陳舒博等

摘 要：蛋白質(zhì)雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)的支撐技術(shù)，在微生物和動物蛋白質(zhì)分析上取得較大進(jìn)展，但在植物蛋白質(zhì)分析上卻進(jìn)展不大，究其原因在于難以制備到適于雙向電泳的植物蛋白質(zhì)樣品。筆者綜述了植物蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備的方法，分析各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出今后植物蛋白質(zhì)樣品制備的研究重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)雙向電泳；植物蛋白質(zhì)樣品制備；TCA/丙酮法；酚抽法

中圖分類號：Q51 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.002

Abstract： Two-dimensional electrophoresis is the fundamental technology of proteomics， it makes great progress in protein analysis of animals and microbes. However， it makes little progress in protein analysis of plants due to the hardness of the preparation of plant proteins samples suited for two-dimensional electrophoresis. In this paper， methods for the preparation of plant protein's samples were reviewed， merits and drawbacks of these methods were analyzed， and the research focus on the preparation of plant protein's samples in the future was putted forward.

Key words： two-dimensional electrophoresis； preparation of plant protein's samples； TCA acetone precipitation method； phenol method

隨著人類基因組框架圖的公布和擬南芥等模式生物基因組序列測定的完成，生命科學(xué)研究逐漸進(jìn)入后基因組時代。盡管已有多種植物的基因組被測序，但在這些植物基因組中往往有一半以上基因所表達(dá)的功能是未知的。而蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，是揭開基因表達(dá)功能的一把金鑰匙。直接研究蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式成為生命科學(xué)發(fā)展的必然趨勢。蛋白質(zhì)組的研究應(yīng)運(yùn)而生，而研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)則被稱為蛋白質(zhì)組學(xué)[1-2]。

由于蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體層面研究細(xì)胞、組織、器官甚至個體內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，所以需要強(qiáng)有力的方法來分離和顯示上千種蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)具有高分辨率、快速和簡單的優(yōu)點(diǎn)，因而成為蛋白質(zhì)組學(xué)的支撐技術(shù)。目前雙向電泳技術(shù)在微生物和動物蛋白質(zhì)分析上取得較大進(jìn)展，但在植物蛋白質(zhì)分析上往往難以取得比較理想的實(shí)驗(yàn)效果，使得植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對落后于動物和微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究。究其原因，主要是植物組織（尤其是綠色葉片）中含有多酚類、醌、脂類及其他多種次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)一旦存在于植物蛋白質(zhì)樣品中就會嚴(yán)重干擾蛋白分離效果及電泳圖譜質(zhì)量，無法很好地顯示出植物中各種蛋白質(zhì)之間的差異。同時，植物組織中存在的蛋白酶能夠水解目的蛋白，降低蛋白質(zhì)樣品的純度。由此可見，植物蛋白質(zhì)樣品的制備是植物蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，只有制備到純度高、雜質(zhì)少的蛋白質(zhì)樣品才可能獲得質(zhì)量高的電泳圖譜。因而有必要?dú)w納和總結(jié)適于雙向電泳的植物蛋白質(zhì)樣品制備技術(shù)，便于研究者根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的樣品制備方法，獲得良好的電泳分離效果和高質(zhì)量的電泳圖譜[3-4]。

1 植物蛋白質(zhì)樣品制備方法

植物蛋白質(zhì)樣品的制備，要準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)樣品來源的成分，在維持目的蛋白活性和結(jié)構(gòu)不變的基礎(chǔ)上逐步去除無關(guān)物質(zhì)，獲取合適的蛋白質(zhì)樣品。在長期的植物蛋白質(zhì)組研究中，研究者們根據(jù)研究的對象和目的，在實(shí)驗(yàn)中逐漸摸索，發(fā)明并改進(jìn)了5種常用的樣品制備方法。

1.1 TCA/丙酮法

TCA/丙酮法的原理是利用蛋白質(zhì)在丙酮溶液的疏水條件下變性使蛋白質(zhì)濃縮并去除污染物。根據(jù)謝進(jìn)等[5]的實(shí)驗(yàn)，TCA/丙酮法主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理，加入以TCA/丙酮為主要成分的溶液振蕩混勻，沉淀過夜，再低溫離心去上清，反復(fù)操作洗滌沉淀到丙酮溶液無色為止，敞口揮發(fā)丙酮，再將沉淀凍存。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)當(dāng)在低溫環(huán)境下用盡量短的時間完成，以免蛋白質(zhì)大量變性。

1.2 酚抽法

酚抽法的原理是利用了蛋白質(zhì)和脂類溶于酚相而難溶于水相的特性。鹽類、核酸、多糖通過溶于水而被去除，脂類通過溶解在乙酸銨甲醇溶液中被去除，再用冷丙酮溶解去除色素和銨離子。操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入蛋白質(zhì)提取液振蕩混勻，再加入等體積的Tris-飽和酚，冰浴，振蕩混勻，低溫離心處理，逐步抽取酚相，向酚相加入乙酸銨甲醇溶液低溫沉淀過夜，低溫離心后獲取沉淀。將沉淀用預(yù)冷丙酮多次洗滌，敞口使丙酮揮發(fā)，將沉淀低溫保存[6]。彭存智[7]在運(yùn)用酚抽法提取紅樹葉蛋白時將Tris-飽和酚換為酸性的水飽和酚，而劉楠等[8]在運(yùn)用酚抽法提取蒙古沙冬青根蛋白時將洗滌沉淀的丙酮換為甲醇溶液，也取得預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。在使用酚抽法時，應(yīng)當(dāng)增加離心力和離心時間，盡可能地把密度大的糖分離至上清液的上層。

1.3 Tris-HCl法

Tris-HCl法的基本原理是利用去污劑SDS破壞疏水鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性，而Tris-HCl平衡pH值，防止蛋白質(zhì)變性。根據(jù)曾廣娟等[9]和田忠景等[10]的實(shí)驗(yàn)，Tris-HCl法的主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，并加入SDS、甘油和Tris-HCl為主要成分的緩沖液，振蕩混勻，低溫離心處理后提取上清，加入TCA/丙酮混勻，低溫離心后獲取沉淀。將沉淀用80%預(yù)冷丙酮多次洗滌，室溫風(fēng)干，低溫保存。

1.4 Trizol沉淀法

Trizol是一種新型RNA抽提試劑，可以直接從組織中提取RNA。它促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出，通過分層分別將不同層中的RNA（上層）、DNA（中層）、蛋白質(zhì)（下層）分離純化出來，效率極好。根據(jù)周雪等[11]和康俊梅等的實(shí)驗(yàn)[12]，Trizol沉淀法的主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，先后按比例加入Trizol和氯仿，振蕩混勻，低溫離心處理后去除上層水相中的RNA，加入無水乙醇沉淀去除中間層和下層酚相中的DNA和與之結(jié)合的高豐度的組蛋白，振蕩混勻，低溫離心處理后提取上清，先后按比例加入Trizol和異丙醇，振蕩混勻，低溫離心處理后提取沉淀，沉淀用95%乙醇和無水乙醇洗滌，真空干燥后低溫保存。

1.5 尿素-硫脲提取法

尿素-硫脲提取法的基本原理是利用尿素和硫脲破壞疏水鍵、還原劑DTT破壞二硫鍵增加蛋白質(zhì)的溶解性，并使得蛋白酶失活。根據(jù)劉偉霞等[13]和王海玲等[14]的實(shí)驗(yàn)，尿素-硫脲提取法的主要操作步驟是：洗凈植物組織，使用液氮速凍，進(jìn)行低溫條件下研磨或超聲處理成粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，溶于尿素、硫脲、SDS、DTT、Triton-114為主要成分的溶液中，振蕩混勻，低溫離心處理后提取上清，加入預(yù)冷丙酮，低溫過夜，離心后收集沉淀，揮發(fā)掉丙酮。樣本中存在尿素，溶液溫度不能超過37°C。

TCA/丙酮法是促使蛋白質(zhì)在水中沉淀進(jìn)而分離的方法，屬于沉淀類方法；酚抽法和Trizol沉淀法是利用酚類物質(zhì)萃取蛋白質(zhì)進(jìn)而分離的方法，屬于萃取類方法；Tris-HCl法和尿素-硫脲提取法是促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解于水進(jìn)而分離的方法，屬于溶解類方法。

除此以外，Wei等[15]將TCA/丙酮法與酚抽法結(jié)合為TCA-丙酮-酚抽法后用于提取蛋白。楊秋玉等[16]提取4種杜鵑葉片蛋白質(zhì)時就采用TCA-丙酮-酚抽法：即先采用TCA-丙酮法沉淀蛋白，凍干后按照酚抽法的程序萃取蛋白。提取的蛋白質(zhì)樣品再進(jìn)行雙向電泳，獲得比較理想的電泳效果。TCA-丙酮-酚抽法兼有沉淀類方法和萃取類方法的特點(diǎn)。

2 植物蛋白質(zhì)樣品制備方法比較

植物組織的蛋白質(zhì)是動態(tài)的，至今沒有一種通用的制備方法能將材料中的蛋白全部提取出來。研究目的的不同，是盡可能獲得多的蛋白還是僅獲得興趣蛋白，影響了制備方法的選擇。但是無論是采用哪種方法，有一點(diǎn)必須做到的是盡可能多地去除核酸、多糖、多酚類、脂類、鹽類等雜質(zhì)，否則會影響蛋白分離效果和電泳圖譜質(zhì)量。不同的研究對象含有的雜質(zhì)不同，因此也影響了制備方法的選擇。

TCA/丙酮法是植物蛋白質(zhì)樣品制備最基本的方法。它的優(yōu)點(diǎn)是耗時少、容易操作，減少了蛋白酶的修飾作用，蛋白質(zhì)粗提物產(chǎn)量大，一般作為植物蛋白提取的初始方案。缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)容易變性，很難重新溶解，對一些植物組織中多酚類物質(zhì)的去除能力有限，因而可以加入適量的吸附劑PVPP或PVP對TCA/丙酮法進(jìn)行改良。劉國勇等[17]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)不溶于水的PVPP去除酚、醌類物質(zhì)的效果比可溶于水的PVP好。

酚抽法的優(yōu)點(diǎn)是能夠去除大量干擾物質(zhì)，獲得相對較多的低分子量蛋白。在植物組織含有大量易水解的多糖或易溶于水的鹽類時如海濱木槿和枇杷葉片組織[18-19]，酚抽法能夠?qū)⑵漤樌胨喽コ?。特別是含有大量多酚類、多糖和色素等次生代謝產(chǎn)物的頑拗植物組織，在蛋白分離效果方面酚抽法比TCA/丙酮法優(yōu)勢明顯。缺點(diǎn)是操作復(fù)雜耗時，Tris-飽和酚具有一定的毒性，易對環(huán)境造成污染。

Tris-HCl法的特點(diǎn)是加入SDS以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的溶解性，Tris-HCl緩沖液平衡pH值，遠(yuǎn)離各種氨基酸溶解度最小的等電點(diǎn)，因而其優(yōu)點(diǎn)是能夠分離出酸性蛋白、極高極低分子量蛋白，在疏水性蛋白的提取方面也有所改善，缺點(diǎn)是緩沖液需要密封保存。

Trizol沉淀法的特點(diǎn)是使用能夠分離DNA和RNA的Trizol試劑，因而優(yōu)點(diǎn)是能夠去除大量干擾物質(zhì)如DNA、RNA和高豐度組蛋白Rubisco。缺點(diǎn)是操作較為復(fù)雜，耗時耗力，成本較高。Trizol沉淀法用得比較少，一般用于植物葉片和幼苗的蛋白質(zhì)提取，如野牛草葉片、紫花苜蓿幼苗和黃花苜蓿幼苗[12，20-21]。

尿素-硫脲提取法的優(yōu)點(diǎn)是對低分子量蛋白質(zhì)分辨效果較好，價格低廉，操作簡便。缺點(diǎn)是在電泳中能夠檢測到的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較少，對多酚類、色素、鹽類等干擾物質(zhì)的去除能力不夠。從文獻(xiàn)中來看，尿素-硫脲提取法用得比較少。

TCA-丙酮-酚抽法則將TCA-丙酮沉淀法和酚抽法融合在一起，去除引起樣品溶液黏稠的多糖和核酸效果較好，在樣品溶液過于黏稠時相比于酚抽法具有一定的優(yōu)勢[16]。但該法也存在著操作繁瑣、蛋白損失較大的缺點(diǎn)。此方法在擬南芥葉片、非洲山毛豆葉片、銀杏小孢子葉球[22-24]等很多植物蛋白的提取中均取得了較好效果。

3 結(jié)論與展望

到目前為止，適于雙向電泳的植物蛋白質(zhì)樣品制備方法總共有6種，它們分別是：TCA/丙酮法、酚抽法、Tris-HCl法、Trizol沉淀法、尿素-硫脲提取法、TCA-丙酮-酚抽法：TCA/丙酮法是最基本、應(yīng)用最為廣泛的方法，蛋白質(zhì)粗提量大，加入PVPP可以去除多酚類；酚抽法適合于含有大量多糖、鹽類等次生代謝產(chǎn)物的植物蛋白質(zhì)樣品提?。籘ris-HCl法能夠分離出酸性蛋白和極高極低分子量蛋白；Trizol沉淀法適合于含有大量高豐度組蛋白Rubisco的植物葉片和幼苗的蛋白質(zhì)提??；尿素-硫脲提取法能夠分離出低分子量蛋白且操作簡便；TCA-丙酮-酚抽法去除引起樣品溶液黏稠的多糖和核酸效果較好。

在現(xiàn)在的植物蛋白質(zhì)雙向電泳的實(shí)驗(yàn)中，研究者往往需要同時運(yùn)用多種方法進(jìn)行樣品制備并進(jìn)行比較。希望在日后的研究中，研究者能夠在前人研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)樣品自身的特性次生代謝物成分和研究目的總結(jié)歸納各種方法的適用范圍，做到具體問題具體分析，摸索優(yōu)化出適合各種植物組織蛋白質(zhì)樣品制備的實(shí)驗(yàn)方案，加快植物蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展，更好地服務(wù)于生命科學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 阮松林，馬華升.植物蛋白質(zhì)組學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：1-13.

[2] 夏其昌，曾嶸.蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2004：233-304.

[3] 何瑞鋒，丁毅，張劍鋒，等.植物葉片蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的改進(jìn)與優(yōu)化[J].遺傳，2000，22（5）：319-321.

[4] Canovas F M，Dumas-Gaudot E，Recorbet G，et al. Plant proteome analysis[J].Proteomics，2004（4）：285-298.

[5] 謝進(jìn)，田曉明，劉淑欣，等.適用于毛白楊芽雙向電泳分析的蛋白質(zhì)提取方法[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013，35（4）：144-148.

[6] 陳晶瑜，郭寶峰，何付麗，等.適合雙向電泳的植物全蛋白提取方法比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（23）：97-100.

[7] 彭存智，李蕾，劉志昕.紅樹葉蛋白質(zhì)樣品制備方法的比較及其雙向電泳分析[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2010，1（1）：12-16.

[8] 劉楠，高飛，周宜君，等.蒙古沙冬青根蛋白的提取及雙向電泳體系的建立[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，49（4）：365-368.

[9] 曾廣娟，李春敏，張新忠，等.蘋果葉片蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法的比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（8）：105-108.

[10] 田忠景，康美玲，王秀文.石榴葉片蛋白提取方法研究[J].北方園藝，2012（19）：137-139.

[11] 周雪，馮輝，冀瑞琴.適合雙向電泳的大白菜花蕾蛋白提取及濃度測定方法[J].分子植物育種，2013，11（2）：249-254.

[12] 康俊梅，熊軍波，孫彥，等.利用雙向電泳技術(shù)分離野牛草葉片蛋白的方法研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：29-34.

[13] 劉偉霞，潘映紅.適用于小麥葉片蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（10）：2 169-2 176.

[14] 王海玲，池旭娟，闞雪芹，等.桑椹與葉片蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法的比較試驗(yàn)[J].蠶業(yè)科學(xué)，2009，35（4）：847-850.

[15] Wei W，Rita V，Monica，et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J]. Electrophoresis，2006（27）：2 782-2 786.

[16] 楊秋玉，耿興敏，彭方仁.杜鵑葉片3種蛋白質(zhì)提取方法的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，41（3）：440-444.

[17] 劉國勇，梁宏偉，陳發(fā)菊.巴東木蓮雌蕊柱頭蛋白的提取與雙向電泳分離[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（3）：393-396.

[18] 李翠云，姜彥成，喬桂榮，等.海濱木槿葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系的建立[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（4）：30-35.

[19] 馬斌，孫駿威，余初浪，等.枇杷葉片和果實(shí)總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳的優(yōu)化方法[J].果樹學(xué)報(bào)，2011，28（2）：358-362.

[20] 熊軍波.紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的蛋白質(zhì)組研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[21] 王楠.低溫脅迫下黃花苜蓿蛋白質(zhì)組的初步分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[22] Maldonado A M， Echevarría-Zome O S， Baptiste S J，et al. Evaluation of three different protocols of protein extraction for Arabidopsis thaliana leaf proteome analysis by two-dimensional electrophoresis[J].Journal of Protemics，2008（71）：461-472.

[23] 賴多，徐漢虹.非洲山毛豆葉片蛋白組雙向電泳樣品制備方法的建立[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（4）：103-107.

[24] 楊妮娜，崔彬彬，孫宇涵，等.銀杏小孢子葉球蛋白提取和雙向電泳體系優(yōu)化（Ⅱ）[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39（8）：55-57.