郭睿，丁明珠，元英進(jìn)

（系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300072）

引 言

青蒿素及其衍生物已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為目前世界上最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾藥物。目前主要通過青蒿類植物提取[1]、化學(xué)合成[2]以及利用合成生物學(xué)手段[3]等方式獲得青蒿素。合成生物學(xué)由于快速安全綠色環(huán)保等優(yōu)勢逐漸替代植物提取和化學(xué)全合成[4]。青蒿二烯（amorphadiene）是青蒿素的重要前體，青蒿植物中青蒿二烯的合成分兩個(gè)步驟：（1）乙酰輔酶A經(jīng)MVA途徑生成法尼基焦磷酸[5](FPP)；（2）青蒿二烯合成酶(ADS)[6]催化 FPP 經(jīng)環(huán)化反應(yīng)生成青蒿二烯。FPP是倍半萜類化合物的共同前體，主要通過兩條獨(dú)立的生物途徑合成[7]：甲羥戊酸途徑（MVA途徑，存在于真核生物、古生菌和部分原核生物中）和 2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑，存在于細(xì)菌和光合真核生物中）。

目前，利用合成生物學(xué)方法進(jìn)行青蒿二烯合成研究中應(yīng)用最廣泛的底盤細(xì)胞是大腸桿菌和釀酒酵母[7]。大腸桿菌中存在具有較大萜類合成潛力的MEP途徑，適合萜類化合物碳骨架的合成[8]。Keasling課題組在大腸桿菌體內(nèi)重構(gòu)MVA途徑，優(yōu)化后青蒿二烯產(chǎn)量達(dá)到27.4 g·L?1[9-11]。但大腸桿菌缺少糖基化和翻譯后修飾等功能，因此限制了后續(xù)青蒿酸合成基因高效表達(dá)。而釀酒酵母遺傳背景清楚、基因操作簡單、可進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，且次級代謝產(chǎn)物簡單[12]，因此較多研究者選擇釀酒酵母作為青蒿二烯生物合成的底盤細(xì)胞。Kong等[13]通過在釀酒酵母體內(nèi)過表達(dá)tHMGR和ERG20基因，并表達(dá)突變的ADS基因，使青蒿二烯產(chǎn)量達(dá)到123.2 mg·L?1。Keasling 課題組[14]通過過表達(dá)釀酒酵母MVA路徑基因和ADS基因，抑制鯊烯合酶表達(dá)，使青蒿二烯產(chǎn)量高達(dá)40 g·L?1。本課題組之前在該領(lǐng)域的工作主要集中在釀酒酵母底盤細(xì)胞與不同功能模塊之間適配性研究[15-16]。

HMGR催化MVA途徑中第一個(gè)可逆反應(yīng)，是MVA途徑上第一個(gè)限速酶[17]。表達(dá)截短的HMGR基因——tHMGR（去除HMGR的調(diào)控區(qū)域）可以增加 HMGR的表達(dá)量[18]，從而提高后續(xù)產(chǎn)物的產(chǎn)量[10]。增加ERG20基因的表達(dá)量[19]或減少FPP流向其他支路的流量[20]，可以增加FPP的積累量，從而增加青蒿二烯的產(chǎn)量。Pitera等[21]研究發(fā)現(xiàn)增加HMGR和ERG20基因的拷貝數(shù)，可以提高青蒿二烯的產(chǎn)量。Delta位點(diǎn)在基因組中拷貝數(shù)大于100，利用 Delta位點(diǎn)進(jìn)行外源基因整合，在沒有選擇壓力的存在下傳代50次整合基因型仍穩(wěn)定存在，引入的外源基因經(jīng)過傳代后仍能多拷貝存在[22-23]。

本研究通過過表達(dá)釀酒酵母tHMGR和ERG20基因、表達(dá)外源青蒿二烯合酶基因ADS實(shí)現(xiàn)釀酒酵母生產(chǎn)青蒿二烯的目的，如圖1所示。之前的大量研究都集中在上調(diào)或基因組單位點(diǎn)整合過表達(dá)內(nèi)源基因，以基因組整合或?qū)胪庠促|(zhì)粒表達(dá)ADS基因，實(shí)現(xiàn)釀酒酵母中合成青蒿二烯的目的。內(nèi)源基因多拷貝過表達(dá)，往往要進(jìn)行多次整合，加大了實(shí)驗(yàn)的工作量；若采取多拷貝游離質(zhì)粒方式表達(dá)外源ADS基因，則不能保證人工菌株基因型的穩(wěn)定性。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的酵母啟動(dòng)子、終止子載體模塊庫[24]，以酵母基因組中多拷貝位點(diǎn)Delta作為整合位點(diǎn)，不僅可以單次整合多個(gè)基因，并且整合后的基因都以多拷貝形式存在于基因組，從而實(shí)現(xiàn)酵母內(nèi)源基因tHMGR和ERG20的多拷貝過表達(dá)以及ADS基因的異源多拷貝表達(dá)，構(gòu)建可以生產(chǎn)青蒿二烯且基因型較穩(wěn)定的人工釀酒酵母菌株。除了考慮葡萄糖濃度以及氧氣通量等常用參數(shù)外，本研究還將某些必需氨基酸作為提高青蒿二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵調(diào)控參數(shù)。

圖1 釀酒酵母體內(nèi)青蒿二烯合成路徑的構(gòu)建Fig.1 Biosynthesis of amorphadiene in engineered S.cerevisiae

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 工具酶及試劑

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自Biomed公司，TransStart FastPfu高保真DNA聚合酶購自TransGen公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶 PstI和BamHI購自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶NotI-HF和BsaI-HF購自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒、酵母質(zhì)粒小提試劑盒、普通 DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒購自天根公司；朱欒倍半萜標(biāo)準(zhǔn)品（Valencene）購自TCI公司；正十二烷購自天津市康科德試劑化工廠；PEG3350、鮭魚精DNA、各類氨基酸粉末購自鼎國昌盛公司；醋酸鋰購自北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；去氨基酸酵母氮源（YNB）購自GENVIEW公司。

1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

宿主菌E. coliDH5α {endA1; hsdR17; gyrA96;thi-1; relA1; supE44; recA1; ΔlacU169(?80lac ΔZM15)} 和 釀 酒 酵 母 菌 株 W303-1a（MATa{leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1;his3-11,15})，釀酒酵母菌株 BY4741（MATa{his3 Δ1;leu2 Δ0; met15 Δ0; ura3 Δ0} ）， 釀 酒 酵 母 菌 株CEN.PK2-1C(MATa {ura3-52; trp1-289; leu2-3_112;his3 Δ1; MAL2-8C; SUC2})， 釀 酒 酵 母 菌 株CEN.PK2-1D (MATα{ura3-52; trp1-289; leu2-3_112;his3 Δ1; MAL2-8C; SUC2})購自 Euroscarf公司，酵母表達(dá)載體 pRS425K為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，詳見表1、表2。

LB 培養(yǎng)基（10 g·L?1氯化鈉；10 g·L?1胰蛋白胨；5 g·L?1酵母提取物；固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉）用于大腸桿菌的培養(yǎng)；YPD培養(yǎng)基(20 g·L?1葡萄糖；20 g·L?1胰蛋白胨；10 g·L?1酵母提取物；固體培養(yǎng)基添加 2%瓊脂粉）用于釀酒酵母的培養(yǎng)；SC-ura培養(yǎng)基（20 g·L?1葡萄糖；6.7 g·L?1YNB；2 g·L?1drop-out 氨基酸混合物；固體培養(yǎng)基添加2% 瓊脂粉）用于酵母轉(zhuǎn)化子篩選和培養(yǎng)。

1.3 釀酒酵母表達(dá)載體構(gòu)建

表1 實(shí)驗(yàn)中涉及的酵母菌株Table 1 Yeast strains involved in this study

以BY4741基因組DNA為模板，通過特異性引物PCR擴(kuò)增tHMGR和ERG20、終止子片段TTPI1和TENO2，用限制性內(nèi)切酶BsaI對以上片段和本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 pRS425K-啟動(dòng)子-終止子模塊[24]LD55和LD19進(jìn)行酶切；純化回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，得到表達(dá)載體 pRS425K:TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1和 pRS425K: TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1。用 overlap PCR方法得到TTPI1-TENO2片段，以BamHI和PstI對擴(kuò)增片段和載體pRS425K分別進(jìn)行酶切，純化回收片段以 T4連接酶連接，得到質(zhì)粒 pRS425K：TTPI1-TENO2。

外源基因ADS參考GeneBank ID.AF-138959報(bào)道的序列經(jīng)密碼子優(yōu)化，利用Genewiz公司合成的60bp Oligos，用overlap PCR方法合成。利用BsaI限制性內(nèi)切酶對ADS基因和相應(yīng)的啟動(dòng)子終止子元件LD01D進(jìn)行酶切，純化回收產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶連接得到 pRS425K:TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2表達(dá)載體。

表2 實(shí)驗(yàn)中涉及的質(zhì)粒Table 2 Plasmids involved in this study

1.4 表達(dá)模塊整合基因組和轉(zhuǎn)化子篩選

以上4個(gè)表達(dá)載體測序正確后，用 BamHI和PstI酶切，即可得到片段TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、TTPI1-TENO2和 TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2四個(gè)片段，用NotI限制性內(nèi)切酶對 LDL06[24]（pRS425K: Delta1-URA3-TCYC1）進(jìn)行酶切，得到Delta-URA3-CYC1t片段。

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法用上述 5個(gè)片段分別以W303-1a、BY4741、CEN.PK2-1C、CEN.PK2-1D為宿主菌株進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，用SC-ura培養(yǎng)基篩選，30℃恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，至長出重組克隆，分別挑取8個(gè)單菌落在SC-ura固體培養(yǎng)基上劃線分純，30℃恒溫倒置培養(yǎng)至長出單菌落，挑取單菌落到SC-ura液體培養(yǎng)基，30℃、200 r·min?1培養(yǎng)至OD600約為 4，取菌液 12000 r·min?1離心 2 min，棄上清收集菌體提取基因組，基因組PCR驗(yàn)證過表達(dá)模塊和異源表達(dá)模塊，出現(xiàn)正確大小的目標(biāo)條帶，則證明篩選到了正確的陽性克隆，得到人工酵母菌株 SyBE_Sc00011103、SyBE_Sc00011106、SyBE_Sc00011101、SyBE_Sc00011107。

人工酵母菌株功能模塊構(gòu)建流程如圖2所示。分別構(gòu)建tHMGR, ERG20, ADS基因的表達(dá)盒質(zhì)粒，酶切得到 DNA片段，醋酸鋰法酵母轉(zhuǎn)化，將各個(gè)片段整合到酵母染色體上，經(jīng)過PCR驗(yàn)證篩選正確克隆。

1.5 人工酵母菌株發(fā)酵

1.5.1 搖瓶發(fā)酵 將正確陽性克隆接種到 5 ml SC-ura液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min?1培養(yǎng)至OD600值約為5.0，以初始OD600值0.1轉(zhuǎn)接至SC-ura液體培養(yǎng)基，30℃、200 r·min?1培養(yǎng)12 h，按初始OD600值0.05轉(zhuǎn)接到50 ml液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min?1培養(yǎng)，10 h后在發(fā)酵液中加入2.5 ml正十二烷進(jìn)行兩相培養(yǎng)，以此條件繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。1.5.2 發(fā)酵罐發(fā)酵 將正確陽性克隆接種到 5 ml SC-ura液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min?1培養(yǎng)至OD600值約為5.0，以初始OD600值0.1轉(zhuǎn)接至SC-ura液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min?1培養(yǎng)12 h，初始OD600值為0.05，初始培養(yǎng)基體積2 L，溫度30℃，pH為5.8，發(fā)酵培養(yǎng)10 h，加入400 ml正十二烷兩相培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度接近2 g·L?1時(shí)，批式補(bǔ)料方式補(bǔ)給葡萄糖母液，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度到初始值。在OD600值進(jìn)入平臺期后，按初始濃度補(bǔ)加氨基酸和YNB母液1～2次，至菌體密度保持24 h不再增加為止。

1.6 青蒿二烯的提取與檢測

圖2 基因整合步驟示意圖Fig.2 Schematic of integrating genes into chrosome

發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液 5000 r·min?1離心 10 min，吸取十二烷相，無水硫酸鈉干燥，用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，用正己烷稀釋，用 GC-TOF/MS檢測產(chǎn)物。色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度100℃，保持 2 min，以8℃·min?1升溫至 160℃；以25℃·min?1升溫至250℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃，分流進(jìn)樣(分流比1:50)，進(jìn)樣體積1 μl。質(zhì)譜條件：EI+源；電子能量70 eV；離子源溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間 5 min；質(zhì)量掃描方式為選擇全離子掃描；定性離子為m/z204(青蒿二烯分子C15H24)和189([M-CH3]+)。

定量方法：使用相同色譜條件測定青蒿二烯的同分異構(gòu)體朱欒倍半萜的標(biāo)準(zhǔn)溶液(5～150 mg·L?1)，繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，對青蒿二烯進(jìn)行定量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論

2.1 釀酒酵母底盤的構(gòu)建

將 TCYC1-PTEF1-tHMGR-TTEF1、TTEF1-PGPM1-ERG20-TTPI1、TENO2-PPDC1-ADS-TGPM1-Delta2、Delta-URA3-TCYC1以及TTPI1-TENO2等片段同時(shí)進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，便可以多拷貝位點(diǎn)Delta為整合位點(diǎn)將tHMGR、ERG20、ADS基因依次整合到 CEN.PK2-1C、W303-1a、BY4741和CEN.PK2-1D基因組。經(jīng)基因組 PCR驗(yàn)證正確的重組轉(zhuǎn)化子，分別命名為:SyBE_Sc00011101、SyBE_Sc00011103、SyBE_Sc00011106、SyBE_Sc00011107。

釀酒酵母MVA途徑以乙酰輔酶A為底物，提供倍半萜類化合物合成前體FPP，因此增加FPP的積累量可以增加釀酒酵母生產(chǎn)倍半萜類化合物如青蒿二烯的能力。過表達(dá)tHMGR基因和ERG20基因可以增加FPP的積累量。關(guān)鍵酶基因的拷貝數(shù)影響青蒿二烯產(chǎn)量[21]，但是表達(dá)多拷貝質(zhì)粒的人工菌株往往基因型不夠穩(wěn)定[25]，而單拷貝整合過表達(dá)目標(biāo)基因?qū)Ξa(chǎn)物產(chǎn)量的提升不顯著。本研究選用多拷貝序列 Delta作為整合位點(diǎn)[22-23]，實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵酶基因的多拷貝表達(dá)，并且以基因組形式穩(wěn)定存在。

2.2 人工釀酒酵母細(xì)胞底盤的優(yōu)選

進(jìn)行人工酵母菌株 50 ml搖瓶發(fā)酵。用GC-TOF/MS檢測產(chǎn)物，在保留時(shí)間為10.34 min時(shí)檢測到青蒿二烯的特征質(zhì)譜峰m/z=204和m/z=189。根據(jù)相同測定條件下得到的朱欒倍半萜濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，對人工酵母細(xì)胞發(fā)酵液中青蒿二烯濃度進(jìn)行定量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)功能模塊的底盤細(xì)胞的生長狀況以及底盤細(xì)胞與功能模塊之間適配性的差異，導(dǎo)致人工細(xì)胞的生長情況和目標(biāo)產(chǎn)物積累狀況的差異[16]。結(jié)果表明，底盤細(xì)胞 CEN.PK2由于其較好的生理學(xué)特征和生孢能力[25-26]，從菌體生長狀況和青蒿二烯濃度(表 3)上都顯示出明顯優(yōu)勢。因此，選擇人工酵母菌株SyBE_Sc00011101進(jìn)行后續(xù)研究。

表3 不同底盤的人工菌株青蒿二烯產(chǎn)量Table 3 Production of amorphadiene in artificial strains with different chassis

2.3 發(fā)酵優(yōu)化提高產(chǎn)量

圖3 不同葡萄糖濃度下YPD和SC-ura培養(yǎng)基中青蒿二烯產(chǎn)量Fig.3 Production of amorphadiene in YPD and SC-ura with different glucose concentration

選擇產(chǎn)量較高的菌株 SyBE_Sc00011101進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，以期獲得更高的產(chǎn)量。

2.3.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分對發(fā)酵過程中青蒿二烯積累的影響 培養(yǎng)條件對人工釀酒酵母的生長狀況和青蒿二烯產(chǎn)量影響較大。以不同培養(yǎng)基用SyBE_Sc00011101進(jìn)行50 ml搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌體在SC-ura培養(yǎng)基中生長速度不及YPD培養(yǎng)基中，但圖3青蒿二烯產(chǎn)量的比較顯示，菌體在SC-ura培養(yǎng)基中青蒿二烯產(chǎn)量高于YPD培養(yǎng)基中。Albers等[27]發(fā)現(xiàn)無氧發(fā)酵條件下氮源對釀酒酵母生長速率和產(chǎn)乙醇能力影響較大，因此氮源種類可能是菌體在兩種培養(yǎng)基中的生長能力和青蒿二烯生產(chǎn)能力差別的重要因素。培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對青蒿二烯產(chǎn)量影響明顯。葡萄糖濃度為40 g·L?1的 SC-ura培養(yǎng)基中青蒿二烯濃度最高為 225.3 mg·L?1。

2.3.2 發(fā)酵罐分批次補(bǔ)料發(fā)酵 選擇 SyBE_Sc00011101以葡萄糖濃度為20 g·L?1的SC-ura培養(yǎng)基進(jìn)行5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，初始培養(yǎng)基體積2 L，溫度30℃，pH恒定為5.8，在發(fā)酵培養(yǎng)10 h時(shí)，加入400 ml正十二烷兩相培養(yǎng)。

為研究發(fā)酵罐中溶氧對發(fā)酵過程和產(chǎn)物積累的影響，設(shè)定轉(zhuǎn)速和空氣流量分別為250 r·min?1、2 L·min?1和 500 r·min?1、4 L·min?1，以 SC-ura（葡萄糖 20 g·L?1）培養(yǎng)基對 SyBE_Sc00011101菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中以分批補(bǔ)料方式補(bǔ)給葡萄糖，在不限制生長潛力的前提下，保證菌體有氧呼吸代謝[28]。生長進(jìn)入平臺期后，補(bǔ)加氨基酸和YNB至初始濃度。結(jié)果（圖4）表明，在轉(zhuǎn)速較快、空氣流量較大時(shí)，OD600值明顯較高；發(fā)酵培養(yǎng)至155 h時(shí)，轉(zhuǎn)速為250 r·min?1、空氣流量為2 L·min?1的發(fā)酵罐中青蒿二烯濃度為 335.51 mg·L?1；而轉(zhuǎn)速為 500 r·min?1、空氣流量為 4 L·min?1的發(fā)酵罐中青蒿二烯濃度為562.81 mg·L?1，是前者的1.68倍。

圖4 發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和空氣通量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of rotation speed and air flux

這可能是由于隨著溶氧量的增大，人工酵母細(xì)胞的呼吸代謝加強(qiáng)，葡萄糖生成丙酮酸的過程加快，同時(shí)削弱了無氧條件下丙酮酸生成乙醇和乙酸的過程，而生成更多乙酰輔酶A，經(jīng)MVA途徑為青蒿二烯合成提供更充足的FPP。通過增加底物濃度加快反應(yīng)速率，從動(dòng)力學(xué)上加快青蒿二烯積累；根據(jù)巴斯德效應(yīng)，酵母在氧氣充足時(shí)消耗更少的葡萄糖，產(chǎn)生更多的能量，在熱力學(xué)上促進(jìn)了青蒿二烯的積累。

由于底盤細(xì)胞 CEN.PK2-1C部分氨基酸基因缺陷，經(jīng)外源基因整合后仍不能合成部分必需氨基酸，如亮氨酸(Leu)、組氨酸(His)和色氨酸(Trp)，需要在培養(yǎng)基中添加這些氨基酸。Watson[29]研究發(fā)現(xiàn)不同氮源和氨基酸比例影響酵母生長。培養(yǎng)基中這3種氨基酸的濃度是否會(huì)影響產(chǎn)量，仍需要進(jìn)一步探索。選取 Leu、His、Trp初始濃度分別為 0.1 g·L?1、0.02 g·L?1、0.02 g·L?1和 1 g·L?1、0.2 g·L?1、0.2 g·L?1的 SC-ura 培養(yǎng)基（分別記為 SC-ura和 SC-ura+10aa），設(shè)定發(fā)酵條件為：初始OD600為0.05，培養(yǎng)基體積2 L，pH為5.8，轉(zhuǎn)速 500 r·min?1，空氣流量 4 L·min?1，10 h 后加入400 ml正十二烷兩相培養(yǎng)。當(dāng)葡萄糖濃度接近2 g·L?1時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖母液使其濃度達(dá)到約20 g·L?1，菌體進(jìn)入生長平臺期時(shí)按初始濃度補(bǔ)加YNB和氨基酸。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明：（1）發(fā)酵培養(yǎng)155 h時(shí) SC-ura+10aa培養(yǎng)基中青蒿二烯濃度為 1.05 g·L?1；SC-ura培養(yǎng)基中青蒿二烯濃度為 562.81 mg·L?1，說明該人工酵母菌株生產(chǎn)青蒿二烯的過程受到氨基酸濃度的影響。（2）發(fā)酵培養(yǎng)35 h后，SC-ura培養(yǎng)基中人工菌株生長進(jìn)入平臺期，在40 h補(bǔ)加 YNB和氨基酸母液至初始濃度，隨后菌體二次生長，說明氮源以及氨基酸濃度會(huì)限制該菌株的生長。但若菌株生長速度過快，而空氣通量保持不變，則單位OD600菌體溶氧量降低，一定程度上加快了單位菌體消耗葡萄糖的速率，而氮源的不充足使得人工菌株相關(guān)代謝失衡，所以SC-ura培養(yǎng)基中雖然有較高的菌體終密度，但青蒿二烯終濃度卻遠(yuǎn)低于SC-ura+10aa培養(yǎng)基中。

本文通過多拷貝位點(diǎn)整合過表達(dá)MVA途徑關(guān)鍵基因HMGR以及FPP合成酶基因ERG20，增加MVA路徑通量以及FPP的積累量；同時(shí)表達(dá)青蒿二烯合成酶ADS，雖然經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，在5 L發(fā)酵罐中青蒿二烯的產(chǎn)量達(dá)到1.05 g·L?1，但仍與國內(nèi)外該領(lǐng)域相關(guān)研究存在差距。因此除了HMGR和ERG20之外，F(xiàn)PP向萜類物質(zhì)的通量應(yīng)該還受到其他因素的抑制，比如代謝流的平衡以及支路分流的作用。因此，在后續(xù)的研究中，將會(huì)繼續(xù)對相關(guān)代謝路徑上物料的均衡分配進(jìn)行相關(guān)研究以達(dá)到提高青蒿二烯產(chǎn)量的目的。

圖5 氨基酸濃度和補(bǔ)料發(fā)酵過程的優(yōu)化Fig.5 Optimization of amino acid concentration and fed-batch process

3 結(jié) 論

（1）為了增加基因拷貝數(shù)，同時(shí)克服多拷貝質(zhì)粒容易丟失的問題，選用基因組上多拷貝位點(diǎn)Delta作為整合位點(diǎn)，可以增加人工釀酒酵母細(xì)胞經(jīng)過MVA途徑合成FPP的能力，從而提高青蒿二烯的產(chǎn)量。

（2）發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基不同會(huì)影響菌體濃度和青蒿二烯產(chǎn)量。本研究中SC-ura培養(yǎng)基中青蒿二烯的產(chǎn)量高于 YPD培養(yǎng)基；并且菌體的生長和生產(chǎn)之間存在平衡關(guān)系，菌體的生長速率和青蒿二烯的生產(chǎn)速率并不呈正相關(guān)。

（3）培養(yǎng)基中葡萄糖濃度影響菌體生長，并且這種影響會(huì)反映到青蒿二烯的積累過程上。同時(shí)菌體生長依賴于部分必需氨基酸，由于氨基酸是組成蛋白的基本單位，因此對菌體生長以及青蒿二烯的生產(chǎn)影響顯著。本研究中發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，選用高濃度氨基酸發(fā)酵，可以改善菌體生長狀況，從而提高發(fā)酵液中青蒿二烯的濃度。

（4）發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，選擇較大轉(zhuǎn)速和較高空氣通量，能改善菌體生長狀況，增強(qiáng)其生產(chǎn)青蒿二烯的能力。

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