李明軍，李英夫，吳 雁，楊福義，王維峰，宣兆博

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.中科院國家納米中心，北京 100000)

氰基丙烯酸正丁酯納米載體促進(jìn)紫杉醇?？鼓X膠質(zhì)瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究①

李明軍1，李英夫1，吳 雁2，楊福義1，王維峰1，宣兆博1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.中科院國家納米中心，北京 100000)

目的：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平研究聚氰基丙烯酸正丁酯納米載體促進(jìn)紫杉醇?？鼓X膠質(zhì)瘤的作用。方法：①紫杉醇-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒懸液的制備。②制備膠質(zhì)瘤模型，制備的膠質(zhì)瘤模型隨機(jī)分成四組，每組20只，Ⅰ組注射生理鹽水、Ⅱ組注射紫杉醇、Ⅲ組注射PBCA+NP、Ⅳ組注射紫杉醇+PBCA+NP，15d后觀察Wistar大鼠的變化，觀察腫瘤病理切片，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果：①Wistar大鼠的生存狀態(tài)，Ⅳ組好于其它三組。②Ⅱ組和Ⅲ組Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤血管的減少和壞死腫瘤組織比Ⅳ組少。③Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤調(diào)亡率Ⅳ組高于Ⅱ組、Ⅲ組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。結(jié)論：聚氰基丙烯酸正丁酯納米載體明顯提高紫杉醇抗Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤的作用。

聚氰基丙烯酸正丁酯紫杉醇;SHG-44;Wistar大鼠；病理

紫杉醇是天然抗腫瘤藥物，提取于紅豆杉的樹干和樹皮，對(duì)卵巢癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤療效明顯，紫杉醇在水中溶解度低，影響其療效，為提高其溶解度，采用溶解在聚氧乙烯蓖麻油內(nèi)，也可溶解在乙醇內(nèi)，雖然溶解度提高了，但給藥后副作用明顯增加，本課題組曾進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究紫杉醇對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制作用，為提高其療效，對(duì)其給藥方式進(jìn)行了有益的探索，近年來隨著納米技術(shù)的發(fā)展，為臨床給藥開辟了新的途徑，由于納米載體毒副作用較小，而且能夠降解，納米載體具有靶向性，由于這一特性，增加了藥物的療效，具有很好的臨床應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)在Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型成功建立后，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平，觀察紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的抗膠質(zhì)瘤作用，得到了很好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar雌性大鼠100只,體重350～500g,購于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SanyoCO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)等，光學(xué)顯微鏡，流式細(xì)胞儀，立體定向儀，SHG-44細(xì)胞株[1～4]。

1.1.1 腦膠質(zhì)瘤模型的制備

①SHG-44細(xì)胞懸液的制備SHG-44來源于人額葉星形膠質(zhì)瘤的穩(wěn)定培養(yǎng)，具有特異性標(biāo)志膠質(zhì)酸性纖維蛋白(GFAP)，SHG-44是目前較理想的細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定的培養(yǎng)，并在Wistar大鼠尾狀核區(qū)成功植入，將復(fù)蘇成功的SHG-44細(xì)胞株，放于50cm2培養(yǎng)瓶中接種，DMEM培養(yǎng)基中含有10%滅活的胎牛血清，還含有鏈霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培養(yǎng)瓶置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，溫度恒定于37℃，SHG-44細(xì)胞滿瓶后,將培養(yǎng)液傾倒出去,0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶中的SHG-44細(xì)胞,顯微鏡下觀察SHG-44細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞開始皺縮時(shí),加入營養(yǎng)液,并反復(fù)吹打，使SHG-44細(xì)胞脫壁,并用離心機(jī)離心5min，離心轉(zhuǎn)數(shù)為1000r/min，將上清液棄出，制成106細(xì)胞/瓶的細(xì)胞懸液,接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。

②SHG-44細(xì)胞懸液制備的接種 接種前3d，每日給予地塞米松，劑量為100g體重1mg，給藥方式為灌胃，降低排斥反應(yīng)，植入靶點(diǎn)為右側(cè)尾狀核區(qū)，穿刺點(diǎn)為矢狀縫右旁開3.5cm和前囟中點(diǎn)前1.0cm，用10%水合氯醛麻醉，給藥劑量為每100克體重0.4mL，麻醉滿意后，將Wistar大鼠固定于立體定向儀上，剪去穿刺點(diǎn)周圍毛,高效碘消毒,鋪無菌洞巾，切開內(nèi)眥連線與正中矢狀面交點(diǎn)向后1cm，定位預(yù)先穿刺點(diǎn)，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑1.2mm，用1mm微量注射器針頭刺破硬膜，向下垂直進(jìn)入硬膜下6mm, 再后撤1mm，將細(xì)胞懸液1×106/20μL，以每分鐘1μL的速度緩慢注入右側(cè)尾狀核區(qū)，穿刺針停留5min，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。

1.1.2 紫杉醇-聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備

將300mgDextran-70放置于燒杯中，加蒸餾水?dāng)嚢枋蛊淙芙?，pH值調(diào)至3.0，定容至50mL。于室溫、電磁攪拌下緩緩加入濃度為1%的α-BCA0.5mL，攪拌4h后，pH調(diào)至8.5，用氫氧化鈉溶液，制成空白的PBCA納米粒膠體溶液。量取空白的PBCA溶液10mL，加入藥物20mg，pH值調(diào)至7.0，攪拌4h后，得紫杉醇-PBCA-NP膠體溶液，取上述紫杉醇-PBCA-NP膠體溶液10mL，同時(shí)加入0.1mLT-80，攪拌半小時(shí)，置于恒溫箱中孵化2h，溫度恒定于37℃。

1.2 分組給藥

MRI掃描Wistar大鼠頭部，篩除過大過小的腫瘤，留取呈橢圓形、球形，篩除過大、過小的腫瘤，隨機(jī)分成4組，每組10只，分開飼養(yǎng)。術(shù)后每日腹腔注射青霉素，劑量為每次10萬單位。制備的膠質(zhì)瘤模型隨機(jī)分成四組，每組10只。

Ⅰ組 ：生理鹽水(對(duì)照組)。Ⅱ組：紫杉醇(實(shí)驗(yàn)組)。Ⅲ組：PBCA+NP(實(shí)驗(yàn)組)。Ⅳ組：紫杉醇+PBCA+NP(實(shí)驗(yàn)組)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

①觀察Wistar大鼠生存狀態(tài)。②腫瘤的組織病理學(xué)觀察。③測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間采用方差分析，兩組之間采用Q檢驗(yàn)，P<0.05具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 觀察Wistar大鼠的生存狀態(tài)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲不振，體重下降，身體虛弱，活動(dòng)明顯減少，步態(tài)不穩(wěn)等癥狀。Ⅳ組Wistar的以上表現(xiàn)，明顯好于Ⅱ組和Ⅲ組。

2.2 腫瘤組織病理學(xué)切片

光鏡下觀察Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，腫瘤細(xì)胞呈小梭形，細(xì)胞核較大，有異形，可見核分裂相，染色質(zhì)豐富，細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較少，實(shí)驗(yàn)組可見壞死灶，Ⅱ組和Ⅲ組Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤血管的減少和壞死腫瘤組織比Ⅳ組少。

2.3 腫瘤細(xì)胞的凋亡率

見表1。

表1 各組腫瘤細(xì)胞凋亡率

3 討論

膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚葉的膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤，是目前最頑固的腫瘤之一，治療效果無突破性進(jìn)展。中位生存時(shí)間改善不明顯，目前仍以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以放化療，并且復(fù)發(fā)率極高，幾乎可達(dá)到100%，對(duì)患者生活質(zhì)量和壽命造成極大威脅，這是目前神經(jīng)外科面臨的極富挑戰(zhàn)難題，廣大的學(xué)者和臨床醫(yī)生正在探索新的治療方法。隨著化療藥物的制備工藝的提高，減少了化療藥物的毒副作用，化療作為術(shù)后治療的常用手段之一，化療藥具有明顯的閾值，超過閾值可發(fā)揮抗癌作用，增加到一定量時(shí)具有明顯的毒副作用，呈現(xiàn)劑量依賴性，導(dǎo)致化療效果并不理想，治療同時(shí)難免損傷正常腦細(xì)胞導(dǎo)致的并發(fā)癥,隨診納米技術(shù)的發(fā)展，為膠質(zhì)瘤患者帶來福音。藥物通過包埋在粒子內(nèi)部，以及吸附于粒子表面，納米粒子輸送藥物具有如下特點(diǎn)：①緩釋性，增加藥物作用時(shí)間，②靶向性 增加了藥效，③毒副作用小，④穩(wěn)定性好，有利于儲(chǔ)存等[5～6]。納米粒子能穿透組織間隙并被細(xì)胞吸收，可通過人體最小的毛細(xì)血管。納米粒子通過囊壁瀝濾、滲透、本身的溶蝕等方式，把藥物釋放出來[7，8]。由于納米粒子所均有的以上特性，提高了化療藥物的治療效果，同時(shí)也減輕了毒副作用，前景廣闊。

本實(shí)驗(yàn)在成功建立Wistar大鼠SHG-44腦膠質(zhì)瘤模型的基礎(chǔ)上，將生長滿意的腫瘤，作為實(shí)驗(yàn)的腫瘤模型，隨機(jī)分成4組，為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組，Ⅰ組為對(duì)照組，注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組為Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組，Ⅱ組注射紫杉醇，Ⅲ組注射PBCA+NP，Ⅳ組注射紫杉醇+PBCA+NP，待注射藥物10d后，觀察Wistar大鼠的生存狀態(tài)，測(cè)量腫瘤生長抑制率，測(cè)定腫瘤細(xì)胞的凋亡率，觀察病理切片，結(jié)果Wistar大鼠的生存狀態(tài)(精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲不振，體重下降，身體虛弱，活動(dòng)明顯減少，步態(tài)不穩(wěn)等癥狀)，Ⅳ組Wistar的以上表現(xiàn)，明顯好于Ⅱ組和Ⅲ組。腫瘤生長凋亡率Ⅱ組、Ⅲ組明顯低于Ⅳ組，光鏡下觀察腫瘤標(biāo)本，腫瘤組織壞死程度和血管的減少量Ⅳ組多于Ⅲ組和Ⅱ組，以上結(jié)果表明，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上聚氰基丙烯酸正丁酯納米載體具有明顯促進(jìn)紫杉醇?？鼓X膠質(zhì)瘤作用，利用納米載體所具有的特性，增加了腫瘤組織內(nèi)藥物的濃度，提高了藥效，減少了毒副作用。

[1]盧春鳳,陳廷玉,陶佳南,等. 大鼠肝星狀細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2003，26(4)：25

[2]趙文麗,姜慶久,陶富山. 山莨菪堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2004，27(2)：26

[3]趙文麗,姜慶久,吳影.紅花對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的抑制作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2004，27(4)：25

[4]盧春鳳,劉蕾,楊麗,等. 蟲草多糖對(duì)離體肝星狀細(xì)胞增殖及膠原基因表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2004，27(5)：29

[5]ZhangY,ZhangH,WangX,etal.Theeradicationofbreastcancerandcancerstemcellsusingoctreotidemodifiedpaclitaxelactivetargetingmicellesandsalinomycinpassivetargetingmicelles[J].Biomaterials，2012，33(2):679-691

[6]ShinHC,AlaniAW,ChoH,etal.A3-in-1polymericmicellenanocontainerforpoorlywater-solubledrugs[J].MolPharm，2011，8(4):1257-1265

[7]武莉,楊菁,劉天軍,等.紫杉醇-聚氰基丙烯酸二乙酯納米膠束載體材料的可接受效應(yīng)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(8):1392-1396

[8]呂大鵬,李力軍,柳學(xué)全.納米技術(shù)與腫瘤防治[J].中國實(shí)用外科雜志，2002,22(2) :127-129

黑龍江省衛(wèi)計(jì)委課題項(xiàng)目，編號(hào)：2010-523。

李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師。

李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：liyingfu79@sohu.com。

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1008-0104(2015)02-0029-02

2015-01-26)