宋孟秋，馬永生，曹玉鳳，劉 陽，楊 煥，范艷樂，陳 炯，殷玉鵬，趙善廷，陳樹林＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.甘肅民族師范學(xué)院生命科學(xué)院，甘肅合作747000）

黃體（corpus luteam，CL）是哺乳動物卵巢排卵后其中的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞分化而成的一個暫時性內(nèi)分泌器官，主要分泌孕酮，在哺乳動物的生殖調(diào)控中起著重要的作用［1］。黃體主要包括分泌類固醇類細(xì)胞和不分泌類固醇類細(xì)胞，其中，前者主要為大黃體細(xì)胞（large luteal cells，LLCs）和小黃體細(xì)胞（small luteal cells，SLCs），而后者則多為內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等［2］。由于LLCs與SLCs的分界線模糊，而SLCs又具有向LLCs分化的可能性［3］，同時離體黃體組織中LLCs和SLCs的數(shù)量比例并不能代表黃體中兩種細(xì)胞的真實比例［4-5］，因而，多年來關(guān)于兩種細(xì)胞的真實數(shù)據(jù)及大小也一直都是學(xué)者爭論的焦點。對黃體細(xì)胞大小通用的描述是通過黃體組織切片上黃體細(xì)胞的斷面進行測量而得到的結(jié)果，而這并不能真實地反映黃體細(xì)胞的立體大小。為了探索周期性黃體大小及其不同類型細(xì)胞的數(shù)量變化規(guī)律，本研究分別采用自發(fā)生長的不同時期的黃體組織，測量不同時期黃體內(nèi)的細(xì)胞立體大小并計算不同立體大小的細(xì)胞所占比例，為新的黃體細(xì)胞分類體系的建立和計算機模擬構(gòu)建周期性黃體的三維立體構(gòu)象提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雌性昆明種小鼠，8周齡～10周齡，平均體重26g±0.5g，第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。所有試驗小鼠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度17℃～24℃、相對濕度為55%±5%、自然光照條件下，自由采食、飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 蘇木精與伊紅染液，Solarbio公司產(chǎn)品；切片石蠟（硬蠟56℃～58℃，軟蠟54℃～56℃），上海華永石蠟有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機RM2235，德國Leica公司生產(chǎn)；Olympus CHC型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社；捷達(dá)801形態(tài)學(xué)分析軟件，江蘇捷達(dá)科技公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)情周期鑒定及樣本采集 左手保定小鼠，右手將細(xì)棉簽用生理鹽水潤濕后緩緩插入陰道約0.5cm，輕輕轉(zhuǎn)動并將蘸有陰道分泌物的細(xì)棉簽在載玻片上均勻涂抺，待自然干燥后用堿性美藍(lán)染液染色5min后蒸餾水洗滌，并使之干燥，顯微鏡下觀察陰道涂片的細(xì)胞形態(tài)與分布變化以確定其發(fā)情狀況。用100mL／L水合氯醛腹腔注射對小鼠進行麻醉，后迅速暴露胸腔，將注射用針頭刺入左心室用固定，同時用眼科剪剪開右心耳，之后緩慢注入100 mL左右生理鹽水以沖洗心血管中的血液，最后換用40mL／L多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）150mL進行灌注固定。充分固定后，將兩側(cè)卵巢（如小米粒大小并帶有結(jié)締組織）小心地用眼科手術(shù)剪摘取，放入40mL／L多聚甲醛中保存。

1.2.2 石蠟切片制作及HE染色 從固定液中取出卵巢組織，流水沖洗12h，小心剝離剔除其上的結(jié)締組織和脂肪等組織，梯度酒精脫水后二甲苯透明并用石蠟進行包埋，在石蠟切片機上把卵巢完整地切成厚度為6μm的連續(xù)縱向切片，標(biāo)明每一張切片的先后順序，并做好記錄，然后置于45℃恒溫箱中烘干。將干燥后的切片進行脫蠟復(fù)水，蘇木精染色7min，鹽酸乙醇分化20s，伊紅染色7min，自來水洗去浮色后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片。

1.2.3 圖像分析及數(shù)據(jù)處理 在10×10倍鏡野下對每一例卵巢切片上發(fā)育較好的黃體部分進行拍照，將照片去除非黃體部分后用形態(tài)分析軟件對照片進行分析，測量這些照片中黃體的最大切面的直徑大小，同時統(tǒng)計每張照片上黃體細(xì)胞的總數(shù)目，結(jié)果直接存于軟件系統(tǒng)，進行統(tǒng)計學(xué)處理。在40×10倍鏡野下隨機地對切片上某些細(xì)胞的平面細(xì)胞區(qū)域進行拍照，然后對與此切片連續(xù)相鄰的若干張切片上和前述區(qū)域?qū)ξ坏钠矫婕?xì)胞區(qū)域進行拍照，將這幾張切片的上述平面細(xì)胞區(qū)域組成一立體細(xì)胞區(qū)域并用軟件分析測量，每1個立體細(xì)胞區(qū)域內(nèi)測量8個黃體細(xì)胞的立體大小，得出這8個黃體細(xì)胞在這些照片上的最大斷面的長短徑，再根據(jù)這些細(xì)胞所在切片的張數(shù)得出細(xì)胞的縱徑估計值（縱徑以切片厚度6μm為單位），從而得出這個立體細(xì)胞區(qū)域內(nèi)8個黃體細(xì)胞的立體大小數(shù)據(jù)；共分析10個立體細(xì)胞區(qū)域得到80個黃體細(xì)胞的立體大小數(shù)據(jù)，然后對不同大小的黃體細(xì)胞所占比例進行定量劃分。

2 結(jié)果

2.1 不同時期卵巢及黃體的大小

各時期黃體的形狀近似于球體，故其體積可以以其最大切面的直徑來表示。本研究中將小鼠周期性黃體從開始形成到生長增大直至退化的整個過程中劃為四個時期，分別為黃體Ⅰ期、黃體Ⅱ期、黃體Ⅲ期及黃體Ⅳ期，其與發(fā)情周期的一般相對應(yīng)關(guān)系是黃體Ⅰ期→發(fā)情后期、黃體Ⅱ期→發(fā)情間期、黃體Ⅲ期→發(fā)情前期和黃體Ⅳ期→發(fā)情期。數(shù)據(jù)表明，發(fā)情周期中，卵巢大小的變化無顯著性差異（表1）；而黃體體積變化中，發(fā)情后期與發(fā)情前期黃體最大切面大小無顯著性差異，發(fā)情間期與發(fā)情期黃體最大切面分別與其他時期相比均差異極顯著，其中，發(fā)情間期黃體切面最大，而發(fā)情期黃體切面最小，說明發(fā)情周期中黃體大小變化明顯（表2和圖1）。

表1 不同時期卵巢長、寬和高的乘積平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（n＝10）Table 1 The average and standard deviation of products of length，width and high of every ovary in different periods（n＝10）

表2 不同時期黃體最大切面平均直徑（n＝10）Table 2 The average diameter of the biggest transverse section of corpus luteum in different periods（n＝10）

圖1 A.Ⅰ期黃體切片圖；B.Ⅱ期黃體切片圖；C.Ⅲ期黃體切片圖；D.Ⅳ期黃體切片圖（HE，400×）Fig.1 A.The paraffin section picture ofⅠperiod CL；B.The paraffin section picture ofⅡperiod CL；C.The paraffin section picture ofⅢperiod CL；D.The paraffin section picture of IV period CL（HE，400×）

2.2 不同時期黃體中細(xì)胞總數(shù)量的統(tǒng)計

不同時期黃體中細(xì)胞的總數(shù)量因卵巢與黃體自身活動狀況的不同而發(fā)生著變化。數(shù)據(jù)顯示，不同時期中黃體細(xì)胞的總數(shù)量各不相同且互相之間均存在顯著差異（表3）。

表3 各時期黃體的平均細(xì)胞數(shù)目Table 3 The average cell number of corpus luteum in each period

2.3 不同時期黃體細(xì)胞立體大小及其比例

不同時期黃體細(xì)胞的立體大小及其數(shù)量因卵巢所處的發(fā)情周期階段不同而存在差異。因數(shù)值過多，在10個細(xì)胞區(qū)域中各隨機選取1個黃體細(xì)胞最大斷面的長徑、短徑及縱徑數(shù)據(jù)并由表格的形式列出（表4）。

表4 不同時期黃體中的黃體細(xì)胞立體大?。é蘭）Table 4 The three-dimensional size of corpus luteum cells in different period corpus luteum（μm）

將每個細(xì)胞的長徑、短徑和縱徑數(shù)值相乘，其中縱徑數(shù)值以其中間值作近似處理，所得數(shù)據(jù)按500 μm3為單位的劃分區(qū)間進行分布統(tǒng)計，從而將每一時期的80個上述數(shù)據(jù)在不同數(shù)值區(qū)間內(nèi)分布的情況進行分析統(tǒng)計，從而得出不同時期的黃體中不同立體大小的黃體細(xì)胞所占比例。餅狀圖顯示，Ⅰ期黃體中黃體細(xì)胞主要以數(shù)值乘積在2 501μm3～3 000μm3和3 001μm3～3 500μm3的細(xì)胞居多，1 001μm3～1 500μm3的細(xì)胞也占一定比例，其他數(shù)值區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞所占比例較小。Ⅱ期黃體中黃體細(xì)胞以數(shù)值乘積在3 001μm3～3 500μm3的細(xì)胞最多，其次是比例相當(dāng)?shù)臄?shù)值乘積在2 501μm3～3 000μm3和3 501μm3～4 000μm3的細(xì)胞，其他數(shù)值區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞所占比例較小，另外這一時期的黃體中有一定比例的數(shù)值乘積很大的細(xì)胞。Ⅲ期黃體中黃體細(xì)胞總體上與Ⅱ期黃體一致的同時，數(shù)值乘積比較小的1 001μm3～1 500μm3的小細(xì)胞明顯的比Ⅱ期黃體多。Ⅳ期黃體中黃體細(xì)胞以數(shù)值乘積在1 001μm3～1 500μm3的細(xì)胞最多且比例很大，其他數(shù)值區(qū)間內(nèi)的細(xì)胞所占比例相當(dāng)，但這一時期的黃體中數(shù)值乘積在3 000μm3以上的細(xì)胞很少（圖2）。

3 討論

周期性黃體的體積大小在發(fā)情周期的不同時期存在著顯著的差異，說明周期性黃體自發(fā)生、生長直至退化的不同時期內(nèi)其體積發(fā)生了明顯的變化。然而，在整個發(fā)情周期中，盡管黃體體積的變化較為明顯，卵巢體積卻沒有明顯的變化，無論是在卵巢中黃體占優(yōu)勢的時期還是卵泡占優(yōu)勢的時期，卵巢內(nèi)部只是發(fā)生著卵泡和黃體的體積大小此消彼長的變化，而卵巢體積的始終如一可能是保持卵巢功能穩(wěn)定的一個調(diào)控途徑。

圖2 不同時期黃體中細(xì)胞三維數(shù)值相乘所得數(shù)據(jù)在不同數(shù)值區(qū)間內(nèi)的分布Fig.2 The product distribution of three-dimensional size of different period CL cells in different numerical areas

黃體中大小黃體細(xì)胞的數(shù)量比例在不同報道中差異較大，其原因是兩種細(xì)胞分類標(biāo)準(zhǔn)在各個研究中存在很大差異，很難直接比較［6］。在牛黃體中，有學(xué)者認(rèn)為直徑大于18μm的細(xì)胞為LLCs［7］，而也有文獻(xiàn)中認(rèn)為大于23μm的才為LLCs［4］；在羊黃體中，LLCs和SLCs的最小與最大直徑分別被報道為30μm和16μm［8］。而本研究數(shù)據(jù)顯示，在周期性黃體自發(fā)生、生長直至退化的過程中，其黃體細(xì)胞數(shù)目先是成一個上升態(tài)勢直至Ⅱ期黃體，而后隨著黃體組織的開始退化，其中的細(xì)胞數(shù)目也隨之減少，整個過程中細(xì)胞數(shù)目呈正態(tài)分布的趨勢發(fā)生變化。通過統(tǒng)計學(xué)分析，在不同時期的周期性黃體中細(xì)胞總數(shù)目依時期不同而存在極顯著差異，且其中某一時期的細(xì)胞總數(shù)目與其他任一時期的細(xì)胞總數(shù)目間存在極顯著差異。究其原因，可能是在黃體化時，由于激素、細(xì)胞因子等一些生物活性物質(zhì)的作用，黃體細(xì)胞分化增殖，導(dǎo)致其數(shù)量逐漸地達(dá)到一個高峰，黃體發(fā)育達(dá)到成熟，以支持黃體功能的發(fā)揮，如卵泡抑素（follistatin，F(xiàn)S）可通過與活化素結(jié)合，以自分泌形式參與顆粒細(xì)胞內(nèi)甾體激素和糖蛋白激素合成與分泌的調(diào)節(jié)，從而促進顆粒細(xì)胞分化與黃體形成［3］；優(yōu)勢卵泡發(fā)生排卵形成紅體后，其中合成的白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）可通過旁分泌方式促進黃體細(xì)胞增殖及本身的分化［9-10］。而當(dāng)周期性黃體退化時，大量黃體細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊聚，在核膜下形成電子密度較高的半圓形或不規(guī)則結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)空泡較多，并且形成由質(zhì)膜包裹形成表面光滑的半圓形凋亡小體，后者被巨噬細(xì)胞或周圍鄰近的同類細(xì)胞吞噬［11］，這樣就造成了黃體細(xì)胞數(shù)目自Ⅲ期黃體后逐漸減少的情況，尤其是黃體組織在進入Ⅲ期黃體階段時因黃體的顯著退化而使得黃體細(xì)胞數(shù)目急劇減少。

本研究中，我們獲得了黃體各個方面的靜態(tài)信息，這些靜態(tài)信息體現(xiàn)了周期性黃體自發(fā)生、生長直至退化消失的整個過程中其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生的動態(tài)變化，有利于計算機模擬重構(gòu)周期性黃體組織的立體構(gòu)象，從而為開展相關(guān)的一些研究提供便利；這也對通過在組織和細(xì)胞水平上獲得數(shù)據(jù)，繼而利用計算機模擬重構(gòu)生物組織乃至器官等的立體構(gòu)象提供了思路。

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