張小妹，岳秀萍，王國(guó)英，米 靜，薄泓淼

(太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024)

全程與短程缺氧反硝化降解苯酚的動(dòng)力學(xué)及菌群結(jié)構(gòu)對(duì)比

張小妹，岳秀萍，王國(guó)英，米 靜，薄泓淼

(太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024)

在同一實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上建立起兩個(gè)平行的全程與短程反硝化實(shí)驗(yàn)裝置，均以苯酚為單一碳源進(jìn)行缺氧反硝化降解。結(jié)果顯示，兩個(gè)反硝化體系的苯酚和硝態(tài)氮(亞硝態(tài)氮)去除率均在83%，99%左右，全程和短程反硝化體系的比反硝化速率(以N元素計(jì))分別為4.98，6.45 mg/(g·h).通過PCR-DGGE及切膠測(cè)序?qū)蓚€(gè)反硝化體系的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)全程反硝化菌群的豐富度值和多樣性指數(shù)要高于短程；全程與短程反硝化降解苯酚的細(xì)菌菌綱均以幾類變形菌綱(Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidetes)為主。 DGGE圖譜主成分分析表明，全程與短程反硝化菌群之間具有一定聯(lián)系性，菌群培養(yǎng)具有相互轉(zhuǎn)化的可能性；短程反硝化體系的隸屬于Simplicispirasp.的特有菌種與全程反硝化體系的隸屬于Thermomonassp.的特有菌種在系統(tǒng)發(fā)育上存在較親近的遺傳關(guān)系。

苯酚降解；全程反硝化；短程反硝化；比反硝化速率；菌群結(jié)構(gòu)

苯酚具有劇毒性、致突變性、致癌性，因此在含酚工業(yè)廢水排放之前須將其中的酚類物質(zhì)強(qiáng)制性去除[1]。高濃度含酚廢水可以通過物理化學(xué)的方法進(jìn)行處理，如臭氧氧化、芬頓試劑法、紫外線照射、過氧化氫氧化等，這些方法的成本過高，不適用于大量廢水處理[2-4]。生物降解法是一種有效的水處理方法，因其較低的成本和更高的有機(jī)物降解率被廣泛應(yīng)用。許多微生物都具有降解芳香族化合物如芳香族氨基酸、酚類或醌類的能力[5-6]。目前常用于處理含酚廢水的生物法主要為A/O及其改造工藝，其中缺氧反硝化段的微生物大都屬于異養(yǎng)型，在酚類有機(jī)物的降解方面起了關(guān)鍵作用。

目前，人們針對(duì)反硝化降解苯酚的實(shí)驗(yàn)研究大都集中于全程反硝化，并未對(duì)短程反硝化應(yīng)用于苯酚降解時(shí)的動(dòng)力學(xué)特征及細(xì)菌菌群進(jìn)行系統(tǒng)分析；另外在全程反硝化降解苯酚的菌群研究方面，較多集中于單一菌株的分離鑒定和功能分析，并未對(duì)菌群整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。為此，本文在同一實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，建立起兩個(gè)平行的全程與短程反硝化實(shí)驗(yàn)裝置，分析對(duì)比兩者在降解苯酚時(shí)的動(dòng)力學(xué)特征；利用PCR-DGGE技術(shù)分析對(duì)比兩個(gè)裝置內(nèi)的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，以了解兩者間菌群種類的差異性與相似性。本文旨在揭示兩種反硝化作用降解苯酚時(shí)各自所表現(xiàn)出的行為特征，從而對(duì)含酚廢水的缺氧反硝化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用水與接種污泥

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)裝置采用兩個(gè)相同的1 L反應(yīng)瓶(A、B)，底部磁力加熱攪拌，控制反應(yīng)溫度為室溫(25±1 ℃)，并設(shè)置有pH和氧化還原電位(ORP)監(jiān)測(cè)儀。取0.2 L接種污泥進(jìn)行曝氣約30 min，接著對(duì)其進(jìn)行清洗，將污泥中殘留的各種雜質(zhì)清洗去除，然后向污泥中吹入氮?dú)庖灾脫Q出所含溶解氧。加入0.5 L人工配水。A瓶中氮源為NaNO3，B瓶中氮源為NaNO2，兩個(gè)反應(yīng)瓶中污泥濃度均為5.3 g/L .

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置圖

1.3 水質(zhì)分析項(xiàng)目和檢測(cè)方法

1.4 反硝化細(xì)菌菌群的PCR-DGGE分析步驟

1.4.1 DNA提取與純化

分別從A、B反應(yīng)瓶中提取污泥樣品，以12 000 r/min離心5 min，棄上清并于-20 ℃下凍存?zhèn)溆?，取樣量不少?.5 g .DNA提純采用改進(jìn)的蛋白酶K-CTAB法[12]。

1.4.2 PCR(Polymerase Chain Reaction)

PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因是16S rDNA，擴(kuò)增引物選用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)[13-17]和534R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)[17-19]，并在534R的5’端設(shè)有GC夾[15-17]。

PCR擴(kuò)增預(yù)制混合液包括：TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL；反應(yīng)緩沖液(×10)5 μL，其中Mg2+濃度15 mmol/L；dNTP(2.5 mmol/L)4 μL；引物338F，534R(20 μmol/L)各1 μL；模板DNA 2.5 ng；BSA溶液(10 mg/mL)0.5 μL；加入一定量滅菌Milli-Q水，使混合液體積增至50 μL .

PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程如下：首先將混合液置于94 ℃下，變性反應(yīng)10 min；然后開始30次循環(huán)反應(yīng)過程，即于94 ℃下變性1 min，于55 ℃下退火1 min(每個(gè)循環(huán)降低0.1 ℃)，于72 ℃下延伸1.5 min(最后一次延伸10 min)；反應(yīng)完成后置于4 ℃下保存。吸取部分反應(yīng)液，采用瓊脂糖凝膠(1%)電泳檢測(cè)。整個(gè)擴(kuò)增過程均在MyCycler(Bio-Rad，USA)設(shè)備上進(jìn)行。

1.4.3 DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液在采用瓊脂糖凝膠(1%)電泳檢測(cè)后，使用QIAquik Gel Extraction Kit(Qiagen，Germany)對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收后將其溶解于滅菌的Milli-Q水中，以待DGGE分析。DGGE分析于DCode System(Bio-Rad，USA)設(shè)備上進(jìn)行，其參數(shù)如下：電壓150 V，溫度55 ℃，聚丙烯酰胺濃度8%，變性梯度30%～60%，電泳時(shí)間7 h.在DGGE完成后，使用硝酸銀溶液(0.1%)對(duì)凝膠染色，并于GelDoc 2000(Bio-Rad，USA)設(shè)備上成像檢測(cè)。

1.4.4 切膠測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將DGGE條帶于紫外燈下進(jìn)行切割，切下后洗凈并溶解于滅菌的Milli-Q水中(60 μL)滿24 h，然后吸取20 μL以完成PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)液送交生物公司(Biogenro，北京)進(jìn)行DNA測(cè)序。擬對(duì)每條條帶實(shí)施三次測(cè)序，以確保測(cè)序的精確度。測(cè)序完成后，利用BLAST軟件將序列結(jié)果與GenBank所含基因序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析，并進(jìn)一步利用MEGA 6.06軟件建立菌群系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 全程與短程反硝化降解苯酚的動(dòng)力學(xué)特征

A反應(yīng)瓶-全程反硝化過程；B反應(yīng)瓶-短程反硝化過程

2.2 全程與短程反硝化降解苯酚的細(xì)菌菌群差異性

如圖3-a所示，在DGGE凝膠圖譜上一共觀察到20條明顯的條帶，圖中N1代表短程反硝化菌群，N2代表全程反硝化菌群，條帶基因序列比對(duì)結(jié)果見表1。

a-DGGE凝膠圖譜；b-主成分分析

短程反硝化菌群(N1)條帶編號(hào)包括2，4，5，7，9，10，12，14，18，共計(jì)9條。根據(jù)條帶亮度及其序列比對(duì)結(jié)果，優(yōu)勢(shì)菌種編號(hào)為9和10，它們分別與Pseudomonasbaetica和Stenotrophomonassp.具有100%，99%的同源性。而特有菌種編號(hào)為4，它與Simplicispirasp.具有97%的同源性。胡金星等[21]從活性污泥中分離出一株反硝化細(xì)菌ADH1，鑒別出它屬于Pseudomonassp.，并檢測(cè)出該菌株具有反硝化功能基因nirS和nosZ；楊浩鋒等[22]從移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器中分離出一株反硝化細(xì)菌D3，鑒別出它屬于Stenotrophomonassp.；劉樹娟等[23]指出硝酸鈣能夠引起底泥中微生物群落多樣性增加，優(yōu)勢(shì)菌屬包括反硝化細(xì)菌Simplicispirasp.和Rhodanobactersp.等。據(jù)此推測(cè)，短程反硝化體系的優(yōu)勢(shì)菌種和特有菌種均具有反硝化功能。

表1 20條序列的NCBI GenBank比對(duì)結(jié)果

全程反硝化菌群(N2)條帶編號(hào)包括1，2，3，5，6～20，共計(jì)19條。根據(jù)條帶亮度及其序列比對(duì)結(jié)果，優(yōu)勢(shì)菌種編號(hào)為9和10，這與N1相同，表明它們既可以利用亞硝態(tài)氮也可以利用硝態(tài)氮作為電子受體。而特有菌種的條帶數(shù)共計(jì)11條，其中亮度較為顯著的菌種編號(hào)為11，它與Altererythrobactersp.具有99%的同源性。丁鵬元等[24]研究了A/O工藝處理石化廢水的污泥微生物群落，結(jié)果表明在屬的水平鑒定出的Altererythrobactersp.具有降解多環(huán)芳烴的功能。

表2 菌群豐富度值(Rs)和Shannon-Weiner指數(shù)(H)

2.3 全程與短程反硝化降解苯酚的細(xì)菌菌群相似性

兩組菌群的DGGE圖譜主成分分析見圖3-b，代表全程與短程反硝化菌群的坐標(biāo)點(diǎn)均處于第二象限，表明二者之間具有一定聯(lián)系，菌群培養(yǎng)具有相互轉(zhuǎn)化的可能性。全程與短程反硝化降解苯酚的共有菌種編號(hào)為2，5，7，9，10，12，14和18，它們分別隸屬于幾類變形菌綱和擬桿菌綱。如圖4所示，全程和短程反硝化體系的細(xì)菌菌綱均以Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria和Bacteroidetes為主，前三個(gè)菌綱歸為變形菌門(Phaproteobacteria)，最后一個(gè)菌綱歸為擬桿菌門(Bacteroidetes)。變形菌門是缺氧和厭氧反應(yīng)器中常見的細(xì)菌類群，尤其是β-變形菌綱。另外在市政污水和工業(yè)污水處理廠的污泥中，占有優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌菌群均被發(fā)現(xiàn)是變形菌[26-27]，該類細(xì)菌在降解污染物的過程中發(fā)揮著十分重要的代謝功能。擬桿菌門包括三大類細(xì)菌，即擬桿菌綱、黃桿菌綱、鞘脂桿菌綱，許多研究者發(fā)現(xiàn)在各種降解有機(jī)污染物的活性污泥中都存在擬桿菌門的細(xì)菌，該菌門是污水生物處理細(xì)菌菌群的重要組成部分[28-29]。

兩組菌群的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，樹圖顯示短程反硝化體系的隸屬于Simplicispirasp.的特有菌種(No.4)與全程反硝化體系的隸屬于Thermomonassp.的特有菌種(No.13)在系統(tǒng)發(fā)育上存在較親近的遺傳關(guān)系。常玉梅等[30]進(jìn)行了城市污水廠活性污泥強(qiáng)化自養(yǎng)反硝化菌的研究，結(jié)果顯示反應(yīng)器中起反硝化作用的細(xì)菌菌屬包括Thermomonassp.，Thiobacillusdenitrificans等。此外，根據(jù)韓鈺潔[31]的研究結(jié)論，Simplicispirasp.和Thermomonassp.這兩種菌屬在厭氧環(huán)境下都具有降解苯酚的功能。

圖4 全程與短程反硝化降解苯酚的細(xì)菌菌綱相對(duì)豐度

圖5 全程與短程反硝化降解苯酚的菌群系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

1) 全程和短程反硝化降解苯酚的過程分為底物降解和穩(wěn)定兩個(gè)階段，在底物濃度達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，苯酚和硝態(tài)氮(亞硝態(tài)氮)的去除率均在83%，99%左右；全程和短程反硝化降解苯酚的比反硝化速率(以N元素計(jì))分別為4.98，6.45 mg/(g·h) .

2) 全程反硝化菌群的豐富度值和多樣性指數(shù)要高于短程；全程反硝化體系的特有菌種較多，其中與Altererythrobactersp.同源性較高的菌種在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)，而短程反硝化體系的特有菌種與Simplicispirasp.同源性較高。

3) 全程與短程反硝化降解苯酚的細(xì)菌菌綱均以幾類變形菌綱(Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidetes)為主；根據(jù)DGGE圖譜主成分分析，代表全程與短程反硝化菌群的坐標(biāo)點(diǎn)均處于第二象限；根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，短程反硝化體系的隸屬于Simplicispirasp.的特有菌種與全程反硝化體系的隸屬于Thermomonassp.的特有菌種在系統(tǒng)發(fā)育上存在較親近的遺傳關(guān)系。

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(編輯：楊 鵬)

Comparison of Dynamic Characteristic and Bacterial CommunityStructure on Phenol Degradating Between Complete andShort-cut Denitrification System

ZHANG Xiaomei,YUE Xiuping,WANG Guoying,MI Jing,BO Hongmiao

(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan030024,China)

Two parallel devices of complete and short-cut denitrification were established under the same experimental conditions.Phenol was used as carbon source in the experiment.In two devices,the removal rates of phenol were both about 83%,and the removal rate of nitrate or nitrite nitrogen was 99%.The specific denitrification rate (RDN) was 4.98 and 6.45 mg N/(g VSS·h) respectively in the complete and short-cut denitrification system.Through PCR-DGGE and rubber cutting sequencing,the bacterial community structures of two denitrification systems were analyzed.In the complete denitrification system,the richness value (Rs) and diversity index (H) of bacterial flora were higher; In the two denitrification systems,the classes of bacteria were mainly Proteobacteria (α-,β-,δ-) and Bacteroidetes; According to the result of principal component analysis (PCA),bacteria communities of two systems had a certain relationship and could be cultivated and transformed mutually;From the analysis of phylogenetic tree,a close genetic relationship was found between specific strains related to Simplicispira sp.(short-cut denitrification) and Thermomonas sp.(complete denitrification).

phenol degradating;complete denitrification;short-cut denitrification;specific denitrification rate;bacterial community structure

1007-9432(2015)06-0768-07

2015-04-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目：含氮雜環(huán)化合物在厭氧同時(shí)反硝化產(chǎn)甲烷體系中的降解性能研究(51378330)

張小妹(1984-)，女，山東青島人，博士生，主要從事水污染控制研究，(Tel)13835177057，(E-mail)93667187@qq.com

岳秀萍(1963-)，女，博士，教授，博導(dǎo)，主要從事環(huán)境生物技術(shù)、廢水處理理論與技術(shù)、廢水回用理論與技術(shù)的研究， (E-mail)yuexiuping1990@126.com

X703

A

10.16355/j.cnki.issn1007-9432tyut.2015.06.024