王軍娥，景維坤，王佳敏，亢秀萍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

植物生長過程與外界環(huán)境密切相關(guān)，其中包括溫度、光照、水分、土壤和養(yǎng)分等。目前全球面臨著水資源嚴(yán)重缺乏的局面，我國很多地區(qū)屬于干旱或者半干旱。因此，水資源短缺的現(xiàn)狀，嚴(yán)重制約我國農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展[1]。石竹科(Caryophyllaceae)石竹屬(DianthusL.)植物大多數(shù)為多年生草本植物，花色艷麗、花期較長且適應(yīng)性強(qiáng)，在園林綠化中應(yīng)用廣泛。山西省內(nèi)由于自然降雨量少，干旱環(huán)境制約石竹屬植物的觀賞價值和園林應(yīng)用效果[2-3]。目前，關(guān)于石竹屬植物的干旱脅迫研究多集中在水分脅迫對植株單個機(jī)理如形態(tài)、生理或光合特性等的影響方面[4-5]。研究表明，對任何單項(xiàng)指標(biāo)和機(jī)理的研究都有一定局限性，不能有效、準(zhǔn)確地評價植物抗旱性[6]。采用隸屬函數(shù)法對多個指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，可以消除個別指標(biāo)帶來的片面性，從而提高篩選的可靠性[7]。

本試驗(yàn)通過分析干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的形態(tài)變化、生理機(jī)制和相關(guān)基因表達(dá)量的變化，探討干旱對石竹屬植物生長發(fā)育的影響，進(jìn)而篩選出抗旱能力較強(qiáng)的石竹材料，為石竹屬植物的抗旱種質(zhì)資源篩選以及在山西省園林綠化中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)在山西省晉中市太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室和花卉實(shí)踐教學(xué)基地內(nèi)完成。該地區(qū)處于東經(jīng)112°28′～113°08′，北緯37°12′～37°32′，年平均氣溫5℃～10℃，年平均降雨量462.9 mm。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為石竹科石竹屬的瞿麥(DianthussuperbusL.)、常夏石竹(Dianthusplumarius)、中國石竹(DianthuschinensisL.)和須苞石竹(DianthusbarbatusL.)，編號分別為D1、D2、D3和D4，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)收集并保存。在試驗(yàn)中，均選用純度高、充實(shí)飽滿、發(fā)芽率高的種子播種，選取長至8片真葉的幼苗進(jìn)行后續(xù)干旱脅迫處理。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)栽培基質(zhì)為(園土∶樹皮∶沙子=3∶1∶1)，其中園土為山西太谷本地土壤(褐土)。播種前每盆基質(zhì)加5 g復(fù)合肥(N∶P∶K=1∶1∶1)，盆+基質(zhì)2.2 kg，澆透底水后，盆+基質(zhì)+水為3.96 kg，每盆土壤含水量一致。待石竹幼苗長至8片真葉時，選生長健壯、長勢一致的幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理。每種390株(每盆種10株，13盆，花盆規(guī)格為36 cm×20 cm×16 cm)，重復(fù)3次。置于溫室內(nèi)，緩好苗后進(jìn)行干旱脅迫。

每種取3盆作對照，另外10盆經(jīng)干旱脅迫處理。對照組正常澆水，干旱處理組自然干旱，直至干旱死亡。在干旱脅迫處理0、2、4、6、8、10 d和12 d分別采頂部第3～4個葉片，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。每個指標(biāo)重復(fù)3次，并記錄其生長狀況，具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 石竹屬植物生長狀況分級標(biāo)準(zhǔn)

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 生理指標(biāo) 葉片相對含水量的測定采用烘干稱重法[8]。葉綠素含量測定采用丙酮浸提法[10]?？扇苄缘鞍缀繙y定采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[9]。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[10]。超氧化物酶歧化酶活性測定采用氮藍(lán)四唑光還原法[10]。脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法[10]。

1.4.2 實(shí)時熒光定量PCR 本試驗(yàn)使用RNAprep Pure Plant Kit(DP441，TIANGEN)試劑盒提取石竹葉片RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以18srRNA為內(nèi)參基因，SYBR?Premix Ex TaqTM II(Takara)實(shí)時定量試劑盒，比較抗逆性相關(guān)基因DtPOD和DtSOD在4種不同石竹屬植物中的表達(dá)情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用隸屬函數(shù)法[11]對不同石竹品種的抗旱能力進(jìn)行綜合評價。隸屬函數(shù)值的計(jì)算公式如下：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

或

U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)
i= 1，2，3，…

(2)

式中，Xi為某一指標(biāo)的測定值/對照值，Xmin為所有供試材料該指標(biāo)測定值/對照值中的最小值，Xmax為所有供試材料該指標(biāo)測定值/對照值中的最大值。若所用指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)，用式(1)，反之用式(2)。計(jì)算出不同石竹品種的抗旱隸屬值平均值，平均值越大，抗旱性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的形態(tài)變化

由表2可知，在干旱脅迫前期，4種植物的生長變化不明顯；當(dāng)干旱脅迫處理4～8 d時，中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)率先開始萎蔫，而常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)仍保持正常生長；當(dāng)干旱脅迫處理8～12 d，隨著干旱脅迫程度加重，常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)開始出現(xiàn)萎蔫，而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)則受傷程度加重，停止生長甚至達(dá)到半致死程度。從外部形態(tài)變化可知4種石竹屬植物的抗旱性大小為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。

2.2 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物相關(guān)生理特性分析

2.2.1 干旱脅迫下石竹屬4種植物土壤含水量變化 由圖1可知，在整個干旱脅迫期間土壤含水量呈明顯下降趨勢，4種石竹屬植物的土壤含水量下降趨勢基本保持一致；4種植物土壤含水量在同一時期差異較小，但常夏石竹(D2)的土壤含水量在整個干旱脅迫過程中的整體水平較其它材料高。

表2 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的生長狀況

圖1 干旱脅迫下土壤含水量變化Fig.1 The variation of soil moisture content under drought stress

2.2.2 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片相對含水量的影響 由圖2(A)可知，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，4種石竹屬植物葉片相對含水量整體呈下降趨勢。干旱脅迫處理0～4 d時，各材料葉片相對含水量下降趨勢基本一致。在干旱脅迫4 d時，瞿麥(D1)、常夏石竹(D2)、中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)的葉片相對含水量分別比對照組下降了17.94%、16.66%、22.88%和22.09%；在干旱脅迫10 d時，常夏石竹(D2)的葉片相對含水量最高，為43.63%，中國石竹(D3)最低，為22.72%。

2.2.3 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片葉綠素含量的影響 由圖2(B)可以看出，4種石竹屬植物在干旱脅迫過程中，葉片葉綠素含量整體上呈先升后降的趨勢。在干旱脅迫第4 d時，4種植物Chl含量均達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢。在干旱脅迫第12 d時，4種石竹屬材料葉片中的Chl含量從高到低依次為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。

2.2.4 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片丙二醛含量的影響 干旱脅迫下，丙二醛含量越多，則表明植物組織對逆境的防御能力越弱。由圖2(C)可知，在干旱脅迫下，4種植物的丙二醛含量變化呈持續(xù)上升趨勢。在干旱脅迫第10 d，4種不同材料丙二醛含量分別比對照組增加了451.61%、353.45%、724.32%、647.95%；在干旱脅迫12 d時，4種不同石竹屬植物的丙二醛含量由大到小為：中國石竹(D3)>須苞石竹(D4)>瞿麥(D1)>常夏石竹(D2)。

2.2.5 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片可溶性蛋白含量的影響 由圖2(D)可知，在干旱脅迫第4 d時，中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)的可溶性蛋白含量分別增加31.23%和29.92%。在干旱脅迫第12 d，瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的可溶性蛋白含量呈上升趨勢，分別為對照的53.97%和63.12%，中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)可溶性蛋白含量則急劇下降，僅為對照的7.11%和8.88%。

2.2.6 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片SOD活性的影響 由圖2(E)可知，4種石竹屬植物葉片SOD活性在干旱脅迫前期均呈現(xiàn)升高趨勢。在干旱脅迫4～8 d期間，瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)SOD活性緩慢上升，而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)SOD活性上升幅度較大；在干旱脅迫8～12 d，瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)SOD活性繼續(xù)保持緩慢上升，而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)SOD活性則大幅度下降。在干旱脅迫后期，4種石竹屬植物仍保持較高的SOD酶活性，均高于初始水平，表明SOD酶活性與植物的抗旱性密切相關(guān)。

2.2.7 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片脯氨酸含量的影響 由圖2(F)可知，在干旱脅迫期間，4種石竹屬植物葉片脯氨酸含量呈上升趨勢。在干旱脅迫0～10 d，與對照組相比，4種石竹屬植物葉片的脯氨酸含量均呈持續(xù)上升趨勢，但是增加幅度不同。在干旱脅迫10 d時，須苞石竹(D4)脯氨酸含量增加最多，為對照組的12.73倍，其次是中國石竹(D3)，為11.21倍，瞿麥(D1)為8.02倍，常夏石竹(D2)增加最少，僅為4.75倍；干旱脅迫10～12 d，常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)的脯氨酸含量繼續(xù)增加而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)則開始下降。

2.3 4種不同石竹屬植物的抗旱性綜合分析

本試驗(yàn)以石竹屬4種不同植物的葉片相對含水量、SOD活性、Chl含量、MDA含量、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量6個生理指標(biāo)，并結(jié)合隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐旱性綜合評價。從表3可知，4種植物的抗旱性從強(qiáng)到弱依次為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。

圖2 干旱脅迫對葉片生理指標(biāo)的影響Fig.2 The effect of drought stress on the physiological indexes

材料編號Materialnumber葉片相對含水量Leaf relativewater contentChl.含量Chl. contentMDA含量MDA content可溶性蛋白含量Soluble proteincontentSOD活性SOD activityPro含量Proteincontent隸屬函數(shù)總值 Total subordinatefunction隸屬函數(shù)均值Mean subordinatefunction排名RankD10.74440.76670.78810.7590.7220.61154.39170.62742D20.93140.8810.90120.95270.83460.70735.20820.7441D30.04510.15240.13330.07880.24230.12780.77970.11144D40.14140.35720.23530.25450.12410.40361.51610.21663

2.4 4種不同石竹屬植物的抗氧化酶基因表達(dá)分析

2.4.1DtPOD基因在4種不同石竹屬植物中的表達(dá)分析 在干旱脅迫2、4、6、8、10 d，分別采集4種不同石竹屬植物葉片提取RNA，檢測DtPOD基因的表達(dá)情況。從圖3(A)可知：在整個干旱脅迫期間，DtPOD基因在4種不同石竹屬植物葉片中的表達(dá)水平呈先升后降的趨勢；干旱脅迫第6 d時，常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)的DtPOD基因表達(dá)量達(dá)到了最大值，常夏石竹(D2)的變化倍數(shù)為對照組的24.18倍，瞿麥(D1)為對照組的15.01倍；干旱脅迫10 d時，與對照組相比，常夏石竹(D2)DtPOD基因相對表達(dá)量仍高達(dá)12.82倍，其次是瞿麥(D1)為3.75倍，須苞石竹(D4)為0.34倍，中國石竹(D3)最低，僅為初始表達(dá)量的0.15倍。

2.4.2DtSOD基因在石竹屬4種植物中的表達(dá)分析 干旱脅迫下，DtSOD基因在4種不同石竹屬植物中的表達(dá)情況如圖3(B)所示。從圖中可知，在干旱脅迫前期(0～4 d)，DtSOD基因在瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的表達(dá)量呈略微下降趨勢，而須苞石竹(D4)和中國石竹(D3)的表達(dá)量顯著增加且在處理4 d時表達(dá)量達(dá)到最高值；干旱脅迫第10 d時，與對照相比，DtSOD基因在4種不同石竹屬植物的表達(dá)量差異較大，從高到低依次為：常夏石竹(2.46倍)>瞿麥(2.17倍)>須苞石竹(0.40倍)>中國石竹(0.23倍)。

圖3 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的基因表達(dá)分析Fig.3 Analysis of gene expression in four Dianthusplants under drought stress

3 討 論

3.1 抗旱性生理指標(biāo)分析

植物的光合速率大小與植物體內(nèi)的水分狀況直接相關(guān)，而植物體內(nèi)的水分大部分是由根系從土壤中獲取，光合速率大小間接地與土壤水分狀況密切相關(guān)[12]。在土壤缺水的情況下，植物光合速率受到抑制[5]。在相同的干旱脅迫條件下，抗旱性強(qiáng)的植物葉片含水量下降慢且降幅小，能保持較好的水分平衡；反之，相對含水量下降的快且幅度大，水分平衡能力差，植物的抗旱能力弱[13]。本試驗(yàn)中瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的葉片相對含水量下降幅度較須苞石竹(D4)和中國石竹(D3)小，說明瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的抗旱性相對較強(qiáng)。

葉綠素是參與植物光合作用的重要物質(zhì)，葉綠素含量變化可以反映植物受干旱脅迫的程度[11]。本試驗(yàn)干旱脅迫前期，4個供試材料Chl含量均呈上升趨勢。干旱脅迫下，Chl含量變化的這種差異可能與植物自身的生物學(xué)特性和干旱脅迫發(fā)生的強(qiáng)度、時期或持續(xù)時間有關(guān)[14]。

干旱脅迫對植物的傷害首先表現(xiàn)為膜脂過氧化[15]，MDA含量的高低反映了膜脂過氧化以及膜結(jié)構(gòu)受傷害的程度[16]。本試驗(yàn)中，隨干旱脅迫時間的延長，MDA含量增加。在干旱脅迫的前6 d，MDA含量上升相對緩慢，但在干旱脅迫10 d后，發(fā)現(xiàn)中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)MDA含量降低，可能是由于干旱脅迫程度嚴(yán)重，植物產(chǎn)生的活性氧含量降低，導(dǎo)致MDA含量降低，說明中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)的抗旱性弱于瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)。植物在抵御不良環(huán)境時，其自身會形成一些防御機(jī)制，如啟動抗氧化系統(tǒng)、進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)等[17]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等抗氧化酶是植物活性氧清除系統(tǒng)中重要的酶，在一定脅迫范圍內(nèi)可以維持活性，在干旱脅迫2 d后其活性大幅度提高，6 d后開始下降；而Pro含量在干旱前期增加緩慢，4 d后開始迅速積累，表明在干旱前期，抵御干旱的滲透性物質(zhì)主要為可溶性蛋白質(zhì)，而在干旱后期，即干旱脅迫程度較大時，主要發(fā)揮作用的滲透性物質(zhì)是脯氨酸[18-21]。干旱脅迫使SOD活性升高，但每個材料SOD活性增加趨勢有差異。根據(jù)馬宗仁等[22]的時間差理論，植物存在一個耐受脅迫的極限。中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)在干旱脅迫8d后，SOD活性達(dá)到了耐旱脅迫，隨后SOD活性開始急劇下降；瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)則在干旱脅迫前期SOD活性下降，隨后SOD活性平穩(wěn)上升，表現(xiàn)出對干旱脅迫有較強(qiáng)的適應(yīng)性。

3.2 抗氧化酶基因表達(dá)量分析

本試驗(yàn)中，兩個基因在4種石竹屬植物不同干旱脅迫時期的相對表達(dá)量變化趨勢不一致。在干旱脅迫前期，DtPOD基因的表達(dá)量在瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)較中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)增幅大，其抗旱性強(qiáng)弱與表達(dá)量呈正相關(guān)，表達(dá)量越高，其抗旱性越強(qiáng)。對于DtSOD基因，干旱脅迫前期，抗旱性強(qiáng)的植物SOD酶活較低；在干旱脅迫中后期，酶活性逐漸升高，抗旱性越強(qiáng)，該基因表達(dá)量越高，可能是由于基因調(diào)控表達(dá)在時間和空間上的差異導(dǎo)致，因此需要深入探究。

綜上所述，在不同的干旱脅迫處理下，4個不同石竹屬植物在形態(tài)、生理以及抗氧化酶基因表達(dá)方面表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。結(jié)合隸屬函數(shù)法對干旱脅迫下的不同指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，得出4個不同石竹屬植物的耐旱性由強(qiáng)到弱依次為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。