唐哲)

]劉莉，E-mail：shyshll@163.com