魏 靜，楊希祥，石寧寧，宋小鳳，馮 沖，潘登科*，臧榮鑫

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京210095)

胰腺特異性表達(dá)Hes1基因的構(gòu)建及體外表達(dá)

魏 靜1,2，楊希祥2,3，石寧寧2，宋小鳳2，馮 沖2，潘登科1,2*，臧榮鑫1*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京210095)

為了探究胰腺的發(fā)育機(jī)制，以及制備胰腺缺陷型的小型豬模型，構(gòu)建了特異性表達(dá)載體，開展了相關(guān)載體構(gòu)建及體外驗(yàn)證研究.本研究以小鼠PDX1啟動(dòng)子為特異性啟動(dòng)元件，構(gòu)建胰腺特異性啟動(dòng)小鼠Hes1基因的表達(dá)載體PDX1-Hes1，載體轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細(xì)胞、豬耳成纖維細(xì)胞及豬腎細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后，通過qRT-PCR、Western Blot檢測(cè).結(jié)果顯示：Hes1在MIN-6胰島β細(xì)胞中的RNA水平和蛋白水平均高效表達(dá)，而在非胰腺細(xì)胞豬耳成纖維細(xì)胞及豬腎細(xì)胞中均不表達(dá).試驗(yàn)表明：胰島特異性表達(dá)載體PDX1-Hes1的成功獲得，為構(gòu)建相關(guān)基因在胰腺中特異性表達(dá)的載體提供參考，為后續(xù)制備胰腺缺陷型的小型豬提供了條件.

胰腺特異性表達(dá)；MIN-6胰島β細(xì)胞；體外驗(yàn)證

近年來，糖尿病在我國(guó)發(fā)生的人數(shù)不斷增多，患者數(shù)量居全球第一[1]，且具有年輕化的趨勢(shì)，糖尿病成為嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一.隨著人們經(jīng)濟(jì)能力的提高和醫(yī)院移植技術(shù)的不斷完善，糖尿病患者對(duì)胰腺移植的需求與日俱增，胰腺移植供體卻嚴(yán)重缺乏.器官移植是治療人類器官衰竭，挽救人類生命的有效方法.由于器官移植供體來源缺乏，異種移植研究成為熱門.在豬體內(nèi)長(zhǎng)出人源化器官成為器官異種移植供體來源之一，利用豬生產(chǎn)人源化胰腺，為解決糖尿病患者胰腺移植供體不足的問題提供了新思路.

PDX1(Pancreatic and duodenal home box factor-1)即胰腺十二指腸同源框蛋白1，它在胰腺生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演重要角色.PDX1作為轉(zhuǎn)錄因子在胰腺中特異性表達(dá)，可以促進(jìn)胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島細(xì)胞的分化，同時(shí)，PDX1在維持成體β細(xì)胞功能方面也起著重要的作用[2～3].這說明PDX1啟動(dòng)子具有特異性啟動(dòng)功能.Hes1(Hairy and enhancer of split homolog 1)是Notch信號(hào)通路系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子[4]，其基因編碼的蛋白主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄抑制，通過轉(zhuǎn)錄抑制影響胚胎發(fā)育期的細(xì)胞增殖和分化，并通過負(fù)反饋調(diào)控自我表達(dá)水平[5～6].最近研究發(fā)現(xiàn)，Hes1基因和胰腺發(fā)育有著密切的關(guān)系，在豬的胰腺形成時(shí)期，由PDX1啟動(dòng)子啟動(dòng)Hes1基因特異性過表達(dá)會(huì)生成胰腺缺陷豬[7].目前國(guó)內(nèi)尚無類似報(bào)道.本試驗(yàn)成功構(gòu)建了胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-Hes1，建立了一條研究胰腺發(fā)育的特異性表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)構(gòu)建相關(guān)載體制備胰腺缺陷豬和研究胰腺發(fā)育提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠胰島素瘤β細(xì)胞株MIN-6細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室母義明教授惠贈(zèng)；豬耳成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；PDX1-cre載體購(gòu)自addgene；pEASY-T1 Simple Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司；限制性內(nèi)切酶主要購(gòu)自New England Biolabs公司；抗體購(gòu)自Santa Cruz公司和康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材購(gòu)自Corning公司和ScienCell公司；Sybr Select Master Mix購(gòu)自Applied Biosystems公司；Western Blot實(shí)驗(yàn)材料購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司和康為世紀(jì)生物科技有限公司；RNA及DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司.細(xì)胞轉(zhuǎn)染依照NucleofectorⅡ轉(zhuǎn)染儀及轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染.

1.2 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中小鼠Hes1基因序列(登錄號(hào)：NC_000082)，設(shè)計(jì)引物為Hes1 F/R，片段大小為878 bp.參考GenBank中兔β-globin基因序列(登錄號(hào)：NC_013669.1)，設(shè)計(jì)引物RB F/R從兔DNA中擴(kuò)增出兔β-globin 3′調(diào)控元件(rabbit β-globin 3′flanking sequence，RB)，片段大小為1 125 bp；GAPDH為管家基因，引物為mGAPDH F/R產(chǎn)物長(zhǎng)191 bp；表達(dá)檢測(cè)引物qF1/R1，片段大小為176 bp；實(shí)時(shí)定量檢測(cè)引物qF2/R2，片段大小為156 bp；設(shè)計(jì)引物的同時(shí)要加上相關(guān)酶切位點(diǎn)序列(詳見表1及圖1).PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：H2O 7 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(50 ng/μL)2 μL，Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)10 μL.

表1 引物名稱、序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 PDX1-Hes1載體的構(gòu)建

通過PCR技術(shù)從兔血DNA中擴(kuò)增出RB，TA克隆后測(cè)序，獲得T-RB克隆載體.將Hes1通過EcoRⅠ酶切位點(diǎn)插入到T-RB克隆載體中，克隆后經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液送中美泰和公司測(cè)序，獲得T-RB-Hes1重組質(zhì)粒.PDX1-cre骨架載體和T-RB-Hes1重組質(zhì)粒分別用XbaⅠ、NotⅠ兩個(gè)酶進(jìn)行雙酶切，將PDX1啟動(dòng)子的骨架載體片段和RB-Hes1基因片段連接構(gòu)成PDX1-RB-Hes1重組質(zhì)粒，克隆后經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液送中美泰和公司測(cè)序，最終成功構(gòu)建了PDX1-Hes1載體(圖1)，并經(jīng)酶切驗(yàn)證正確后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)、載體的轉(zhuǎn)染

五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞和豬腎細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清，3.7 g/L碳酸氫鈉、66mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素、3.57 g/L HEPES)，在37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)至細(xì)胞≥80%融合時(shí)消化，進(jìn)行傳代、凍存或?qū)嶒?yàn).

小鼠胰島素瘤β細(xì)胞株MIN-6細(xì)胞在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，高糖DMEM培養(yǎng)基中(需添加64 μmol/Lβ-巰基乙醇)培養(yǎng)至細(xì)胞≥80%融合時(shí)消化，進(jìn)行傳代、凍存或?qū)嶒?yàn)[8].

1.5 qRT-PCR和Western Blot

PDX1-Hes1載體使用無內(nèi)毒素大提試劑盒提取后，轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備.轉(zhuǎn)染前24 h，以3×105細(xì)胞接種6孔板.轉(zhuǎn)染步驟依照NucleofectorⅡ轉(zhuǎn)染儀及轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔DNA用量為4 μg，以不轉(zhuǎn)染載體的MIN-6胰島β細(xì)胞組為陰性對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白.

圖1 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖和對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)

qRT-PCR：轉(zhuǎn)染48 h后的MIN-6胰島β細(xì)胞、豬耳成纖維細(xì)胞和豬腎細(xì)胞，收集細(xì)胞提取RNA，定量1.5 μg反轉(zhuǎn)為cDNA.根據(jù)Hes1 cDNA設(shè)計(jì)高度特異性引物qHes1 F2/R2檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Hes1的mRNA 的表達(dá).選取GAPDH為內(nèi)參基因，取1.5 μL模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè).使用ABI 7500型定量PCR儀進(jìn)行定量分析，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù).采用相對(duì)定量方法進(jìn)行定量分析.

Western Blot：用預(yù)冷的PBS洗脫轉(zhuǎn)染48 h后的MIN-6胰島β細(xì)胞、豬耳成纖維細(xì)胞和豬腎細(xì)胞，離心收集，使用RIPA裂解液分別提取兩種細(xì)胞的總蛋白，95 ℃變性10 min.Bradford法定量，各取50 μg蛋白上樣，5% SDS-PAGE上層膠和10% SDS-PAGE下層膠80 V電泳3 h，120 V轉(zhuǎn)膜2 h，用PBST稍加漂洗，浸沒于5%脫脂奶粉封閉液中緩慢搖蕩2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，HES1 Antibody (E-5)一抗(Santa Cruz；SC-166410)4 ℃過夜孵育，PBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光儀成像.

圖2 PDX1-Hes1酶切驗(yàn)證 圖3 RT-PCR表達(dá)檢測(cè)

注：1：EcoRⅠ酶切；2:XbaI和NotI雙酶切； 注：A．耳成纖維細(xì)胞；B．腎細(xì)胞；C．MIN-6胰島β細(xì)胞；1．qF1/R1；

M：DNA Maker(5 000 bp) 2．GAPDH-F/R；—：空白對(duì)照；M：DNA Maker 2000

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

載體PDX1-Hes1構(gòu)建步驟見圖1所示，用EcoRⅠ進(jìn)行酶切得到Hes1片段，大小為866 bp.再用XbaⅠ、NotⅠ進(jìn)行酶切得到RB-Hes1片段，大小為1 976 bp，酶切電泳結(jié)果見圖2所示.結(jié)果表明，PDX1-Hes1載體構(gòu)建成功.

圖4 qRT-PCR表達(dá)檢測(cè) 圖5 Western blot分析Hes1的表達(dá)

注：—為陰性細(xì)胞; +為陽(yáng)性細(xì)胞

2.2 RT-PCR與qRT-PCR

轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細(xì)胞、耳成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞的RT-PCR(引物：qF1/R1)檢測(cè)結(jié)果顯示，僅在MIN-6胰島β細(xì)胞有表達(dá)，耳成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞均無表達(dá)(圖3).說明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體能特異性地表達(dá)于胰島β細(xì)胞.

qRT-PCR(引物：qF2/R2)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)PDX1-Hes1載體的陽(yáng)性MIN-6胰島β細(xì)胞RNA水平表達(dá)極顯著高于未轉(zhuǎn)染載體的陰性MIN-6胰島β細(xì)胞(P<0.001)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，說明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體能高效表達(dá)于胰島β細(xì)胞.

2.3 Western Blot

Western blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)PDX1-Hes1載體的MIN-6胰島β細(xì)胞和陰性MIN-6胰島β細(xì)胞在35 kDa處均有特異性條帶，且與預(yù)期蛋白大小一致，證明兩種載體在胰島β細(xì)胞中均有表達(dá).結(jié)果顯示：在陽(yáng)性MIN-6胰島β細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于陰性細(xì)胞，證明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體在蛋白水平能高效表達(dá)胰島β細(xì)胞.

3 討論

目前，糖尿病已成為威脅全人類健康的重要疾病之一，是目前世界上最普遍和最具挑戰(zhàn)性的重大公共衛(wèi)生問題之一[9].異種胰島移植的研究為根治糖尿病帶來希望，但直接將豬的胰腺移植給糖尿病人會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重排斥反應(yīng)，且異種胰腺會(huì)迅速壞死.為了解決超急性免疫排斥，國(guó)際上Lai等[10]采用敲除α-1 ,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的胎兒成纖維細(xì)胞作核供體，獲得了α-1 ,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除豬.2011年，潘登科課題組在我國(guó)率先獲得了敲除α-1 ,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的異種器官移植豬[11]，目前通過敲除α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因基本解決了異種移植時(shí)的超急性免疫排斥反應(yīng).在敲除Gal基因豬的基礎(chǔ)上通過胚胎嵌合制備人源化胰腺成為克服異種移植免疫排斥的一種新思路.本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了胰腺高效表達(dá)Hes1基因的載體，因?yàn)镠es1基因和胰腺發(fā)育有著密切的關(guān)系，在豬的胰腺形成時(shí)期，通過表達(dá)Hes1基因會(huì)抑制胰腺的發(fā)育，從而制備胰腺缺陷豬[7].為了提高載體翻譯效率，本實(shí)驗(yàn)前期制備了eGFP報(bào)告基因的模擬載體，通過優(yōu)化比較證明在載體中添加kozak序列能夠有效提高翻譯效率[12].最終本研究選取了帶有kozak序列的PDX1-Hes1載體，并進(jìn)行了體外細(xì)胞驗(yàn)證，結(jié)果表明了載體在小鼠胰島β細(xì)胞中特異性高效表達(dá).

PDX1是胰腺發(fā)育、分化及維持體內(nèi)葡萄糖代謝穩(wěn)定的一種轉(zhuǎn)錄因子[13]，也是β細(xì)胞形成和成熟的標(biāo)志之一[14].PDX1特異性表達(dá)于胰腺和十二指腸中，在PDX1基因敲除的小鼠中，未發(fā)現(xiàn)成熟的胰腺組織，十二指腸的一些區(qū)域也出現(xiàn)異常，在出生后很快死于高血糖癥[15]，在缺乏功能性的PDX1蛋白的人群中，導(dǎo)致胰腺發(fā)育不全，但未造成缺失[16].由此可見，僅通過敲除PDX1基因獲得的胰腺缺失動(dòng)物存在問題，用之生產(chǎn)嵌合人源化胰腺的思路并不可行.有研究表明,在胚胎發(fā)育時(shí)期強(qiáng)迫Notch通路激活，誘使Hes1表達(dá)上升阻斷胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞核外分泌細(xì)胞發(fā)育，并使胰腺外分泌細(xì)胞去分化，形成胰腺缺陷[17～18].通過PDX1啟動(dòng)子啟動(dòng)Hes1基因特異性表達(dá)，因此過表達(dá)Hes1來制備胰腺缺陷豬可以規(guī)避相關(guān)問題，且胰腺缺失后PDX1基因的存在對(duì)人源化胰腺的形成發(fā)育及胰腺功能維持有重要作用，有利于胰腺嵌合豬的正常生長(zhǎng).

本研究成功構(gòu)建了PDX1-Hes1載體，為后續(xù)胰腺缺陷豬的制備打下基礎(chǔ)，而Notch通路與胰腺發(fā)育有著密切關(guān)系.在本研究構(gòu)建載體PDX1-Hes1的基礎(chǔ)上構(gòu)建相關(guān)載體，以胰腺缺陷動(dòng)物模型為研究對(duì)象，來研究Notch通路.同時(shí)，也可以結(jié)合Notch信號(hào)通路構(gòu)建相關(guān)基因表達(dá)載體來研究基因功能及胰腺發(fā)育機(jī)理.

[1] Guariguata L，Whiting D，Hambleton I，et al．Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035 for the IDF Diabetes Atlas[J]．Diabetes Res Clin Pr，2013，103(2014)：137-149．

[2] Ashizawa S，Brunicardi F C，Wang X P，et al．PDX1 and the pancreas[J]．Pancreas，2004，28 (2)：109-120．

[3] Melloul D．Transcription factors in islet development and physiology．Role of PDX1 in beta-cell function[J].Ann N Y Acad Sci，2004，1014：28-37．

[4] Kageyama R，Ohtsuka T，Hatakeyama J，et al．Roles of bHLH genes in neural stem cell differentiation[J]. Exp Cell Res，2005，306(2)：343-348．

[5] Kageyama R，Ohtsuka TKobayashi T．The Hes gene family：repressors and oscillators that orchestrate embryo genesis[J]．Development，2007，134(7)：1243-1251．

[6] Hirata H，Yoshiura S，Ohtsuka T，et al．Oscillatory expression of the bHLH factorHes1 regulated by a negative feedback loop[J]．Science，2002，298(5594)：840-843．

[7] Matsunari H，Nagashima H，Watanabe M，Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs[J]．PNAS，2013，110(12)：4557-4562．

[8] 李琳，劉瑜，李春霖，等．不同葡萄糖濃度對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]．軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(6)：629-631．

[9] Huang E S，Basu A，O'Grady M，et al．Projecting the Future Diabetes Population Size and Related Costs for the US[J]．Diaetes Care，2009，32(12)：2225-2229．

[10] Lai L X，Kolber S D，Park K W，et al．Production of alpha-1，3-galactosyl transferase knockout pigs by nuclear transfer cloning[J]．Science，2002 ，295：1089-1092．

[11] 鄭道山，馮沖，朱彥賓，等．利用啟動(dòng)子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J]．生物技術(shù)通訊，2011，04(22)：458-462．

[12] 楊希祥，魏靜，宋小鳳，等．胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-eGFP構(gòu)建及體外驗(yàn)證[J]．畜牧與獸醫(yī), 2015，3 (47)：77-80．

[13] Robertson R P，Harmon J，Tran P O，et al．Glucose toxicity in beta-cells：type 2 diabetes，good radicals gone bad，and the glutathione connection[J]．Diabetes，2003，52(3)：581-587．

[14] Stephan C C，Chang K C，Lejeune W，et al．Role for heparin-binding growth factors in glucose induced vascular dysfunction[J]．Diabetes，1998，47(11)：1771-1778．

[15] Xuan S，Borok M J，Decker K J，et al．Pancreas-specific deletion of mouse Gata4 and Gata6 causes pancreatic agenesis[J]．J Clin Invest，2012，122(10)：3516-3528．

[16] Milewski W M，Duquay S J，Chan S J，et al．Conservation of PDX1 structure，function，and expression in zebra fish[J]．Endocrinology，1998，139(3)：1440-1449．

[17] Qu X，Afelik S，Jensen J N，et al．Notch-mediated post-translational control of Ngn3 protein stability regulates pancreatic patterning and cell fate commitment[J]．Dev Biol，2013，376(1)：1-12．

[18] Shih H P，Kopp J L，Sandhu M，et al．A Notch-dependent molecular circuitry initiates pancreatic endocrine and ductal cell differentiation[J].Development．2012，139(14)：2488-2499．

Construction and in Vitro Expression of Vectors Which Specifically Express Hes1 in Pancreas

WEI Jing1, 2,YANG Xi-xiang2, 3,SHI Ning-ning2,SONG Xiao-feng2,FENG Chong2,PAN Deng-ke1, 2，ZANG Rong-xin1

(1. Life Science and Engineering College of Northwest University for Nationalities，Lanzhou， 730030，China；2. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；3. College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095，China)

The present study aimed to explore the development mechanism of pancreas, as well as the preparation of the pancreas miniature pig model of defect type, build the specific expression vector, conduct the related carrier construction and validation studies in vitro. PDX1 promoter of mice was token as a specific promoter element，the expression vector PDX1-Hes1 was constructed of pancreas-specific promoter Hes1 gene. This expression vector was transfected into MIN-6 pancreatic β cells, fibroblasts of pig ears and swine kidney cells. They were cultured for 48h and detected with qRT-PCR and Western Blot assay. The results showed that Hes1 RNA and protein levels were highly expressed in MIN-6 pancreatic β cells, but not fully expressed in fibroblasts of pig ears and swine kidney cells. The test demonstrated the PDX1-Hes1 of the islet specific expression vector was successfully obtained, which provided a reference for constructing the vector of carrier-related genes specifically expressing in the pancreas. It also built the conditions for preparing the miniature swine of pancreas deficient in the future.

Specific expression of pancreas；MIN-6 pancreatic β cell；In vitro validation

2015-05-20

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2015CB554103)；西北民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目資助(ycx14167).

*

魏靜(1988—)，女，山西太原人，碩士研究生，主要從事基因與細(xì)胞工程研究.

Q78

A

1009-2102(2015)02-0016-05