姜 偉，黃文芳，Claudia Schnabel，Lan Kluwe，Victor-F.Mautner，Reinhard E.Friedrich，Andreas Kurtz

(1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072；2.漢堡大學醫(yī)學中心 a.神經內科，b.口腔頜面外科，漢堡 20246；3.柏林夏瑞蒂醫(yī)學院勃蘭登堡再生醫(yī)學中心，柏林 10117)

尼羅替尼應用于1型神經纖維瘤病相關腫瘤的體外研究

姜 偉1，黃文芳1，Claudia Schnabel2a，Lan Kluwe2a，Victor-F.Mautner2a，Reinhard E.Friedrich2b，Andreas Kurtz3

(1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072；2.漢堡大學醫(yī)學中心 a.神經內科，b.口腔頜面外科，漢堡 20246；3.柏林夏瑞蒂醫(yī)學院勃蘭登堡再生醫(yī)學中心，柏林 10117)

目的 通過體外試驗研究尼羅替尼(Nilotinib)對叢狀神經纖維瘤(PNF)培養(yǎng)的Schwann細胞和惡性周圍神經鞘瘤(MPNST)細胞生長特性的影響。方法 利用手術切除的PNF組織培養(yǎng)Schwann細胞和MPNST細胞，然后用不同濃度的尼羅替尼進行處理，測定細胞增殖、活力、凋亡和胞外膠原酶活性，評價藥物的效能。結果 尼羅替尼處理后，細胞增殖和活力均下降，下降的程度與藥物濃度成正比，其半數抑制濃度(IC50)為2.3～10.8 μM。此外，尼羅替尼抑制Schwann細胞和MPNST細胞膠原酶表達活性，并誘導MPNST細胞凋亡。結論 尼羅替尼在體外可有效抑制PNF腫瘤細胞和MPNST細胞的增殖和活力，促進MPNST細胞凋亡，值得進一步開展體內試驗和作用機制研究。

尼羅替尼；1型神經纖維瘤??；叢狀神經纖維瘤；惡性周圍神經鞘瘤；體外研究

叢狀神經纖維瘤(plexiform neurofibroma，PNF)是起源于外周神經鞘的良性腫瘤，多發(fā)生于1型神經纖維瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)患者。臨床上，PNF可引起疼痛、容貌損害、壓迫和組織器官功能障礙等，并可進行性發(fā)展為惡性周圍神經鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST)[1]。MPNST是NF1患者死亡的主要原因之一[2]。目前，臨床上對PNF和MPNST缺乏有效的藥物治療方案[3]。本研究通過體外實驗分析尼羅替尼對Schwann細胞和MPNST細胞增殖、活力、凋亡和膠原酶活性等影響，探討尼羅替尼應用于NF1治療的潛力。

1 材料與方法

1.1 標本來源 病理明確診斷的PNF組織來自于2014年1～12月在漢堡大學附屬醫(yī)院口腔頜面外科的10例手術患者，其中男6例，女4例，年齡12～51歲[(35±10)歲]。研究內容經學術倫理委員會審核(批準號：OB-061/05)，患者知悉組織標本的使用并簽署知情同意書。腫瘤組織在手術切除后置于Hanks平衡鹽溶液(Sigma公司)中，用于Schwann細胞培養(yǎng)。3株MPNST細胞(S462、S1507和S1844)由漢堡大學附屬醫(yī)院腫瘤遺傳學實驗室建立[4]。

1.2 方法

1.2.1 組織消化 手術切除的PNF組織放入無菌磷酸鹽緩沖溶液中，切成2～3 mm大小后置于細胞基礎培養(yǎng)液(包括DMEM 500 ml、10%胎牛血清、500 U/ml 的青霉素和鏈霉素、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸鈉；Gibco公司)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。然后用含有0.5 mg/ml膠原酶和中性蛋白酶(Roche公司)的基礎培養(yǎng)液對組織進行消化，24 h后，利用100 μm不銹鋼網篩分過濾，1500 rpm離心5 min，棄去上清后的沉淀物為原代細胞。

1.2.2 細胞培養(yǎng) Schwann細胞的培養(yǎng)表面需預先使用0.01%多聚賴氨酸和4 μM層粘連蛋白(Gibco公司)包被，其選擇性培養(yǎng)液包括基礎培養(yǎng)液、0.5 mM 3-異丁基-L-甲基黃嘌呤、2 nM heregulin、2.5 mM胰島素(Sigma公司)。MPNST細胞的培養(yǎng)采用基礎培養(yǎng)液加0.1 mM 2-巰基乙醇(Gibco公司)。根據細胞的生長情況，每3～5 d換一次培養(yǎng)液。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)對貼壁生長的細胞進行消化后，1500 rpm離心5 min，收集細胞進行傳代培養(yǎng)，取3～5代細胞進行實驗。

1.2.3 細胞鑒定 培養(yǎng)的Schwann細胞(腫瘤細胞)?；煊谐衫w維細胞(非腫瘤細胞)生長。兩種細胞通過特異性免疫熒光抗體染色進行鑒定，并計算Schwann細胞比例。對于Schwann細胞的染色，采用兔抗人S100抗體和FITC結合的抗兔抗體(綠色)；而成纖維細胞染色采用抗成纖維細胞抗體(CD90)和FITC結合的羊抗鼠IgG抗體(紅色)進行染色；應用碘化丙啶(藍色)染色細胞核(DAKO公司)。只有S100陽性細胞≥80%的Schwann細胞培養(yǎng)物才納入實驗研究。

1.2.4 藥物處理 由于尼羅替尼(Novartis公司)不溶于水，需先配制1 mM的二甲基亞砜(DMSO)-尼羅替尼溶液，然后用培養(yǎng)液稀釋成多個濃度(0、2、4、6、8、10 μM)。

1.2.5 細胞增殖和活力檢測 將Schwann細胞和MPNST細胞培養(yǎng)于96孔平板中，每孔500個細胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨后使用上述不同濃度的尼羅替尼培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天更換藥物培養(yǎng)液。藥物處理10 d后，分別使用Cell Proliferation-BrdU ELISA和XTT檢測試劑盒(Roche公司)測定細胞增殖和活力。實驗操作遵照試劑盒使用說明書，每個藥物處理濃度重復6孔，計算藥物半數抑制濃度(IC50)。

1.2.6 膠原酶活性測定 細胞在不同濃度的尼羅替尼處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)液，利用膠原酶活性測定試劑盒(Chondrex公司)進行檢測。利用FLx800熒光分析儀(BioTek公司)檢測反應物熒光強度，激發(fā)光波長為490 nm，發(fā)射光波長520 nm。

1.2.7 MPNST細胞凋亡率檢測 由于Schwann細胞生長較慢，數量較少，而流式細胞儀測定凋亡率需要較多細胞(約2×106cells/ml)，因此本研究只檢測了3株MPNST細胞在藥物處理后的凋亡率。利用尼羅替尼(0、2、6、10 μM)對細胞處理24 h后，采用Annexin-V-binding assay試劑盒和流式細胞儀(FACSCalibur)測定細胞凋亡率，利用Cell Quest軟件分析數據(BD公司)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理，計算半數抑制濃度(IC50)及其95%可信區(qū)間。

2 結果

2.1 細胞免疫熒光染色結果 Schwann細胞(圖1a)和成纖維細胞(圖1b)胞漿分別呈綠色和紅色，細胞核則呈藍色。10例PNF樣本培養(yǎng)物的S100陽性細胞比例為(85.9±3.6)%。

圖1 細胞免疫熒光染色結果 a：Schwann細胞；b：成纖維細胞

2.2 尼羅替尼對細胞增殖和活力的影響 尼羅替尼可抑制Schwann細胞和MPNST細胞的增殖和活力，抑制效果與藥物的濃度成正比，IC50為2.3～10.8 μM。見表1。其中，MPNST細胞株S462對尼羅替尼最敏感，其增殖和活力的IC50最低，分別為3.1 μM和2.3 μM。

表1 尼羅替尼對細胞處理后的半數抑制濃度(IC50)和95%可信區(qū)間

2.3 尼羅替尼對膠原酶活性影響 部分PNF組織培養(yǎng)的Schwann細胞和2株MPNST細胞能夠產生膠原酶，其活性高低具有個體差異性(圖2)。尼羅替尼處理24 h后，膠原酶活性均顯著下降，其中4 μM的尼羅替尼處理后，所有細胞的膠原酶活性降至1 U/ml以下；而10 μM的尼羅替尼可抑制所有細胞產生膠原酶。

圖2 尼羅替尼對Schwann細胞和惡性周圍神經鞘瘤細胞表達膠原酶的影響

2.4 MPNST細胞凋亡率 尼羅替尼處理24 h后，可誘導MPNST細胞的凋亡。細胞凋亡率的高低與藥物濃度有關，其中6 μM尼羅替尼誘導細胞凋亡率為最高，而細胞在10 μM尼羅替尼處理后，凋亡率反而有所下降(圖3)。

圖3 尼羅替尼處理后惡性周圍神經鞘瘤細胞的凋亡率 a：尼羅替尼(6 μM)對S462細胞處理后的流式細胞儀檢測結果散點圖，其中4個區(qū)域的散點分別表示：活細胞(左下)，早期凋亡細胞(右下)，晚期凋亡細胞(右上)，壞死細胞(左上)；b：3株MPNST細胞在尼羅替尼處理后的凋亡率

3 討論

NF1是一種由NF1基因突變引起的常染色體顯性遺傳疾病，臨床主要表現為皮膚咖啡牛奶斑和神經纖維瘤。PNF是神經纖維瘤的臨床表現之一，NF1患者發(fā)生PNF者占30%～50%[5]。PNF根據病灶的部位和大小，可累及神經、骨骼、血管等多種組織，從而引起疼痛和容貌損害，神經、眼、骨骼及內臟病變，甚至進行性發(fā)展為惡性腫瘤-MPNST。手術切除是臨床上治療PNF的主要手段，但是由于PNF通常侵入臨近的正常組織，難以徹底切除而極易產生復發(fā)，目前也尚無有效的藥物可用于臨床PNF的治療[6]。

我們前期的研究發(fā)現血小板衍生生長因子受體(PDGFR)和c-KIT在神經纖維瘤組織和PNF組織培養(yǎng)的Schwann細胞中高表達；而受體酪氨酸激酶抑制劑-伊馬替尼(格列衛(wèi))，在體外能夠有效抑制Schwan細胞活力和PNF動物模型中腫瘤的生長[7]。但是，近期有2期臨床試驗研究表明，伊馬替尼對PNF患者的有效率只有20%左右[8]。

尼羅替尼是一類基于伊馬替尼的新型腫瘤化療藥物，目前臨床上主要用于治療伊馬替尼耐藥或不耐受的費城染色體陽性的慢性髓性白血病。本研究通過體外試驗，探索尼羅替尼對PNF組織培養(yǎng)的Schwann細胞和MPNST細胞生長特性的影響，以評價尼羅替尼治療PNF的價值。研究結果表明，尼羅替尼在體外可有效抑制Schwann細胞和MPNST細胞的增殖和活力，但是具有個體差異性，其IC50為2.3～10.8 μM。前期有研究檢測慢性髓性白血病患者口服400 mg/d的尼羅替尼后，血漿藥物峰濃度為(4.27±1.47) μM，與本研究發(fā)現的尼羅替尼抑制細胞增殖的IC50相近，因此研究結果具有臨床相關性。

膠原酶是基質金屬蛋白酶家族成員之一，也是構成細胞外基質(ECM)的主要成分，在正常組織中一般表達較低，而在組織修復、傷口愈合和腫瘤中高表達。腫瘤中膠原酶的高表達主要是由于腫瘤細胞可以產生或者誘導宿主細胞產生膠原酶，從而利于腫瘤細胞的侵襲和轉移[9]。本研究發(fā)現部分Schwann細胞和MPNST細胞可產生膠原酶，其培養(yǎng)液中膠原酶活性表達增高。尼羅替尼處理后可降低所有細胞的膠原酶活性，證明了藥物的抗腫瘤作用。此外，本研究還發(fā)現尼羅替尼可誘導MPNST細胞的凋亡，而細胞在10 μM尼羅替尼處理后，凋亡率反而降低，可能是由于高濃度藥物產生的細胞毒作用所致。

綜上所述，本研究表明尼羅替尼在體外可有效抑制PNF腫瘤組織培養(yǎng)的Schwann細胞和MPNST細胞增殖、活力和膠原酶的表達，誘導MPNST細胞的凋亡，具有潛在的臨床應用價值，值得進一步開展體內試驗和作用機制研究。

[1] Lin AL，Gutmann DH.Advances in the treatment of neurofibromatosis-associated tumours [J].Nat Rev Clin Oncol，2013，10(11)：616-624.

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Application of nilotinib to neurofibromatosis type 1-associated tumors in vitro

JIANG Wei1，HUANG Wen-fang1，Claudia Schnabel2a，Lan Kluwe2a，Victor-F.Mautner2a，Reinhard E.Friedrich2b，Andreas Kurtz3

(1.Department of Laboratory Medicine，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.a.Department of Neurology；b.Oral and Maxillofacial Surgery，University Medical Center Hamburg-Eppendorf，Hamburg 20246，Germany；3.Brandenburg Center for Regenerative Medicine，Charité-Medical University，Berlin 10117，Germany)

Objective To investigate the effect of nilotinib on plexiform neurofibroma(PNF)-derived Schwann cells and malignant peripheral nerve sheath tumor(MPNST)cells in vitro.Methods The Schwann cells cultured from 10 PNF tissues and 3 established MPNST cell lines were treated by nilotinib with different concentrations.Cell proliferation，viability，apoptosis and collagenase activity were detected to evaluate drug efficacy.Results Nilotinib treatment led to decreased cell proliferation and viability with 50% inhibitory concentration(IC50)varying from 2.3 to 10.8 μM.In addition，nilotinib induced MPNST cell apoptosis and suppressed collagenase activity.Conclusion Nilotinib is able to inhibit proliferation and viability of PNF-derived Schwann cells and MPNST cells in vitro.It is worth performing further in vivo studies and the researches underlying mechanisms of the effects.

Nilotinib；Neurofibromatosis type 1；Plexiform neurofibroma；Malignant peripheral nerve sheath tumor；In vitro study

R739.43

A

1672-6170(2015)05-0065-04

2015-05-27；

2015-07-16)