廖澤勇，韋瑋

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023；2.廣西壯族自治區(qū)骨傷醫(yī)院，南寧 530012)

竹柏果皮和果殼中揮發(fā)油成分及其抗腫瘤活性研究

廖澤勇1，韋瑋2

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023；2.廣西壯族自治區(qū)骨傷醫(yī)院，南寧 530012)

目的 比較瑤藥竹柏果皮和果殼中揮發(fā)油成分，并對(duì)兩部位的揮發(fā)油進(jìn)行抗腫瘤活性研究。方法 應(yīng)用水蒸氣蒸餾法分別從竹柏果皮和果殼中提取揮發(fā)油，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法分析其化學(xué)成分；采用噻唑藍(lán)(MTT)法分別對(duì)果皮和果殼揮發(fā)油進(jìn)行抗腫瘤活性研究。結(jié)果 竹柏果皮揮發(fā)油收率為0.23%，分離出21種成分，鑒定18種，主要含有石竹烯，占揮發(fā)油總量的72.44%；竹柏果殼揮發(fā)油收率為0.15%，分離出15種成分，鑒定其中13種，與果皮共有4種成分；竹柏果皮和果殼揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌細(xì)胞均具有抑制增殖活性，半數(shù)抑制濃度分別為54.58和114.83 μg·mL-1，果皮揮發(fā)油抑制活性較強(qiáng)。結(jié)論 從竹柏果皮和果殼中提取揮發(fā)油主要成分為烯類、醇類、萜類，其中果皮揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

竹柏；揮發(fā)油；化學(xué)成分；抗腫瘤活性

竹柏[Podocarpusnagi(Thunb.)Zoll.et Mor.ex Zoll.Myrica nagi Thunb.]為羅漢松科植物竹柏的枝葉，又名鐵甲樹、羅漢柴、青柏木、竹葉圖、山杉等，主要分布于我國(guó)廣西、廣東、福建及臺(tái)灣等地。竹柏具有止血、接骨功效，主治外傷出血、骨折[1]?！墩憬幬镏参镏尽酚涊d其治外傷出血、骨折，外用適量鮮品搗敷，或干品末調(diào)敷[2]。竹柏多為瑤族民間用藥，具有凈化空氣、驅(qū)蚊蟲、抗污染和治療腫瘤的功效，還可以舒筋活血，治療腰肌勞損、止血接骨；治外傷骨折、刀傷、槍傷、狐臭、眼疾、感冒等；鮮樹皮或根適量，水煎熏洗患處，治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)竹柏的枝、葉及種子均含有多種有效化學(xué)成分，包括二萜類、竹柏內(nèi)酯類、黃酮、環(huán)肽類等，該類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抑制多種菌的活性[3-5]。此外，竹柏葉揮發(fā)油中含有欖香烯、蓽澄茄烯、β-古蕓香烯、蒎烯、石竹烯等[6]。為進(jìn)一步研究開發(fā)竹柏的果皮與果殼，筆者對(duì)竹柏果皮與果殼的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了初步篩選。

1 材料與方法

1.1 材料 竹柏果于2012年采自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園內(nèi)，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園凌征柱教授鑒定為羅漢松科竹柏屬植物竹柏[Podocarpusnagi(Thunb.)Zoll.et Mor.ex Zoll.Myrica nagi Thunb.]的果，陰干后將果皮和果殼剝離并粉碎，密封備用。鼻咽癌CNE細(xì)胞株購于中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫，胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibico公司，胎牛血清購自HyClone公司(批號(hào)：8172881)，二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(批號(hào)：116K012)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(批號(hào):120609)購自Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自康寧公司，無水硫酸鈉、乙醚為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器 揮發(fā)油提取器(四川蜀牛公司)；N-1100V-W(WD)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；300型氣質(zhì)聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)(Varian公司)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；倒置顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)；F200型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.3 揮發(fā)油提取 取粉碎后的竹柏果皮和果殼粉末100 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入5倍量去離子水浸泡12 h，電熱套加熱回流8 h，回流上層液用乙醚萃取3次，萃取液合并，除去乙醚，呈棕黃色油狀液體，加入無水硫酸鈉去除殘留水分，計(jì)算揮發(fā)油提取率。

1.4 GC-MS分析 GC分析條件：采用VF-5ms型石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，起始溫度60 ℃維持2 min，升溫到140 ℃維持5 min(升溫速率10 ℃·min-1)，再升溫到200 ℃維持15 min(升溫速率2 ℃·min-1)，最后升溫到250 ℃(升溫速率10 ℃·min-1)，維持溫度到完成樣品分析，載氣為高純氦(He)(99.9%)，柱流量為1.0 mL·min-1，氣化室溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比20：1。

MS分析條件：質(zhì)譜儀為Varian 300-MS，EI離子源，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為45～500 AMU，掃描周期1 s，電子能量1.12×10-17J(70 eV)，傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為200 ℃。

1.5 抗腫瘤活性測(cè)定 取胰蛋白酶消化后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用細(xì)胞完全培養(yǎng)液稀釋至5×104個(gè)·mL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔190 μL。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組按倍半稀釋法設(shè)置5個(gè)不同濃度藥液，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組、正常對(duì)照組，每組4個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg·mL-1MTT 10 μL，之后培養(yǎng)4 h形成甲穳沉淀，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，使甲臜結(jié)晶充分溶解，呈現(xiàn)深藍(lán)色，選擇492 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度(A值)，記錄結(jié)果，按下式計(jì)算各藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率[7]。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 竹柏果皮和果殼揮發(fā)油的化學(xué)成分比較 采用水蒸氣蒸餾法從竹柏果皮和果殼中提取揮發(fā)油，得率分別為0.23%和0.15%，果皮揮發(fā)油得率較高。經(jīng)GC-MS對(duì)2種竹柏部位揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，得到其總離子流圖，竹柏果皮、果殼分別檢測(cè)出21，15種成分。經(jīng)計(jì)算機(jī)NIST05數(shù)據(jù)庫檢索離子峰組分，并采用面積歸一化法計(jì)算其含量，確定竹柏果皮揮發(fā)油18種成分、竹柏果殼13種成分，其中果皮主要成分為β-石竹烯(41.25%)、α-石竹烯(31.19%)，果殼中主要成分為n-十六碳酸(36.51%)、2-氯乙基亞油酸(33.25%)、順-11-十六碳烯酸(22.85%)，兩者共有成分僅4種，存在較大差異。結(jié)果見圖1，2和表1。

1.β-石竹烯；2.α-石竹烯

Fig.1 GC-MS chromatogram of volatile oil fromPodocarpusnagipeel

1.n-十六碳酸；2.2-氯乙基亞油酸

Fig.2 GC-MS chromatogram of volatile oil fromPodocarpusnagishell

2.2 竹柏果皮和果殼揮發(fā)油抗腫瘤活性 20，40，80，100，120 μg·mL-1竹柏果皮揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌CNE細(xì)胞的抑制率分別為(22.62±0.54)%，(43.02±1.27)%，(52.55±2.83)%，(73.24±1.79)%，(84.18±3.37)%；20，40，80，100，120 μg·mL-1竹柏果殼揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌CNE細(xì)胞的抑制率分別為(18.37±1.13)%，(23.74±0.52)%，(38.55±1.04)%，(42.96±2.15)%，(68.14±2.06)%。不同濃度的竹柏果皮和果殼揮發(fā)油對(duì)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞鼻咽癌CNE的增殖有不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系，半數(shù)抑制濃度分別為54.58和114.83 μg·mL-1。當(dāng)果皮和果殼揮發(fā)油作用濃度為200 μg·mL-1時(shí)對(duì)鼻咽癌CNE細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)。果皮揮發(fā)油抗腫瘤活性優(yōu)于果殼揮發(fā)油。

表1 竹柏果皮和果殼的揮發(fā)油成分比較

…：未測(cè)出

…：not detected

3 討論

竹柏為羅漢松科裸子植物，起源于白堊紀(jì)，常被稱為植物界活化石，多為雌雄異株，生殖器官較為特殊。為獲取更多化學(xué)特征及更多藥理活性物質(zhì)，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取竹柏果皮和果殼中的揮發(fā)油，抗腫瘤活性較強(qiáng)的果皮揮發(fā)油中主要成分為石竹烯，具有潛在的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。石竹烯是一種雙環(huán)倍半萜型的天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有局部麻醉、抗炎、驅(qū)除蚊蟲、抗焦慮和抑郁、鎮(zhèn)咳和祛痰、鎮(zhèn)痛、細(xì)胞毒性等作用[8]。MONZOTE等[9]研究表明，石竹烯氧化物能抑制線粒體電子傳遞體復(fù)合物Ⅰ，從而抑制呼吸鏈，具有細(xì)胞毒性。石竹烯細(xì)胞毒作用可能通過抑制呼吸鏈而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。果殼揮發(fā)油與果皮成分差異較大，主要成分包括n-十六碳酸、2-氯乙基亞油酸、順-11-十六碳烯酸，均為接近果仁成分的脂肪酸類物質(zhì)，其抗腫瘤活性較弱。筆者研究竹柏果揮發(fā)油成分，發(fā)現(xiàn)竹柏果皮中含有能顯著抑制人鼻咽癌CNE細(xì)胞增殖作用的成分。因此，具有豐富資源的瑤藥竹柏值得進(jìn)一步深入研究和開發(fā)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.011

Studies on Volatile Constituents and Their Anti-tumor Activities from the Peel and Shell ofPodocarpusnagiFruits

LIAO Zeyong1, WEI Wei2

(1.BotanicalGardenofMedicinalPlant,GuangxiZhuangAutonmousRegion,Nanning530023,China;2.OrthopedicsHospital,GuangxiZhuangAutonmousRegion,Nanning530012,China)

Objective To compare the volatile constituents and anti-tumor activity from the peel and shell parts ofPodocarpusnageiafruits. Methods Steam distillation was used for extracting volatile oil from the peel and nutshell ofPodocarpusnageia, and gas chromatography-mass spectrometry was exploited to compare the chemical compositions.Their anti-tumor activities were studied by the MTT assay. Results The yield of volatile oil from nageia peel was 0.23%.The total of 21 kinds of composition were isolated and 18 kinds were identified, the main composition was caryophyllene, accounting for 72.44% contents of the total volatile oil.The volatile oil from nageia nutshell was 0.15%.Fifteen kinds of composition were isolated and 13 species were identified from the nutshell.Four compositions were found in both two parts.The volatile oil from both of nageia peel and nutshell inhibitted nasopharyngeal carcinoma cells proliferationinvitro, and theIC50were 54.58 and 114.83 μg·mL-1, which indicated that the volatile oil from the peel showed stronger inhibitory activity. Conclusion The main components in the volatile oil from nageia fruit are alkenes, alcohols and terpenes.The volatile oil extracted from peel shows comparable stronger anti-tumor activity.

Podocarpusnagi; Volatile oil; Chemical components; Anti-tumor activity

2014-03-12

2014-05-09

廖澤勇(1984-)，男，湖南郴州人，助理研究員，碩士，研究方向：中藥藥效學(xué)。電話：0771-5611352，E-mail：ijoding@qq.com。

R282.71；R285.5

B

1004-0781(2015)05-0609-04