夏碧麗，王硯春，郭曉奎，何 平，華允芬

鉤端螺旋體脂多糖的結(jié)構(gòu)和功能分析

夏碧麗1,2，王硯春2，郭曉奎2，何 平2，華允芬1

鉤端螺旋體脂多糖(L-LPS)是鉤體外膜上的主要成分，由O-抗原特異性多糖、核心寡糖和脂質(zhì)A 3部分組成。L-LPS是一種重要的毒力因子，在鉤體致病性、免疫性及與外部環(huán)境的相互作用中扮演著重要的角色?；贚PS結(jié)構(gòu)特征的不同鉤體分為不同的血清型。鉤端螺旋體的LPS結(jié)構(gòu)研究對于鉤體的分子分型及鉤體糖-偶聯(lián)疫苗的開發(fā)具有重要意義。本文對L-LPS的結(jié)構(gòu)、O-抗基因簇、生物學(xué)活性和鉤體病預(yù)防方面的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要的綜述。

鉤端螺旋體；脂多糖；O-抗原簇；疫苗

鉤端螺旋體病是由致病性問號鉤端螺旋體(鉤體)引起的全球廣泛流行的人獸共患病，普遍流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。我國大部分地區(qū)的氣候條件適合鉤體生長、繁殖，是主要的流行區(qū)之一。鉤體可引起人類，牲畜和野生動物的感染，嚴(yán)重者可因肺彌漫性出血而死亡[2]。與其他一些主要的螺旋體如伯氏疏螺旋體不同，鉤體的表面成分主要為脂多糖[3]。鉤體脂多糖(L-LPS)不僅決定了鉤體菌株血清學(xué)特異性[4]，亦是一種重要的毒力因子，在鉤體致病性、免疫性及與外部環(huán)境的相互作用中扮演著重要的角色[5-6]。研究L-LPS結(jié)構(gòu)對于鉤體的分子分型，鉤體的致病性及鉤體糖-偶聯(lián)疫苗的開發(fā)具有重要意義。本文就L-LPS的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 L-LPS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

細(xì)菌的脂多糖由親水性特異性多糖鏈(O-抗原)、非特異核心寡糖和疏水性脂質(zhì)A 3部分組成。糖鏈暴露于細(xì)菌表面，由2～6個(gè)單糖組成的寡聚糖單位聚合組成，是LPS分子最容易變異的部分。O-抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，其組成的糖的種類多樣，糖鏈的分支位點(diǎn)和長度也各不相同，決定了菌株血清學(xué)特異性[7]。核心寡糖由L-甘油-D-甘露庚糖(L，D-Hep)和2-酮-3-脫氧辛糖酸(KDO)組成，以共價(jià)鍵連接脂質(zhì)A和O-抗原。脂質(zhì)A是最保守的部分，是脂多糖的毒性和生物活性中心，但是單獨(dú)脂質(zhì)A部分的活性比完整的LPS低很多[8]。不同種屬細(xì)菌的脂質(zhì)A骨架基本一致，由磷酸化D-氨基葡萄糖雙糖構(gòu)成的親水性骨架和疏水性脂肪酸鏈組成，主要差別是脂肪酸的種類和磷酸基團(tuán)不同[7]。

鉤體由于培養(yǎng)困難，其LPS結(jié)構(gòu)研究亦極具挑戰(zhàn)性。目前僅有問號鉤體波摩那型菌株脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)的報(bào)道，對于整個(gè)L-LPS結(jié)構(gòu)仍未知，L-LPS糖鏈與其他細(xì)菌LPS有何差別也尚不明確[9]。經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振分析發(fā)現(xiàn)，鉤體脂質(zhì)A 4條脂肪酸鏈均為N-?；舅徭?；脂肪酸鏈長度亦與一般的細(xì)菌的脂質(zhì)A不同，而且有兩條鏈含有不飽和鍵；最不尋常的是N-乙酰葡萄胺雙糖的兩端僅含一個(gè)甲基化磷酸基團(tuán)(圖1)，該情況未在其他細(xì)菌的脂質(zhì)A 中發(fā)現(xiàn)過[10]。

結(jié)構(gòu)不同部分由不同顏色表示

The difference structure of lipid A between Leptospires andE.coliis denoted with different colors.

圖1 大腸埃希菌和鉤體兩者的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)比較[9]

Fig.1 Comparative structure of lipid A fromEscherichiacoliand Leptospires

2 鉤體O-抗原基因簇

革蘭陰性菌中O-抗原結(jié)構(gòu)的多樣性是以O(shè)-抗原相關(guān)基因序列的多樣性為基礎(chǔ)的。血清型不同的細(xì)菌，其O-抗原相關(guān)基因也存在較大差異[11]。并且這些O-抗原相關(guān)基因常常在染色體上聚集在一起，形成一個(gè)基因簇[12]。鉤體全基因測序并分析已確定了鉤體LPS生物合成位點(diǎn)接近100個(gè)基因，主要覆蓋了100 kb左右的基因組區(qū)域，比大腸埃希菌的O-抗原基因簇要大得多，推測鉤體LPS結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜[3, 13]。根據(jù)O-抗原不同，鉤體分為不同的血清型，經(jīng)顯微凝集試驗(yàn)和交叉凝集素吸收實(shí)驗(yàn)已分離并鑒定到200多個(gè)血清型[14-15]。然而交叉凝集素吸收實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜耗時(shí)，早期感染檢測敏感性和特異性均較低。

目前，隨著鉤體基因組測序發(fā)展，通過對不同血清群鉤體代表菌株的O-抗原相關(guān)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鉤體中O-抗原兩端是MarR 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的編碼基因和硫酸鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體的編碼基因，可以作為血清型鉤體O-抗原基因簇始末的標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)可使用PCR方法擴(kuò)增O-抗原特異基因而進(jìn)行血清群鑒定[16-17]。通常革蘭陰性菌中的O-抗原特異基因的 PCR 的靶標(biāo)基因如O-抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)和O-抗原聚合酶基因(wzy)在鉤體中相似度極高[4]。而其它一些特有的功能酶基因，如犬群(Canicola)代表株桂44中脫氫鼠李糖還原酶(dehydrorhamnose reductase)基因是該血清群特異的；流感傷寒群(Grippotyphosa)代表株臨六中，糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase)是該血清群所特有的[4]。這些基因的序列與其它基因序列的相似度都比較低，適合作為PCR區(qū)分血清群的分子分型靶標(biāo)。蔡成松等進(jìn)一步對我國鉤端螺旋體75株標(biāo)準(zhǔn)參考菌株以及40株野生分離菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了使用O-抗原特異基因區(qū)分血清群的可行性和可靠性[16]。

3 L-LPS生物學(xué)活性

細(xì)菌的LPS作用于機(jī)體內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞后，誘導(dǎo)其分泌多種細(xì)胞因子，在局部或隨血液循環(huán)至全身各處而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)革蘭陰性菌LPS的生物學(xué)活性作用涉及到TLR4，髓樣分化蛋白2(MD-2)和CD14分子。CD14結(jié)合LPS并傳遞分子到MD-2[18]。當(dāng)MD-2結(jié)合LPS分子的脂質(zhì)A部分后，它經(jīng)歷一個(gè)結(jié)構(gòu)變化，并形成了與TLR4相互作用的蛋白口袋[19]。這種相互作用啟動細(xì)胞內(nèi)TIR域聚到一起，形成一個(gè)位點(diǎn)使接頭蛋白組裝成寡聚體結(jié)構(gòu)，并啟動細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。

L-LPS與鉤體的致病性密切相關(guān)。近年來有報(bào)道，LPS生物合成突變的Manilae血清型表現(xiàn)為對倉鼠的毒力減弱，無感染的臨床體征[20]。該突變體也無法定植于小鼠的腎臟[21]。此外，亦發(fā)現(xiàn)鉤體感染宿主后脂多糖代謝基因表達(dá)明顯上調(diào)，說明L-LPS是致病性相關(guān)的重要分子[22]。與大多數(shù)細(xì)菌的LPS主要由TLR4識別不同，L-LPS在人類細(xì)胞中主要由TLR2/ TLR1識別[23]。而在小鼠中L-LPS即可由TLR4識別亦可通過TLR2識別[24]。其次，研究亦發(fā)現(xiàn)與宿主細(xì)胞作用時(shí)，L-LPS能刺激并誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞因子，但誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)水平比大腸埃希菌LPS刺激后要低得多[24]。L-LPS的生物學(xué)活性僅為大腸埃希菌LPS的1/10～1/100，與鱟試劑的反應(yīng)亦非常弱[24]。其原因可能與鉤體脂質(zhì)A雙糖骨架兩端的4’-位磷酸基團(tuán)缺失及甲基化有關(guān)[10, 25]。脂質(zhì)A作為LPS重要的毒性組分，是模式識別受體識別配體的主要結(jié)構(gòu)域，與天然免疫應(yīng)答密切相關(guān)[19]。L-LPS在人和小鼠中識別的Toll樣受體不同，可能與人感染后可以表現(xiàn)為嚴(yán)重的鉤體病而小鼠感染鉤體后癥狀輕微或無癥狀相關(guān)[9]。進(jìn)一步研究L-LPS與不同宿主Toll樣受體識別及相應(yīng)天然免疫應(yīng)答的差異，將對鉤體致病機(jī)制有更深入的了解。

4 鉤體 LPS在預(yù)防鉤體病中的作用

LPS是鉤端螺旋體外膜的主要成分，可引發(fā)保護(hù)性免疫，是鉤體疫苗的主要組成成分[26]。已知抗L-LPS的單克隆抗體可以防止豚鼠和倉鼠的急性致死性感染[27]。其次在鉤體病人的血清中也能夠顯著檢測到L-LPS抗體的存在[28]。目前唯一批準(zhǔn)上市的鉤體疫苗即是以LPS為基礎(chǔ)的全細(xì)胞滅活全菌疫苗。這一疫苗已廣泛應(yīng)用在牛、豬、狗和人。然而目前使用的鉤體全菌疫苗存在較多缺陷。首先，鉤體全菌疫苗引起的免疫反應(yīng)由體液免疫介導(dǎo)[29]。并受L-LPS相關(guān)的血清型影響，不同血清型之間無交叉免疫。在多個(gè)血清型鉤體流行的地區(qū)，需使用多價(jià)鉤體疫苗[30-31]。其次，全菌疫苗所引起的免疫主要是針對L-LPS，為T細(xì)胞非依賴抗原，因此主要產(chǎn)生IgM抗體，缺乏記憶應(yīng)答，免疫力的持續(xù)時(shí)間因此較短，需每年接種[32]。鉤體新候選疫苗的研發(fā)成為近年來鉤體研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。新的候選疫苗的研究方向包括減毒活疫苗，重組蛋白疫苗及LPS偶聯(lián)疫苗等，均處于探索初期階段[32]。

L-LPS可引發(fā)保護(hù)性免疫，但持續(xù)時(shí)間較短。有研究者提出類似于流感嗜血桿菌的免疫偶聯(lián)疫苗開發(fā)的可能性。研究發(fā)現(xiàn)L-LPS偶聯(lián)白喉類毒素蛋白載體后可增強(qiáng)其免疫原性和保護(hù)性免疫[33]。其次在選擇偶聯(lián)載體蛋白時(shí)，選擇包含2種或多種T細(xì)胞表位的載體蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫，產(chǎn)生記憶免疫，將有效增加疫苗保護(hù)時(shí)間[34-36]。但由于L-LPS有較多的血清型，且其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，糖鏈部分至今結(jié)構(gòu)未知，鉤體脂多糖-蛋白偶聯(lián)疫苗的研發(fā)仍將是巨大的挑戰(zhàn)。

5 展 望

盡管鉤體發(fā)現(xiàn)迄今已有100余年，在L-LPS作用機(jī)制和預(yù)防鉤體病方面已經(jīng)取得許多成果，但L-LPS完整結(jié)構(gòu)及與其特殊生物學(xué)活性之間關(guān)系至今仍不清楚。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和鉤體全基因組測序完成，用生物信息學(xué)方法分析LPS的生物學(xué)功能將是一種較好的方法。其次鉤體O-抗基因簇的確定使根據(jù)O-抗原特異基因進(jìn)行血清群鑒定成為可能。進(jìn)一步深入研究L-LPS的結(jié)構(gòu)，亦將有利于鉤體LPS-蛋白偶聯(lián)疫苗的開發(fā)和L-LPS作用機(jī)制的研究，對疾病的防控將具有重要意義。

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Stucture and function of leptospiral lipopolysaccharide

XIA Bi-li1,2,WANG Yan-chun2,GUO Xiao-kui2,HE Ping2,HUA Yun-fen1

(1.DepartmentofPharmaceutical,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310012,China; 2.DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,BasicMedicalCollege,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China)

Leptospiral lipopolysaccharide (L-LPS) is a major component of leptospires outer membrane which consists of three parts, namely O-antigen, core oligosaccharide and lipid A. L-LPS is one of the virulence factors which plays an important role in its pathogenicity, antigenicity, and interacts with external environment. Based on the structural characteristic of LPS, leptospires can be divided into different serotypes. The study of L-LPS structure is important for leptospires molecular typing and Glycan-Conjugate vaccines development. This article gives a brief review on the research progress of L-LPS structure, O-antigen gene cluster, biological activity of L-LPS and L-LPS related vaccine.

leptospires; lipopolysaccharide; O-antigen cluster; vaccine

Hua Yun-feng, Email: huayfyxwd@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.020

國家自然科學(xué)基金(No.81471908)

華允芬，Email: huayfyxwd@hotmail.com

1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014; 2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025

R377

A

1002-2694(2015)12-1185-04

2015-08-04；

2015-10-12

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81471908)