徐 敏，鄧道貴，張海軍，王文平，晁秋杰

(淮北師范大學生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，淮北 235000)

三種裸腹溞的16S rDNA序列分析與系統(tǒng)分類探討*

徐 敏，鄧道貴**，張海軍，王文平，晁秋杰

(淮北師范大學生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，淮北 235000)

為了檢驗已記錄的3種裸腹溞(發(fā)頭裸腹溞(Moinairrasa)、短型裸腹溞(Moinabrachiata)、微型裸腹溞(Moinamicrura))的系統(tǒng)分類，用試劑盒法分別提取3種裸腹溞的基因組DNA.利用特異性引物，通過PCR擴增了3種裸腹溞的16S rDNA部分序列，并與來自GenBank中每個種類相似度較高的裸腹溞屬序列進行分析.結(jié)果表明，3種裸腹溞的平均種間相似度為88.7%，堿基中A+T含量均明顯高于G+C含量.本研究的發(fā)頭裸腹溞的16S rDNA序列與GenBank所下載的多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)的16S rDNA序列相似度為99%，遺傳距離(K2P雙參考模型)為0.5%，屬種內(nèi)范圍；兩個地區(qū)的短型裸腹溞測得的16S rDNA序列與GenBank下載的歐洲短型裸腹溞的16S rDNA序列序列相似度相對較低(88%～90%)，遺傳距離較大(13.2%～13.5%左右)，已達到屬內(nèi)種間分化水平.基于16S rDNA構(gòu)建的NJ樹和貝葉斯樹也支持以上結(jié)論.結(jié)果表明，本研究的發(fā)頭裸腹溞可能為多刺裸腹溞，本研究用的短型裸腹溞與GenBank下載的歐洲短型裸腹溞已經(jīng)達到種間分化的標準.由于缺乏物種形態(tài)資料和其他分子標記的對比，3種裸腹溞的分類地位還需進行更深入的探討.

裸腹溞； 16S rDNA； 系統(tǒng)分類

裸腹溞屬(Moina)是枝角類的重要類群，通稱水蚤.本屬的描述種類有幾十種，我國記載的有十種，存在同物異名現(xiàn)象[1-2].早期的枝角類種類鑒定主要依據(jù)其形態(tài)特征，由于枝角類種類的分類特征有限以及形態(tài)變異十分豐富，加上近源個體之間可以雜交[3]，至今只有40%～50%的種類被準確描述，部分種類分類比較含糊，其中一些種類可能以種復合體的形式存在[4].隨著分子生物學技術(shù)的進步，利用基因標記對枝角類進行分子系統(tǒng)學研究已逐漸成為趨勢，Petrusek等以線粒體12S rRNA基因作為分子標記驗證了微型裸腹溞在兩個大陸間(歐洲中部和澳大利亞)的種類不統(tǒng)一[5]；Prosser等用不同引物在不同條件下進行對照，擴增了包括微型裸腹溞在內(nèi)的不同小型甲殼動物的線粒體COI基因[6]，但沒有進行系統(tǒng)分化方面的分析.國內(nèi)學者對薄皮溞屬(Leptodora)、西藏擬溞(Daphniopsistibetana)、擬同形溞(Daphniasimiloides)的系統(tǒng)分類進行了研究[7-9]，有關(guān)裸腹溞屬系統(tǒng)分化的研究尚未見報道.本研究通過對安徽巢湖、江蘇太湖、洪澤湖、淮北乾隆湖4個湖泊中已發(fā)現(xiàn)的短型裸腹溞、發(fā)頭裸腹溞和微型裸腹溞的16S rDNA序列進行分析，通過與GenBank上下載的與本研究序列相似度最大的裸腹溞屬種類的16S rDNA進行比對，探討他們之間的分子系統(tǒng)關(guān)系，提出了一些與傳統(tǒng)分類上不一致的問題，以期為裸腹溞屬的遺傳多樣性和物種歸屬問題提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究用巢湖的短型裸腹溞、發(fā)頭裸腹溞和微型裸腹溞來自2012年3月巢湖及其支流(南淝河)沉積物中休眠卵的孵化，并分離鑒定[2，10](表1)；洪澤湖發(fā)頭裸腹溞于2013年6月采集于洪澤湖；太湖微型裸腹溞于2013年5月采自太湖；乾隆湖短型裸腹溞于2014年5月采自淮北乾隆湖.幾種裸腹溞種類均在智能光照培養(yǎng)箱中用斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃±1℃、光照時間L∶D=12h∶12h.實驗時用吸管吸取單只個體饑餓一晝夜后用雙蒸水沖洗，離心管收集備用.

1.2 基因組DNA提取

采用微量樣品基因組DNA試劑盒(TIANamp Micro DNA Kit)提取裸腹溞屬DNA.由于裸腹溞屬種類屬于小型甲殼動物，外被甲殼，在提取前用滅菌的牙簽搗碎溞體，有利于蛋白酶K對組織進行消化.

表1 本研究中樣本核苷酸序列的來源及編號Tab.1 The origin and number of nucleotide sequence of samples in this study

1.3 PCR擴增及序列測定

用于擴增16S rDNA基因引物[11]：L2510 5′ to 3′(CGCCTGTTTAACAAAAACAT) H3059 5′ to 3′(CCGGTCTGAACTCAGATCATGT)

PCR反應體系25μl，每個反應體系內(nèi)含10×LA-Taq BufferⅡ 2.5μl、dNTP(2.5 mol)4.0μl、Mg離子(2.5 mol)0.5μl、模板DNA(100 ng/μl左右)1.0μl、Taq酶(5U/μl)0.25μl、上下游引物各(10μm)1.0μl，雙蒸水補足到25μl.

擴增條件為95℃預變性3min，95℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，72℃ 10min充分延伸，4℃結(jié)束.

擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，選擇目的帶清晰且明亮的PCR反應產(chǎn)物送交生工生物工程公司(上海)純化并測序.所有樣品均采用雙向測序，正反向?qū)Ρ群蟠_定分析用序列，用DNAStar中的SeqMan比對，并對比峰圖修除兩端不可靠的堿基，經(jīng)人工校正后獲得CDL有效堿基417個，CFL有效堿基411個，CWL有效堿基417個，HFL有效堿基381個，TWL有效堿基406個，QDL有效堿基491個.其它從GenBank上下載的用于分析的序列見表1.

1.4 系統(tǒng)發(fā)生分析

用DNAStar對測序結(jié)果進行人工校正，并去除兩端冗余序列.使用DNAStar 軟件比較序列差異百分比；用Clustalx 1.81軟件多重序列比對；用DNAspV5分析變異位點；用Mega 4.1計算不同序列間轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)，生成序列差異位點表，并計算遺傳距離和構(gòu)建NJ進化樹.采用K2P雙參模型計算兩兩遺傳距離，系統(tǒng)樹設置采用P-distance模型，以大型溞(Daphniamagna)為外群，Bootstrap Replications1000次；用Mrbayes 3.2構(gòu)建貝葉斯樹，替換模型設置參數(shù)nst=6(GTR模型)，位點速率變異設置invgamma，其余設置為默認值；采用mcmc法運算500000代，每100代取樣一次，在舍棄25%老化樣本后，用剩余樣本構(gòu)建一致樹.

2 結(jié)果

CDL、QDL、CFL、CWL、HFL、TWL在DNAStar中經(jīng)過兩兩序列比對，TWL與CWL相似度為100%，HFL與CFL相似度為99%，有兩個位置發(fā)生轉(zhuǎn)換；CDL與QDL相似度為99%，有一個位置發(fā)生轉(zhuǎn)換，另一個位置發(fā)生顛換.堿基中A+T含量(67.6%)明顯高于G+C含量(32.4%)；3個物種間平均種間相似度為88.7%，用DNAsp v5進行序列變異位點分析，上述6個裸腹溞屬個體可識別位點(包括缺失與丟失的位點)381個，其中保守位點313個，變異位點68個，單一位點3個，簡約信息點65個；用MEGA軟件分析平均轉(zhuǎn)換/顛換(si/sv)數(shù)為0.78，顛換數(shù)明顯高于轉(zhuǎn)換數(shù).與來自GenBank上Moina的16S rDNA進行序列比對，計算遺傳距離見表3；就構(gòu)建的NJ樹(圖1a)和貝葉斯樹(圖1b)來看，兩者主要分枝基本一致.

圖1 基于9個裸腹溞屬個體16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(NJ樹)(a)和貝葉斯樹(b)Fig.1 NJ tree(a) and Bayes tree(b) based on the sequence of 16S rDNA in nine Moina individuals

3 討論

3.1 3種裸腹溞的16S rDNA序列分析

線粒體rRNA基因是非編碼蛋白質(zhì)的基因，進化過程中未受到密碼子編碼的選擇壓力影響，進化速率相對較低且比較保守[12].本研究所測3個裸腹溞屬種類的個體中，種間的16S rDNA序列相似度百分比在87%～90%之間(表2)，這與臂尾輪蟲屬的種間序列相似度較一致[13].從已測出的3種裸腹溞的16S rDNA部分堿基序列比對表可以看出，3個裸腹溞屬種類的變異區(qū)相對比較集中，以序列最短的洪澤湖發(fā)頭裸腹溞序列作為基準定位，在第1位到第163位堿基之間僅有12處發(fā)生堿基的改變，而從164到282之間卻有51處發(fā)生變異；堿基中A+T(67.6%)與Petrusek等研究的多刺裸腹溞和微型裸腹溞12S rRNA基因的A+T含量(69.4%～72.5%)接近[5]，較高的A+T含量是無脊椎動物線粒體DNA中的普遍現(xiàn)象[14-16].

3.2 3個裸腹溞屬種類的系統(tǒng)分類探討

經(jīng)過DNAStar序列比對，CFL與HFL的16S rDNA序列相似度為99%，遺傳距離(K2P雙參模型，下同)為0.5%，這可能是地理隔離造成的種內(nèi)遺傳差異.而CFL和HFL的16S rDNA序列與從GenBank下載的NCL的遺傳距離也較小(0.5%～1.1%)，遠低于枝角類線粒體序列種內(nèi)差異上限5%的分歧度[17].NJ樹(P-distance模型)也支持NCL與CFL和HFL聚為一類.因此，就16S rDNA分析看，我國的CFL和HFL應與來自歐洲的NCL為同一個物種.通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)[18-21]，發(fā)頭裸腹溞這一名稱僅限國內(nèi)學者使用，國外學者較少使用，而Goulden把發(fā)頭裸腹溞歸到M.affinis一類[22].本研究的發(fā)頭裸腹溞雌性體長一般大于1.00mm，孵育囊飽滿時，殼高常大于殼長.頭部膨大，背側(cè)叢生剛毛，無眼上凹，卵鞍長卵形，內(nèi)儲2個冬卵.后腹部寬大，各側(cè)有10個羽狀肛刺.這與《中國動物志·淡水枝角類》[2]中對發(fā)頭裸腹溞的描述一致.通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，本研究的發(fā)頭裸腹溞在肛刺數(shù)量、卵鞍形狀及卵鞍內(nèi)冬卵的數(shù)量等方面與M.affinis存在較大的區(qū)別，與多刺裸腹溞的卵鞍形狀、卵鞍內(nèi)冬卵的數(shù)量也不同[2，22].Elmoor-Loureiro等報道了一種新發(fā)現(xiàn)的多刺裸腹溞，其外形、卵鞍特征和冬卵數(shù)量與本研究的發(fā)頭裸腹溞相似[23].結(jié)合16S rDNA序列的分析結(jié)果，推測本研究的發(fā)頭裸腹溞應為多刺裸腹溞.由于缺乏更多的形態(tài)和分子對比資料，有關(guān)國內(nèi)發(fā)頭裸腹溞的歸屬問題仍需進一步的探討.

表2 9個裸腹溞屬個體16S rDNA的遺傳距離(對角線下)和序列相似度(對角線上)Tab.2 The genetic distances(below diagonal) and sequence similarity(above diagonal) of 16S rDNA in nine Moina individuals

本研究的微型裸腹溞雌性體長在0.65～0.83mm之間，復眼很大，位于頭頂；頭部很大，背側(cè)有較深的眼上凹；后腹部短，側(cè)面有羽狀肛刺6個，叉狀肛刺1個；卵鞍近乎卵圓型，內(nèi)儲冬卵1個.這些形態(tài)特征與《中國動物志.淡水枝角類》[2]中關(guān)于微型裸腹溞的描述較一致.來自巢湖與太湖的微型裸溞相似度為100%，但在NCBI的BLAST中未找到與之相似度較高的物種，只有M.brachiata(JN651425)與之有92%的相似度；在GenBank中也沒有找到微型裸腹溞16S rDNA序列的數(shù)據(jù)與本研究進行比對.因此，關(guān)于微型裸腹溞的分子系統(tǒng)學仍需做更多的研究.

本研究的短型裸腹溞雌性體長1.00～1.50mm，淺青灰色，殼瓣背緣均勻弓起，頭部無毛發(fā)，長度超過殼長的一半，向下傾斜，背側(cè)有大而深的眼上凹，后腹部較長，各側(cè)有羽狀肛刺8個，叉狀肛刺一個，這與《中國動物志·淡水枝角類》[2]中的短型裸腹溞描述較一致.卵鞍內(nèi)儲冬卵一個，這與文獻[22]中對短型裸腹溞的描述一致.本研究中，巢湖(CDL)和淮北乾隆湖(QDL)的短型裸腹溞相似度為99%，遺傳距離為0.5%.他們與GenBank下載的歐洲短型裸腹溞(NDL1、NDL2)的相似度相對較小(88%～90%)，遺傳距離(13.2%～13.5%)較大.其遺傳距離遠遠大于枝角類小于5%的種內(nèi)范圍[17]，達到端足類鉤蝦屬的種間分化水平[24].就NJ樹和貝葉斯樹分析，CDL、QDL與下載的歐洲短型裸腹溞(NDL1和NDL2)的分枝較遠，也已經(jīng)不在一個種的界限內(nèi).造成這種差距的原因可能有兩點：一是長期遠距離的地理隔離，不同環(huán)境發(fā)生的自然選擇不同導致遺傳上的較大差異；二是存在形態(tài)相似而基因有差別的物種或稱隱種[25]，這種現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)生在微型裸腹溞的跨洲(歐洲中部和澳大利亞)分化上[5].圓形盤腸溞曾被看作是枝角類中一個分布較廣、生活習性多樣化的種，但后來發(fā)現(xiàn)它實際上是以一種復合體的形式存在[26-27].其他廣泛分布的短鈍溞(D.obtusa)、長額象鼻溞(Bosminalongirostris)也依然存在分類上的誤區(qū)[4].關(guān)于枝角類物種的統(tǒng)一性問題一直受到質(zhì)疑[28-29].近年來，隨著分子工具的使用，大量的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子研究都證明了非統(tǒng)一性物種的存在，這將會改變我們對枝角類的發(fā)展史、生物地理學和物種多樣性的認識[30-33].

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Molecular phylogeny of threeMoinaspecies based on 16S rDNA gene sequences

XU Min， DENG Daogui， ZHANG Haijun， WANG Wenping & CHAO Qiujie

(AnhuiKeyLaboratoryofResourceandPlantBiology，SchoolofLifeScience，HuaibeiNormalUniversity，Huaibei235000，P.R.China)

In order to examine the systematic classification of threeMoinaspecies，M.irrasa，M.brachiataandM.micrurarecorded previously， genomic DNA of threeMoinaspecies were extracted through the kit method. PCR was used to amplify partial sequences of 16S rDNA of threeMoinaspecies by employing specific primers， and same sequence with higher matching rate of eachMoinaspecies from the GenBank were analysed. Based on 16S rDNA， the average interspecific similarity rate among threeMoinaspecies was 88.7%， and the content of A+T was obviously higher than that of G+C.The similarity ofM.irrasain this study andM.macrocopafrom the GenBank was 99%， and the divergence rate was 0.5%， within a range of same species. The similarity ofM.brachiatain this study and the GenBank was relatively low(88%-90%)， and the divergence rate was 13.2%-13.5%， without a range of same species. The NJ tree and Bayes tree based on 16S rDNA did also support the above results.The results suggested thatM.irrasain this study andM.macrocopafrom the GenBank might be the same species， andM.brachiatafrom this study and the GenBank had reached the standard of species divergence. Due to the lack of morphology and other genes analysis， the classification status of threeMoinaspecies in this study mentioned need to be further investigated.

Moina； 16S rDNA； systematic classification

*國家自然科學基金項目(31370470)資助.2014-03-18收稿；2014-07-02收修改稿.徐敏(1983～)，女，碩士研究生；E-mail：minxuzheng@126.com.

*通信作者；E-mail：dengdg@263.net.