王健，王信，陳琳潔，李志軍

(安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，蚌埠 233004)

白芍總苷對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血B細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)的影響*

王健，王信，陳琳潔，李志軍

(安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，蚌埠 233004)

目的 探討白芍總苷(TGP)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血B細(xì)胞內(nèi)Toll樣受體9(TLR9)表達(dá)的影響。方法 選取SLE患者60例和正常健康人30例，分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，每份標(biāo)本均分為4組體外培養(yǎng)，即空白對照組、胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤-寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)組、CpG-ODN+TGP組和TGP組。空白對照組僅加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，其他3組分別加入CpG-ODN(ODN終濃度1 μmol·L-1)、CpG-ODN+TPG(TPG最適終濃度為1×10-4mol·L-1)、TPG。各組均培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組B細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)。結(jié)果 ①正常健康人：CpG-ODN組和空白對照組TLR9的表達(dá)率分別為(9.10±2.12)%，(4.96±2.11)%(P<0.01)；②SLE患者：CpG-ODN組的TLR9表達(dá)率(14.86±3.42)%，顯著高于空白對照組的(9.20±3.43)%(P<0.01)，CpG-ODN+TGP組的TLR9表達(dá)率(11.95±3.63)%，低于CpG-ODN組(P<0.05)；在SLE輕度活動患者中，CpG-ODN組和空白對照組TLR9的表達(dá)率分別為(10.74±3.17)%，(5.19±2.05)%(P<0.05)；在SLE中重度活動患者中，CpG-ODN組和空白對照組TLR9的表達(dá)率分別為(16.51±1.72)%，(10.80±2.37)%(P<0.01)，CpG-ODN+TGP組TLR9的表達(dá)率(13.59±2.58)%，低于CpG-ODN組(P<0.01)。結(jié)論 TGP可以拮抗CpG-ODN對B細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)的上調(diào)作用。

白芍總苷；紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；寡聚脫氧核苷酸；Toll樣受體

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是典型的自身免疫性疾病，其特點為患者體內(nèi)存在多種針對核抗原的自身抗體，抗原抗體形成免疫復(fù)合物并沉積于器官和組織，引起多系統(tǒng)受累。SLE的病理生理尚未完全了解，研究表明，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為天然免疫中重要的模式識別受體，在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用，特別是TLR7和TLR9涉及免疫復(fù)合物識別，激活B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，參與SLE的發(fā)病[1]，并可減弱糖皮質(zhì)激素對SLE的作用[2]。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是白芍的提取物，具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[3]，對SLE亦有治療作用，可以減少糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制藥的用量[4]。然而，TGP治療SLE的作用機制目前尚不十分清楚。為深入了解TGP的藥理學(xué)作用機制，為其治療SLE提供科學(xué)依據(jù)，筆者應(yīng)用TGP與外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)在體外共同孵育，探討其對SLE患者外周血B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2011年6月—2012年1月門診及住院患者，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(the American College of Rheumatology，ACR)1997年修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。共選擇SLE患者60例，其中女59例，男1例，平均年齡(33.20±12.35)歲。均排除了病毒性肝炎、腫瘤和其他自身免疫疾病。所有患者6個月內(nèi)未使用過抗瘧疾類藥物。SLE活動性指數(shù)(SLEDAI評分)的評分標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)方法評分[6]。將SLE患者組按SLEDAI評分分為輕度活動(SLEDAI<10分)與中重度活動(SLEDAI≥10分)，各30例。對照組30例為本院健康志愿者，平均年齡(28.37±11.30)歲。兩組性別、年齡構(gòu)成等均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本試驗獲得本單位倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試對象均知情同意。

1.2 試劑 胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤-寡聚脫氧核苷酸(cytosine phosphate guanine-oligodeoxynucleotides,CpG-ODN)的配制：CpG-ODN由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，高效液相色譜純化，序列如下：5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′；所有ODN的堿基全部經(jīng)硫代修飾，紫外分光光度計定量，內(nèi)毒素<0.25 EU·mg-1，無菌0.9%氯化鈉溶液溶解，配成100 μmol·L-1儲存液，分裝后-20 ℃凍存。RPMI-1640配制：RPMI-1640干粉(GIBCO公司)，用超純水(Pall Pure Lab Plus UV/UF機制備)配制，補充L-谷氨酰胺2 mmol·L-1、二巰基乙醇 50 μmol·L-1、丙酮酸鈉1 mmol·L-1、Hepes10 mmol·L-1、慶大霉素50 U·mL-1，調(diào)pH至7.2，經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜濾過除菌后4 ℃?zhèn)溆?。使用前?00 mL·L-1滅活新生小牛血清(new born bovine serum，NBS)。TGP溶液的配制：本試驗所用的TGP為寧波朗生醫(yī)藥有限公司提供的TGP干粉，含量為90%，用配好的無菌RPMI-1640液配制，濃度為1×10-2mol·L-1，經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜濾過除菌后4 ℃?zhèn)溆?。使用前用無菌RPMI-1640液稀釋10倍。

流式細(xì)胞儀所用檢測抗體中PE-Cy5.5標(biāo)記抗CD19單克隆抗體(小鼠抗人，批號：MHCD1918)和 PE-Cy5.5標(biāo)記Mouse IgG1(批號：MG118，Isostype-Control)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；PE標(biāo)記抗TLR9(CD289)單克隆抗體(大鼠抗人，批號：12-9099-82)和PE標(biāo)記Rat IgG2a(批號：12-4321)均為美國eBioscience公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀，德國Eppendor公司生產(chǎn)的Eppendor 5810R低溫離心機，蚌埠凈化設(shè)備廠生產(chǎn)的CX-201型垂直層流工作臺，美國Harris公司生產(chǎn)的Harris hw0301，T-VBA型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱。

1.4 實驗方法 無菌采集清晨空腹靜脈血20 mL，分離PBMC，收集離心后的細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活力，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個·mL-1，接種于24孔板中，每孔1 mL。置37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每份標(biāo)本均分為4組體外培養(yǎng)，即空白對照組、CpG-ODN組、CpG-ODN+TGP組和TGP組，空白對照組僅加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，另3組組分別加入CpG-ODN(ODN終濃度1 μmol·L-1)、CpG-ODN+TPG(TPG最適終濃度為1×10-4mol·L-1)、TPG。各組均培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞及上清液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)后各組外周血CD19+B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)，比較各組之間TLR9的表達(dá)有無差異。

2 結(jié)果

2.1 正常健康人B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)后TLR9的變化 CpG-ODN組TLR9的表達(dá)率顯著高于空白對照組(P<0.01)，平均熒光強度(mean flourscence indensity，MFI)顯著高于空白對照組(P<0.05)。見表1。

2.2 SLE患者B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)后TLR9表達(dá)的變化 CpG-ODN組TLR9的表達(dá)率顯著高于空白對照組和CpG-ODN+TPG組(P<0.01或P<0.05)。 見表2。

2.3 不同活動度患者B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)情況比較 在SLE輕度活動患者中，CpG-ODN組TLR9的表達(dá)率顯著高于空白對照組(P<0.01)。見表3。

表1 正常健康人B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)后TLR9的變化

Tab.1 Change of TLR9 expression in B lymphocytes from healthy people after cultureinvitro

組別TLR9+細(xì)胞比例/%TLR9+細(xì)胞的MFI空白對照組4.96±2.1111.44±3.05CpG-ODN組9.10±2.12*116.28±3.48*2CpG-ODN+TPG組6.98±2.1017.34±3.29TPG組5.43±1.6011.88±2.68

與空白對照組比較，t=3.239，*1P<0.01；t=2.596，*2P<0.05

Compared with blank control group，t=3.239，*1P<0.01；t=2.596，*2P<0.05

表2 SLE患者B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)后TLR9的變化

Tab.2 Change of TLR9 expression in B lymphocytes from SLE patients after cultureinvitro

組別TLR9+細(xì)胞比例/%TLR9+細(xì)胞的MFI空白對照組9.20±3.4313.94±1.13CpG-ODN組14.86±3.42*1*213.88±0.93CpG-ODN+TPG組11.95±3.6313.66±1.18TPG組9.47±3.3413.57±1.57

與空白對照組比較，t=4.376，*1P<0.01；與CpG-ODN+TPG組比較，t=2.182，*2P<0.05

Compared with blank control group，t=4.376，*1P<0.01；compared with CpG-ODN plus TPG group,t=2.182，*2P<0.05

表3 SLE輕度活動組患者B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后TLR9的變化

Tab.3 Change of TLR9 expression in B lymphocytes from SLE patient at slightly active degree after cultureinvitro

組別TLR9+細(xì)胞比例/%TLR9+細(xì)胞的MFI空白對照組5.19±2.0513.16±1.15CpG-ODN組10.74±3.17*113.90±1.02CpG-ODN+TPG組7.87±2.4613.44±1.29TPG組5.65±2.1313.06±2.03

與空白對照組比較，t=2.937，*1P<0.01

Compared with blank control group，t=2.937，*1P<0.01

在SLE中重度活動患者中，CpG-ODN組TLR9的表達(dá)率顯著高于空白對照組和CpG-ODN+TPG組(均P<0.01)。見表4。

表4 SLE中重度活動患者B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后TLR9的變化

Tab.4 Change of TLR9 expression in B lymphocytes from SLE patients at moderately to vigorously active degree after cultureinvitro

組別TLR9+細(xì)胞比例/%TLR9+細(xì)胞的MFI空白對照組10.80±2.3714.05±1.16CpG-ODN組16.51±1.72*114.03±0.81CpG-ODN+TPG組13.59±2.5813.78±1.18TPG組11.10±2.3413.85±1.29

與空白對照組和CpG-ODN+TPG組比較，t=6.170，2.986，*1P<0.01

Compared with normal control group and CpG-ODN plus TPG group，t=6.170，2.986，*1P<0.01

3 討論

SLE是一種以自身反應(yīng)性B細(xì)胞活化，多種自身抗體產(chǎn)生為特征的典型的自身免疫病，其發(fā)病機制尚未完全闡明。研究表明，TLRs對核酸成分的識別在SLE的自身反應(yīng)性B細(xì)胞的活化和免疫復(fù)合物的沉積過程中發(fā)揮重要作用，特別是TLR7/9在SLE發(fā)病機制中有重要作用[7]。

人TLR9高表達(dá)于B細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，主要識別病毒和細(xì)菌中未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤序列(CpG-DNA)，所以DNA病毒可引起TLR9介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，如鼠巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1和2型及腺病毒均可以通過TLR9識別和激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞從而產(chǎn)生干擾素-α(interferon-α,IFN-α)等細(xì)胞因子。TLR9也可以識別人工合成的CpG-ODN，可以模擬細(xì)菌或病毒DNA，具有相同的免疫刺激活性，CpG-ODN有B/K型、A/D型[8]及介于前兩型之間的C型，后者擁有獨特的5′端CpG修飾和3′端回文結(jié)構(gòu)，既可以激活B細(xì)胞又可以引起IFN-α的分泌[9]，而IFN-α為SLE患者血漿中高表達(dá)的細(xì)胞因子之一，可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟、分化，并能增強其對自身抗原的捕獲和呈遞能力，從而打破耐受，誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答，與SLE的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸相關(guān)[10]。王濤等[11]研究證實：SLE患者血漿IFN-α表達(dá)水平比健康人顯著增高，與SLE患者疾病活動程度及部分臨床指標(biāo)有一定的相關(guān)性，IFN-α在SLE的發(fā)病中可能發(fā)揮著重要的作用。另一方面，應(yīng)用IFN-α治療不伴有自身免疫性疾病的患者會出現(xiàn)抗核抗體、抗ds-DNA抗體，甚至SLE綜合征[12]。本試驗中所用的CpG-ODN即為具有代表性的C型CpG-ODN。

本試驗應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)48 h后PBMC中B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在正常健康人和SLE患者中，加入CpG-ODN組的TLR9+細(xì)胞的比例顯著高于空白對照組。同時，與空白對照組比較，CpG-ODN可以上調(diào)不同活動組患者PBMC中B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)水平，且在中重度活動組中表現(xiàn)更為突出。ZORRO等[13]發(fā)現(xiàn)來源于SLE患者的B淋巴細(xì)胞對CpG-ODN的反應(yīng)與SLE患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，本研究所得結(jié)果與此相同。推測CpG-ODN所引起的生物學(xué)效應(yīng)可能是通過增加細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)來完成的。相關(guān)研究也證實CpG-ODN可以增加TLR9的表達(dá)，且這種增加可以被靜脈注射用免疫球蛋白減弱[14]。但是，在SLE患者中，CpG-ODN組TLR9+細(xì)胞的MFI與空白對照組無明顯差異，這跟正常健康人有所不同?？赡芤騇FI主要是反映單個細(xì)胞上某種蛋白表達(dá)的強弱，SLE患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞功能有所缺陷，不同程度上影響了體內(nèi)B細(xì)胞免疫反應(yīng)，各組之間B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)的MFI水平有所不同，主要是表達(dá)TLR9蛋白的細(xì)胞數(shù)增多，而并非單個細(xì)胞上TLR9蛋白表達(dá)數(shù)量的增多，而在正常健康人中，由于其PBMC中B淋巴細(xì)胞功能完好，刺激后不僅表達(dá)TLR9蛋白的細(xì)胞數(shù)增多，而且在單個細(xì)胞上TLR9蛋白表達(dá)數(shù)量也有增加。

TGP加入含CpG-ODN的PBMC中共同培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，TLR9的表達(dá)量低于CpG-ODN組，提示TGP有拮抗CpG-ODN上調(diào)TLR9的作用，且和患者病情活動度相關(guān)。對TGP組結(jié)果分析顯示，TLR9的表達(dá)量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示TGP本身可能沒有直接減弱TLR9表達(dá)的作用，而是在TLR9異常升高時通過某些物質(zhì)對TLR9的上調(diào)作用來實現(xiàn)的。研究顯示TGP可以抑制SLE患者和正常人PBMC分泌IFN-α[15]，而SLE患者體內(nèi)IFN-α含量應(yīng)該是升高的，且與TLR9相關(guān)[16]，間接提示TGP本身不能直接減弱TLR9的表達(dá)。張洪峰等[17]報道，SLE患者長期堅持應(yīng)用TGP，可減少日平均潑尼松用量及環(huán)磷酰胺總量，減少復(fù)發(fā)例數(shù)及感染事件的發(fā)生，尤其是連續(xù)服用>5年者。研究發(fā)現(xiàn)，TGP可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3啟動子甲基化的狀態(tài)，激活I(lǐng)FN-γ和白細(xì)胞介素-2的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分化，從而抑制SLE患者的自身免疫反應(yīng)[18]；可以通過選擇性阻礙TLR4/5的信號傳導(dǎo)，抑制樹突狀細(xì)胞的成熟與功能[19]。丁朝霞等[20]觀察TGP對小鼠狼瘡性腎炎的影響發(fā)現(xiàn)，TGP可以降低尿蛋白含量和血清抗dsDNA抗體、抗核抗體水平，明顯改善腎組織病理損害，對小鼠狼瘡性腎炎具有一定療效。

總之，本研究結(jié)果表明，CpG-ODN可以促進外周血PBMC中B淋巴細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)，TGP可以減弱CpG-ODN對TLR9的表達(dá)上調(diào)作用，為深入研究TGP治療SLE等自身免疫性疾病的機制提供線索。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.006

Effect of Total Glucosides of Paeony on the Expression of Toll-like Receptor 9 in Peripheral Blood B Cells of Patients with Systemic Lupus Erythematosus

WANG Jian, WANG Xin, CHEN Linjie, LI Zhijun

(DepartmentofRheumatologyandImmunology,theFirstHospitalAffiliatedtoBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China)

Objective To investigate the effect of total glucosides of paeony (TGP) on the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in peripheral blood B lymphocytes of the patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Sixty SLE patients and thirty healthy volunteers were enrolled, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from blood samples and divided into 4 groups, which were incubated with CpG-ODN(final concentration 1 μmol·L-1), CpG-ODN+TGP (TPG final concentration 1×10-4mol·L-1) ,TGP and RPMI medium (as the blank control group) for 48 hours, respectively.FLA (Flow cytometry analysis) was used to detect the expression of TLR9 on peripheral blood B lymphocytes after incubated. Results ①In the health people, TLR9 expression in the group of CpG-ODN was(9.10±2.12) %, which was higher than that in the blank control group(4.96±2.11) % (P<0.01).②In the SLE patients, the TLR9 expression in the group of CpG-ODN was(14.86±3.42)% , which was significantly higher than that in the blank control group(9.20±3.43) %(P<0.01).The TLR9 expression in the group of CpG-ODN+TGP was (11.95±3.63)%, which was lower than that in the group of CpG-ODN (P<0.05).The TLR9 expression in the group of CpG-ODN with lightly active SLE patients was (10.74±3.17)%, which was higher than that in the blank control group(5.19±2.05) % (P<0.01).For SLE from the moderately to vigorously active degree, the expression of TLR9 in the group of CpG-ODN(16.51±1.72) % was higher than the blank control group(10.80±2.37) %(P<0.01), but that in the group of CpG-ODN+TGP (13.59±2.58) % was lower than the group of CpG-ODN (P<0.01). Conclusion Our data indicate that TGP antagonize upregulation effect of CpG-ODN on the expression of TLR9 in peripheral blood B lymphocytes.

Total glucosides of paeony; Lupus erythematosus, systemic; Oligodeoxynucleotides; Toll-like receptor

2014-03-06

2014-10-01

*蚌埠醫(yī)學(xué)院校自然科學(xué)項目(Byky1352)

王健(1985-)，男，安徽蕪湖人，住院醫(yī)師，碩士，從事系統(tǒng)性自身免疫疾病的診治工作。電話：0552-3086109，E-mail：wj606@live.com。

李志軍(1962-)，男，安徽合肥人，主任醫(yī)師，教授，從事系統(tǒng)性自身免疫疾病的診治。電話：0552-3086109，E-mail：lizhijun@medmail.com.cn。

R979.5；R593.24

A

1004-0781(2015)05-0589-05