王秀玲，董朋飛，王 群，李潮海

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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淹水脅迫條件下玉米苗期葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王秀玲，董朋飛，王 群，李潮海

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

采用雙向電泳技術(shù)(2-DE)研究玉米苗期受淹后葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，以進(jìn)一步闡明玉米對(duì)淹水脅迫的響應(yīng)機(jī)制。玉米種植10 d后進(jìn)行72 h淹水處理，提取葉片總蛋白質(zhì)、采用2-DE，利用圖像分析，獲得12個(gè)差異蛋白點(diǎn)。經(jīng)鑒定得到9種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)分別參與光合作用、氨基酸代謝、防御與脅迫和碳水化合物代謝等多個(gè)代謝過程。其中，參與光合作用、蛋白質(zhì)折疊和氨基酸代謝的蛋白質(zhì)表達(dá)基本被負(fù)調(diào)，而參與淀粉生物合成的2個(gè)蛋白質(zhì)均上調(diào)。這說明淹水脅迫抑制了玉米的光合作用，而玉米植株則可能通過提高淀粉生物合成增加有機(jī)物質(zhì)儲(chǔ)備，從而有利于植株恢復(fù)。玉米對(duì)淹水脅迫的適應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，涉及到多種蛋白質(zhì)的相互作用，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

玉米；葉片；淹水脅迫；蛋白質(zhì)組學(xué)

黃淮海平原是中國夏玉米主產(chǎn)區(qū)，漬澇已經(jīng)成為制約該區(qū)玉米生產(chǎn)的主要逆境因子之一。玉米是中國主要糧食和飼料作物，因其根系呼吸作用強(qiáng)，對(duì)氧氣需求量大，故耐澇性較差。因此，闡釋玉米耐澇性機(jī)制對(duì)于生產(chǎn)中調(diào)控緩解漬澇對(duì)玉米造成的傷害有著指導(dǎo)性的意義。漬澇通常伴隨著細(xì)胞氧含量下降，光合作用受限制或阻斷時(shí)尤為嚴(yán)重[1]。這就迫使植物通過無氧呼吸來獲得三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)和NAD+的再生[2]。無氧呼吸導(dǎo)致根系細(xì)胞能荷下降，活性氧清除系統(tǒng)活性降低，細(xì)胞中活性氧增加，細(xì)胞質(zhì)膜透性劇增，破壞細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失。在發(fā)育水平上，植物可以改變細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，以便氧氣擴(kuò)散，從而避免低氧脅迫的損害[3]。這些過程受植物激素的控制，包括乙烯、赤霉素和脫落酸[4]。在生理生化水平上，植株通過活性氧清除系統(tǒng)來減輕或消除活性氧積累對(duì)植物的傷害，主要有酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)兩類：前者主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reducatase, GR)；后者主要指抗壞血酸(asxorbic acid, AsA)、類胡蘿卜素(carotenoid, Car)以及一些含巰基的低分子化合物等[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是從大規(guī)模水平上分析和描述生物體蛋白質(zhì)作用模式、功能機(jī)制、調(diào)節(jié)控制以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)相互作用的學(xué)科，為研究基因功能提供重要的信息，已被廣泛地應(yīng)用于研究多種非生物脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)模式[6]。迄今為止，漬澇或缺氧方面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究在小麥[7]、水稻[8]、番茄[9,10]、大豆[11]、玉米[12]已見報(bào)道。KONG等[7]分別運(yùn)用雙向電泳和液相-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)，研究了小麥?zhǔn)苎秃蟾导?xì)胞壁蛋白質(zhì)(CWPs)表達(dá)情況，結(jié)果表明，大部分下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)與糖酵解和細(xì)胞壁構(gòu)成和修復(fù)有關(guān)，而被上調(diào)的蛋白質(zhì)則大多參與防御和疾病響應(yīng)，其中僅甲硫氨酸合成酶，β-1,3-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶在兩種技術(shù)中均被檢測(cè)到，表達(dá)下調(diào)。綜上推測(cè)小麥幼苗通過限制細(xì)胞生長(zhǎng)，避免能量消耗；而CWPs通過參與甲硫氨酸同化和細(xì)胞壁水解在淹水響應(yīng)中起著重要的作用。HUANG等[8]利用35 S-甲硫氨酸標(biāo)記法和雙向電泳技術(shù)檢測(cè)了水稻缺氧72 h胚芽鞘蛋白合成及表達(dá)模式變化，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)1和2以及果糖-1,6-二磷酸醛縮酶過量表達(dá)，并推測(cè)PPDK可能與丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)結(jié)合形成一個(gè)“酶底物循環(huán)”，促使ATP產(chǎn)生無機(jī)焦磷酸鹽(inorganic pyrophosphate, PPi)，形成的PPi可以在果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸果糖激酶作用下促進(jìn)糖酵解作用，增加ATP產(chǎn)生，繼而產(chǎn)生的ATP又可生成PPi。番茄受淹后葉片會(huì)產(chǎn)生大量活性氧 (ROS)，致使Rubisco大亞基被降解；在根系中則鑒定了一些漬澇響應(yīng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，有3-β-羥化酶，苯丙氨酸裂解酶，谷?；?tRNA還原酶，黃烷酮-3-羥化酶，線粒體ATP酶α亞基，半胱氨酸蛋白酶，DWARF1和NIM1類似蛋白2，這些蛋白質(zhì)參與多個(gè)代謝過程，包括激素和次生代謝合成，細(xì)胞程序性死亡和逆境抵御機(jī)制[9-10]。淹水會(huì)引起大豆根系脂質(zhì)過氧化和H2O2水平逐步提高，ALAM等[11]結(jié)合2-DE得到漬澇響應(yīng)關(guān)鍵蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與多個(gè)代謝路徑，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞程序性死亡、RNA加工、氧化還原平衡和能量代謝。其中一些參與糖酵解和無氧發(fā)酵過程的一些酶表達(dá)豐度上調(diào)，以及一些參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞程序性死亡的蛋白質(zhì)在淹水下表達(dá)也受到影響，表明大豆植株可以通過調(diào)節(jié)碳水化合物消耗、調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡以應(yīng)對(duì)漬澇脅迫。YU等[12]比較了耐淹性不同的玉米自交系受淹后根系蛋白質(zhì)組學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)NADP蘋果酸酶、谷氨酸脫羧酶、糞卟啉原III氧化酶，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽脫氫酶和木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶6在耐澇型自交系中特異性積累，這些蛋白質(zhì)能夠調(diào)節(jié)能量消耗、維持細(xì)胞pH水平，以及降低氧化損傷。葉片是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，植株受淹會(huì)造成葉片氣孔關(guān)閉、光合速率下降、激素代謝紊亂等，但其具體響應(yīng)機(jī)制仍有待探討。檢測(cè)植物適應(yīng)淹水過程中的一些重要蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，了解其功能，可以揭示植物對(duì)漬澇在蛋白質(zhì)組水平上的響應(yīng)機(jī)制[10]。本研究的目的在于鑒定玉米響應(yīng)淹水脅迫中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，以期為育種或轉(zhuǎn)基因來提高玉米耐澇性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用漬澇敏感型玉米(ZeamaysL.)品種ND 108。取子粒飽滿、大小一致的玉米種子，用自來水沖洗干凈，將其浸泡于25%次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒，15 min后用自來水沖洗干凈，然后置于培養(yǎng)皿中于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽48 h，每天用自來水沖洗3～4次，露白后種植于裝滿珍珠砂的一次性水杯中，溫度為25～28 ℃，光照周期為16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)10 d，每天加25 mL 0.3×Hoagland營養(yǎng)液。玉米苗長(zhǎng)到二葉一心時(shí)于9∶00進(jìn)行淹水處理，保持水面高于土面2 cm。淹水后72 h取葉片，速凍于液氮中，后貯藏于-80 ℃冰箱內(nèi)用于蛋白質(zhì)提取。

1.2 葉片表型測(cè)定

選取不同處理生長(zhǎng)一致的3株幼苗，測(cè)定其葉綠素含量(SPAD值)、株高、葉面積。再于105 ℃烘箱中殺青30 min，在80℃下烘干至質(zhì)量恒定，冷卻至室溫后用1/1 000電子天平稱取干質(zhì)量。采用便攜式葉綠素計(jì)(Minolta SPAD-502Cholorophyll meter)測(cè)定SPAD值。在每片葉的不同部位測(cè)定10次，各處理測(cè)定3株，取平均值。葉面積的計(jì)算：首先按照公式計(jì)算單葉葉面積，單葉葉面積=葉長(zhǎng)×葉寬×0.700 7。然后將單葉葉面積累加，得到單株葉面積。

1.3 玉米葉總蛋白質(zhì)的提取制備

采用王偉等[13-14]苯酚/SDS法提取玉米葉片總蛋白質(zhì)。將玉米葉片置于液氮預(yù)冷的研缽中反復(fù)研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為10%TCA/丙酮溶液，用漩渦混合器(HQ-60-Ⅱ)充分混勻，靜置3 min后，4 ℃、16 000×g離心3 min，棄上清液。用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮(含0.1 mmol·L-1乙酸銨)，充分混勻，靜置3 min，4 ℃、16 000×g離心3 min，棄上清液。加入80%丙酮，混勻、靜置、離心、棄上清液。室溫下真空干燥，除去殘留的丙酮。按4～8 mL·g-1蛋白質(zhì)干粉加入1∶1苯酚/SDS緩沖液(含30% 蔗糖，2% SDS，0.1 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，5% β-巰基乙醇)，充分混勻，并靜置5 min。在4 ℃，16 000×g下離心3 min，將上層的苯酚相(0.25 mL)轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，并加入甲醇溶液(含0.1 mol·L-1乙酸銨)，于-20 ℃下靜置過夜后，4 ℃、16 000×g離心5 min，小心地將上清液倒掉；在離心管底和壁上可見白色沉淀，即為蛋白質(zhì)。依次用100%甲醇和80%丙酮各洗1次，在清洗過程中要充分混勻。干燥后，用水化液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，體積分?jǐn)?shù)為2% CHAPS，體積分?jǐn)?shù)為0.5% Pharmalyte)溶解。溶解的蛋白質(zhì)溶液直接用于雙向電泳，或置于-80 ℃?zhèn)溆?。用Bradford法測(cè)定葉總蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白 (BSA)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 雙向電泳

以24 cm，pH 4～7線性(GE Healthcare) IPG膠條進(jìn)行等電聚焦。葉總蛋白質(zhì)1 200 μg與水化液 (7 mol·L-1Urea,2 mol·L-1Thiourea, 4% CHAPS, 40 mmol·L-1DTT)充分混合，上樣體積為450 μL。采用被動(dòng)水化16～18 h，等電聚焦在20 ℃下進(jìn)行，每根膠條的極限電流為50 μA，程序?yàn)?100 V,1 h;300 V,1 h;500 V,1 h;1 000 V,1 h;8 000 V,2 h;8 000 V 10 h。

等電聚焦完成后，將膠條于平衡液Ⅰ(6 mol·L-1Urea,75 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8, 29.3% 甘油, 2% SDS, 0.002%溴酚藍(lán), 1% DTT)平衡15 min；再于平衡液Ⅱ(6 mol·L-1Urea,75 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8, 29.3% 甘油, 2% SDS,0.002%溴酚藍(lán),2.5%碘乙酰胺)中平衡15 min。

將平衡結(jié)束后的膠條移至1 mm厚的12% SDS-PAGE上端，用瓊脂糖密封液 (0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖25 mmol·L-1,192 mmol·L-1甘氨酸,0.1%SDS,0.002%溴酚藍(lán))封膠。電泳條件：600 V,400 mA,1 W·gel-1,1 h；600 V,400 mA,13 W·gel-1,4.5 h。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)法染色。

1.5 圖像分析

利用ImageMaster 2D Platinum (Version 5.0, GE Amersham)軟件進(jìn)行圖像分析。利用SPSS 19軟件進(jìn)行單因素方差分析，得到P值并統(tǒng)計(jì)P<0.05的顯著性差異。選取差異超過1.5倍，且P<0.05的表達(dá)顯著差異蛋白質(zhì)。

1.6 膠內(nèi)酶解及脫鹽

將膠粒切碎后轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入200～400 μL 100 mmol·L-1NH4HCO3/30%乙腈(ACN)脫色液，清洗脫色至透明，吸棄上清液，加入100 mmol·L-1NH4HCO3，室溫孵育15 min。吸棄上清液凍干，之后加入5 μL 2.5～10 mg·L-1測(cè)序級(jí)胰蛋白酶Trypsin (Promega)溶液，37 ℃反應(yīng)過夜，20 h左右；吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新離心管中，原管加入100 μL 60% ACN /0.1%三氟乙酸(TFA)，超聲15 min，合并酶解液凍干；若有較多鹽分，則用微量層析柱(Ziptip)進(jìn)行脫鹽。

1.7 質(zhì)譜分析

凍干后的酶解樣品，取2 μL 20%乙腈復(fù)溶。取1 μL溶解樣品，直接點(diǎn)于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，取0.5 μL過飽和CHCA基質(zhì)溶液(溶劑為50%ACN，0.1% TFA)點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥。樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪艉蠓湃雰x器進(jìn)靶槽并用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer)進(jìn)行測(cè)試分析，激光源為355 nm 波長(zhǎng)的Nd:YAG 激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級(jí)質(zhì)譜(MS)掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)累計(jì)疊加2 500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。

1.8 數(shù)據(jù)庫檢索

質(zhì)譜測(cè)試原始文件用Mascot 2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。搜庫參數(shù)如下。(1)Database: NCBI;(2) Taxonomy:NCBI_Zea mays (172382);(3)Type of search：Combined(MS+MS/MS);(4)Enzyme:Trypsin;(5)Fixed modifications:Carbamidomethyl(C);(6)Dynamical modifications:Oxidation(M);(7)Mass values:Monoisotopic;(8)Protein mass：Unrestricted;(9)Peptide mass Tolerance：±100×10-6;(10)Fragment mass tolerance:±0.4 Da;(11)Peptide charge state:1+;(12)Max missed cleavages:1。鑒定成功的標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白質(zhì)得分(Protein Score)超過60；且Protein Score C.I.%大于95%。

1.9 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分析

使用Blast2GO軟件進(jìn)行Gene Ontology (GO) Database分析，使用KEGG中的KAAS進(jìn)行Pathway分析，獲得參與的代謝通路。為增加未知蛋白質(zhì)功能分類的可信度，利用NCBI的保守域檢索(Conserved domain search, CDS) 或uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)未知蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 淹水脅迫對(duì)玉米品種ND 108幼苗生長(zhǎng)特性的影響

由表1可見，與對(duì)照相比，淹水脅迫下ND 108根干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、葉面積、SPAD值和株高均呈下降趨勢(shì)，下降程度隨淹水時(shí)間延長(zhǎng)而加大。淹水2，4，6 d時(shí)，根干質(zhì)量分別比對(duì)照降低7.73%，14.99%和20.85%；淹水至4 d時(shí)，地上干質(zhì)量比對(duì)照降低12.28%，淹水至6 d時(shí)，降低14.79%，均達(dá)到顯著水平。隨著淹水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片從下而上變黃，至4 d時(shí)，ND 108第1片葉完全干枯，致使淹水4 d與淹水2 d相比綠葉面積增長(zhǎng)不明顯。淹水至2，4，6 d時(shí)，淹水下葉面積分別比對(duì)照下降4.75%，14.89%和21.62%。淹水過程中，玉米葉片SPAD值呈降低趨勢(shì)。淹水2 d時(shí)，ND 108葉片SPAD值比對(duì)照低19.89%；之后，其降幅呈增大趨勢(shì)；至淹水6 d時(shí)，與對(duì)照相比分別下降33.47%，均達(dá)到顯著水平。淹水脅迫降低了ND 108株高，至2,4,6 d時(shí)，分別比對(duì)照下降11.59%，14.15%和18.49%。

表1 淹水處理對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)特性的影響

注：表中同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lower case letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.2 淹水脅迫條件下玉米幼苗葉片蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析結(jié)果

利用Image Master軟件分析淹水與對(duì)照條件下玉米葉片蛋白質(zhì)圖譜(圖1)，在等電點(diǎn)(isoelectric point, pI) 4.0～7.0、相對(duì)分子質(zhì)量(molecular weight, Mr) 14.4～97.4 kD范圍內(nèi)，大部分蛋白質(zhì)集中在pI為4.9～6.1和相對(duì)分子質(zhì)量為30.0～97.4 kD，淹水和對(duì)照下的葉片蛋白質(zhì)數(shù)量和種類基本一致，但其中一部分表達(dá)發(fā)生了變化。通過分析確定12種差異蛋白質(zhì)，其中9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被成功鑒定(表2)。

2.3 淹水脅迫條件下玉米差異蛋白質(zhì)的鑒定與功能分析

對(duì)上述9種蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)它們分別參與光合作用、防御與脅迫、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)折疊和淀粉生物合成等生物學(xué)過程，表明淹水脅迫影響了玉米多個(gè)生理代謝通路。淹水脅迫條件下，有3個(gè)差異蛋白質(zhì)參與光合作用，其中NADP蘋果酸酶3 (蛋白質(zhì)點(diǎn)2)參與光合作用，具有蘋果酸酶活性；鐵氧化還原蛋白-NADP+還原酶，葉同工酶 (蛋白質(zhì)點(diǎn)3)作為電子載體參與光合作用電子傳遞過程。假定蛋白ZEAMMB73_066102 (蛋白質(zhì)點(diǎn)6)參與葉綠素生物合成和光合作用的電子傳遞，可與蛋白質(zhì)結(jié)合。以上參與光合作用的蛋白質(zhì)除蛋白點(diǎn)6表達(dá)上調(diào)，其余均下調(diào)。FKBP型-肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(蛋白質(zhì)點(diǎn)5)是一種蛋白質(zhì)折疊酶，催化脯氨酰-肽?；漠悩?gòu)化作用[15,16]；細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)蛋白酶Ⅰ(蛋白質(zhì)點(diǎn)1) 與細(xì)胞防御有關(guān)，參與過氧化氫分解過程，具有依賴ATP的肽酶活性；半胱氨酸合成酶(蛋白質(zhì)點(diǎn)4)參與氨基酸代謝過程，具有半胱氨酸合成酶活性；未命名蛋白產(chǎn)物(蛋白質(zhì)點(diǎn)7)有一個(gè)Clp 蛋白酶ATP綁定亞基，參與蛋白質(zhì)代謝，具有核苷三磷酸酶活性，均下調(diào)表達(dá)。此外，有2種蛋白質(zhì)與淀粉合成有關(guān)，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(蛋白質(zhì)點(diǎn)9)是淀粉合成的關(guān)鍵酶，蛋白質(zhì)點(diǎn)8被鑒定為未知蛋白質(zhì)，參與淀粉的生物合成，淹水脅迫下上述2種酶均上調(diào)表達(dá)。

注：A：正常供水條件下玉米葉片蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜；B：淹水處理72 h后玉米葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜；蛋白質(zhì)上樣量為1 200 μg，采用考馬斯亮藍(lán)CBB R染色，對(duì)12種葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中9種得到成功鑒定。

蛋白序號(hào)SpotNo.蛋白質(zhì)名稱Proteinname登錄號(hào)AccessionNo.變化倍數(shù)Foldchange相對(duì)分子質(zhì)量/等電點(diǎn)Mr/pI理論值Theoreticalvalue觀察值Observedvalue匹配肽段數(shù)Peptidecount蛋白質(zhì)得分Proteinscore2光合作用PhotosynthesisNADP蘋果酸酶3NADPmalicenzyme3gi|4148759270.6668/6.8566/5.94265753鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶,葉片同工酶Ferredoxin-NADPreductase,leafisozymegi|4148786350.6641/7.5536/5.61224776假定蛋白HypotheticalproteinZEAMMB73_066102gi|4139365032.5945/5.2763/4.77111195蛋白質(zhì)折疊Proteinfold推定的KFBP型肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶家族蛋白PutativeFKBP-typepeptidyl-prolylcis-transisomerasefamilyproteingi|4139550310.5622/9.5118/6.255961防御與脅迫Defense/Stress細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)蛋白酶1Cytokinininducibleprotease1gi|4139167580.42102/6.2497/5.73435734氨基酸代謝Aminoacidmetabolism半胱氨酸合成酶Cysteinesynthasegi|4139470700.5842/6.9736/5.78141837未命名蛋白產(chǎn)物Unnamedproteinproductgi|2965300620.63102/6.2397/5.85426278淀粉生物合成Starchbiosyntheticprocess未知蛋白Unknowngi|2198854351.5123/5.6638/5.6910929葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶小亞基(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)同工型1Glucose-1-phosphateadenylyltrans-ferasesmallsubunit(ADP-glucosepyrophosphorylase)isoform1gi|4148706801.7557/6.4852/5.4520327

3 結(jié)論與討論

水淹很容易傷害PSⅡ功能[17-18]，水淹初期植物葉片就表現(xiàn)出Fo上升和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)降低，隨著淹水時(shí)間的延長(zhǎng)，PSⅡ反應(yīng)中心和遠(yuǎn)處光化學(xué)效率受到嚴(yán)重傷害[19-20]，從而使植物同化作用受抑制和生物量積累減慢。這可能是淹水后玉米葉面積、葉綠素含量和葉干質(zhì)量增加緩慢甚至減少的重要原因。光反應(yīng)位于類囊體膜，包括光合色素(兩個(gè)反應(yīng)中心和兩個(gè)光合系統(tǒng)，即光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ)、光合電子傳遞鏈(細(xì)胞色素b6-f復(fù)合物、質(zhì)體藍(lán)素和鐵氧化還原蛋白等)以及ATP合成[21]。LEE等[21]研究表明，油菜苗期受淹后葉片中一些編碼光反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)下調(diào)，這可能是導(dǎo)致光合速率下降的原因。CHRISTIANSON等[22]發(fā)現(xiàn)，棉花淹水24 h后，葉片中參與光合作用，尤其是葉綠素合成的基因下調(diào)表達(dá)。此外，參與碳固定的RuBisCO和RuBisCO活化基因表達(dá)下降。RuBisCO在植物葉片內(nèi)的含量很高，是催化光合碳代謝中光合成和光呼吸最初步驟的酶[9]，但其催化效率很低，必須經(jīng)過RuBisCO活化酶的活化才能表現(xiàn)出羧化/加氧活性。RuBisCO活化酶是一種核基因編碼的葉綠體蛋白質(zhì)，它利用光合磷酸化生成的ATP使RuBisCO迅速與生理濃度的CO2，Mg2+結(jié)合形成酶-CO2-Mg，從而達(dá)到最大活化程度。本研究中鐵氧化還原蛋白-NADP+還原酶 (蛋白質(zhì)點(diǎn)3)主要負(fù)責(zé)催化光合線性電子傳遞的最后一步，催化電子從還原態(tài)的鐵氧還蛋白傳遞給NADP+，生成的還原力NADPH可用于卡爾文循環(huán)的碳固定、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成、葉綠素合成和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)等代謝過程[23-25]，本研究中其表達(dá)下調(diào)。NADP蘋果酸酶參與碳固定，存在于C4植物的維管束鞘葉綠體中，為RuBisCO提供CO2，本研究中發(fā)現(xiàn)，NADP蘋果酸酶3(蛋白質(zhì)點(diǎn)2)表現(xiàn)為下降。這表明淹水脅迫導(dǎo)致葉片葉綠素含量[26]和光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)活性的下降[9]，使光反應(yīng)和CO2固定受到抑制。

脅迫條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊機(jī)制受到限制，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累[27]，未折疊蛋白質(zhì)在以下兩種情況下可被誘導(dǎo)：(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能滿足植株對(duì)蛋白質(zhì)折疊的需求[28]；(2)降低了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)執(zhí)行蛋白質(zhì)折疊的效率[29]。本研究結(jié)果顯示，淹水脅迫引起了后者的變化，肽酰脯氨酰異構(gòu)酶(蛋白質(zhì)點(diǎn)5)在蛋白質(zhì)折疊過程中起作用，是一種葉綠體膜蛋白，它對(duì)一些蛋白質(zhì)向葉綠體內(nèi)輸送其重要作用，本研究中其表達(dá)量下調(diào)，這表明淹水脅迫可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊來影響蛋白質(zhì)生物功能[30]。該結(jié)果與CHEN等[15]在凍害對(duì)洋蔥的蛋白質(zhì)組研究中的結(jié)果一致。

半胱氨酸合成酶(蛋白質(zhì)點(diǎn)4)是半胱氨酸合成的關(guān)鍵酶，半胱氨酸參與合成谷胱甘肽(GSH)，GSH是谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)中的關(guān)鍵組成，可清除過氧化氫，其存在還原態(tài)和氧化態(tài)兩種形式，其中還原態(tài)GSH可提供一個(gè)電子，減少ROS等不穩(wěn)定分子，反應(yīng)中的GSH與另一個(gè)活性GSH反應(yīng)形成二硫化谷胱甘肽。研究表明，漬澇或缺氧條件下，半胱氨酸合成酶的降解可能減少植株體內(nèi)中的GSH含量。本研究中該酶表達(dá)水平下調(diào)，與AHSAN等[9]的研究結(jié)果一致。

淀粉是種子萌發(fā)和隨后生長(zhǎng)的主要能源物質(zhì)[31-32]，植株受到淹水脅迫后，體內(nèi)淀粉儲(chǔ)備量對(duì)其經(jīng)受淹水脅迫后的存活和恢復(fù)生長(zhǎng)非常重要[33]。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(蛋白質(zhì)點(diǎn)13)是在淀粉合成途徑中起調(diào)控作用的主要酶[15]，本研究中該酶在淹水脅迫下表達(dá)豐度提高。另外，蛋白質(zhì)點(diǎn)11也參與淀粉合成，具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，研究中表現(xiàn)為上調(diào)。淀粉合成相關(guān)的酶表達(dá)水平上升表明，淹水脅迫下玉米可能加強(qiáng)淀粉合成途徑，從而有利于植株積累更多的能源物質(zhì)。

漬澇脅迫導(dǎo)致玉米干物質(zhì)的積累減慢，葉面積增長(zhǎng)緩慢，葉綠素分解。為明確其具體的響應(yīng)機(jī)制，本研究從蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)與光合作用、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的蛋白質(zhì)被負(fù)調(diào)，而參與淀粉合成的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶表達(dá)上調(diào)，這可能是其一種適應(yīng)機(jī)制。要回答此問題，還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

Proteomic analysis of maize seedling leaves subjected to waterlogging stress

WANG Xiuling, DONG Pengfei, WANG Qun, LI Chaohai

(College of Agronomy, Henan Agricultural University; Zhengzhou 450002, China)

Two-dimensional electrophoresis (2-DE) technology were used to analyze the proteomic change of maize (ZeamaysL.) seedling leaves under waterlogging and normal conditions. Ten-day-old plants were subjected to waterlogging stress, and leaves were collected 72 hours after treatment. Then total proteins were extracted from leaf samples, separated by 2-DE, and visualized by staining with Coomassie Brilliant Blue. A total of 12 protein spots were differentially expressed in maize leaves in response to waterlogging stress, and 9 were successfully identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-TOF MS) analysis. These proteins were involved in several cellular processes, including photosynthesis, amino acid metabolism, defense and stress and carbohydrate metabolism. And proteins associated with photosynthesis, protein folding and amino acid metabolism were down-regulated by waterlogging, while two proteins related to starch biosynthesis process were up-regulated. These results suggested that waterlogging-stress could hinder the photosynthesis, leading to the assimilation inhibited, and biomass accumulation slowed, at the same time, maize might enhance the starch biosynthesis process to increase the torlerance to waterlogging. The maize adaptation to waterlogging was regulated by a complex network, multiple proteins of different metabolic pathways might participate in this process.

maize; leaf; waterlogging; proteomics

2015-06-28

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-02-19)

王秀玲(1989-)，女，河南林州人，碩士研究生，主要從事作物生理生態(tài)研究。

李潮海(1956-)，男，河南鞏義人，教授，博士研究生導(dǎo)師。

1000-2340(2015)05-0608-08

S 513

A