劉 嬡，馮 將，鮮思美，劉宗勝，李鵬飛，羅代兵

羊口瘡病毒F1L和B2L基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)

劉 嬡1, 2，馮 將1, 2，鮮思美1, 2，劉宗勝3，李鵬飛1,2，羅代兵1, 2

目的 為構(gòu)建羊口瘡病毒F1L和B2L基因真核表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)驗(yàn)證其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)。方法 本試驗(yàn)以pVAX1為真核表達(dá)載體，在前期構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基礎(chǔ)上，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L，對(duì)其分別進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L轉(zhuǎn)染至MDBK細(xì)胞，采用RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)目的基因表達(dá)。結(jié)果 雙酶切鑒定和序列測(cè)定表明真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L構(gòu)建成功，RT-PCR和IFA同時(shí)驗(yàn)證目的基因在MDBK細(xì)胞漿中能瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)論 本試驗(yàn)構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒為下一步羊口瘡病毒核酸疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

羊口瘡病毒；F1L基因；B2L基因；真核表達(dá)

羊口瘡(Orf)，又名羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎，是由羊口瘡病毒(Orf virus，OrfV)引起的綿羊和山羊急性、高度接觸性、嗜上皮性人獸共患傳染病[1]。羊口瘡病毒為副痘病毒屬成員之一，基因組全長(zhǎng)134～139 kb，中央編碼區(qū)(ORFs009-111)較為保守。B2L與F1L基因分別位于羊口瘡病毒第11和第59個(gè)完整開(kāi)放閱讀框，高度保守，編碼42 kD和39 kD蛋白[2]。其中，42 kD蛋白是病毒核衣殼主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答；39 kD蛋白是構(gòu)成病毒表面微管的主要成分之一，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[3]。 二者均能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時(shí)與病毒的吸附和侵入有關(guān)，是研究較多的、具良好免疫原性的蛋白。

羊口瘡感染的典型癥狀是口、鼻、唇及外陰部皮膚出現(xiàn)菜花樣增生性損傷，也可感染齒齦、舌頭或其它部位。通常羊口瘡病毒引起羊群發(fā)病率高，致死率低，但羊口瘡病導(dǎo)致病羊呼吸、采食困難和繼發(fā)其他病毒或細(xì)菌混合感染，從而引起病羊死亡[4]，3～6月齡羔羊易發(fā)本病。臨床治療羊口瘡一般采用保守療法，消炎收斂，主要以抗生素控制繼發(fā)感染為主。疫苗接種為控制羊口瘡病的較為有效的手段。國(guó)外常用D1701株弱毒疫苗，國(guó)內(nèi)關(guān)于羊口瘡地方株自制滅活疫苗和弱毒苗的研究。由于羊口瘡疫苗仍處于研究階段，且需求量相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)很難買(mǎi)到羊口瘡市售疫苗。此外，傳統(tǒng)疫苗可能會(huì)出現(xiàn)免疫后抗體水平不高、毒力返強(qiáng)等現(xiàn)象，快速高效、經(jīng)濟(jì)適用、安全方便的新型疫苗則解決這一難題。核酸疫苗是近年來(lái)研究較為多的新型疫苗。關(guān)于羊口瘡病的核酸疫苗研究較少，趙魁[5]用真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)成功構(gòu)建并表達(dá)了pCDNA3.1-ORFV 011(B2L)、pCDNA3.1-ORFV 059(F1L)和pCDNA3.1-ORFV 011(B2L)-linker-ORFV(F1L)疫苗質(zhì)粒；張克山[6]等用真核表達(dá)載體pVAX1取代pCDNA3.1，成功構(gòu)建了更為安全的DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1-B2L。但采用pVAX1載體構(gòu)建OrfV B2L和F1L基因核酸疫苗未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以羊口瘡病毒B2L和F1L基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L和pVAX1-F1L，二者轉(zhuǎn)染至MDBK細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR和IFA驗(yàn)證該基因的表達(dá)，為羊口瘡病毒基因核酸疫苗及下一步雙基因核酸疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T-F1L、pMD18-T-B2L克隆質(zhì)粒、pVAX1質(zhì)粒及OrfV 高免陽(yáng)性血清由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究室保存；T4 DNA 連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒、RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；膠回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，脂質(zhì)體2000(Lipofatamiane 2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗羊IgG-FITC購(gòu)自北京博奧森公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本研究前期提交的OrfV-GZF1L基因(登錄號(hào)：KP057582)和B2L基因(登錄號(hào)：KP994595)，結(jié)合pVAX1真核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)B2L和F1L基因特異性引物。選用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ作為酶切位點(diǎn)，在5′端的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)后添加Kozak序列(ACCACC)。引物由上海英濰捷基公司合成，序列見(jiàn)表1：

表1 加Kozak序列的F1L和B2L基因的引物序列

1.3 目的基因擴(kuò)增 以pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L克隆質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，分別取模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2× PCR Mix 12.5 μL ，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，54℃退火45 s，72 ℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。

1.4F1L和B2L基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別回收純化目的片段，將F1L和B2L基因及真核表達(dá)載體pVAX1均用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切，酶切體系20 μL，分別取目的基因或載體6 μL，10×buffer 2 μL，Hind Ⅲ(10 U/μL)和EcoR Ⅰ(10 U/μL)各取1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL， 37 ℃酶切3 h。酶切后用膠回收試劑盒，分別將目的基因和pVAX1載體回收，再用T4 DNA連接酶連接，連接體系為pVAX1載體5 μL，目的DNA片段1 μL，10×Ligation Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase(5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 11.8 μL，22 ℃孵育10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α大腸桿菌，涂布于含Kana霉素抗性LB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單菌落于含Kana霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒小量提取試劑盒，提取菌液中質(zhì)粒。

1.5F1L和B2L基因重組真核質(zhì)粒的鑒定 對(duì)1.4所提的重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，同時(shí)送往上海英濰捷基公司測(cè)序。

1.6 重組質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L的轉(zhuǎn)染 使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，抽提真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX-B2L，分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，選擇OD260與OD280比值在1.8～2.0之間對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，并計(jì)算濃度。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)MDBK細(xì)胞12孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染前MDBK細(xì)胞約90%～100%鋪滿(mǎn)，空載體對(duì)照組為相同劑量的pVAX1載體，空白對(duì)照組為正常培養(yǎng)細(xì)胞。

1.7 RT-PCR檢測(cè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，使用RNA提取試劑盒提取真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組以及對(duì)照組細(xì)胞總RNA，用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用1.2 中特異性引物通過(guò)1.3中PCR方法檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)情況。

1.8 間接免疫熒光檢測(cè)真核質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，取出12孔板，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每次5 min，自然干燥后，滴加40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加0.5% Trition穿透細(xì)胞15 min，PBS洗滌，5% BSA 37 ℃封閉1 h，PBS洗滌。加入1∶50倍比稀釋OrfV 高免陽(yáng)性血清，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌；加入兔抗羊IgG-FITC(1∶500)，PBS洗滌3次，自然干燥后置于熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，空載體組和同形對(duì)照組。同形對(duì)照組不加陽(yáng)性血清，其余步驟相同，用于觀察細(xì)胞與熒光標(biāo)記抗體間的本底顯色。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴(kuò)增 以構(gòu)建好的pMD18-T-F1L和pMD18-T-B2L克隆質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增F1L和B2L基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，F(xiàn)1L基因大小約為1 029 bp，B2L基因大小約為1 137 bp，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

2.2 重組真核質(zhì)粒鑒定 通過(guò)HindⅢ和EcoRⅠ將構(gòu)建好的pVAX1-F1L和pVAX1-B2L分別雙酶切，可見(jiàn)pVAX1-F1L有一條約1 029 bp的目的條帶及約3.0 kb的空載體條帶，pVAX1-B2L有一條約1 137 bp的目的條帶及約3.0 kb的空載體條帶，與預(yù)期相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果表示F1L和B2L基因和pVAX1載體連接正確。將雙酶切與測(cè)序結(jié)果鑒定為陽(yáng)性的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pVAX1-F1L和pVAX1-B2L。

M:DNA Marker III; 1: F1L products; 2: B2L products.

M: DNA Marker III; 1: Recombinant plasmid of pVAX1-F1L; 2: The pVAX1-F1L digested withHind Ⅲ andEcoR I;3: Recombinant plasmid of pVAX1-B2L; 4: The pVAX1-B2L digested withHindⅢ andEcoRI; 5: The non-carrier of pVAX1 vector.

圖2 pVAX1-F1L和pVAX1-B2L酶切鑒定

Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pVAX1-F1L and pVAX1-B2L

2.3 RT-PCR檢測(cè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá) 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L和pVAX1-F1L轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總RNA，用F1L和B2L基因特異性引物，通過(guò)兩步法RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞總RNA，檢測(cè)到目的基因表達(dá)(圖3)。

2.4 IFA檢測(cè)B2L和F1L基因的表達(dá) 按1.7方法進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L組轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞48 h后，細(xì)胞胞漿可見(jiàn)綠色熒光(圖A，圖B)，同形對(duì)照組未見(jiàn)熒光(圖A-1，圖B-1)，pVAX1空載體組及正常細(xì)胞組未見(jiàn)綠色熒光(圖C，圖D)。

M: Marker D2 000; 1: MDBK cells transfected by pVAX1-F1L ; 2: MDBK cells transfected by pVAX1-B2L; 3: MDBK cells transfected by non-carrier of pVAX1 vector; 4: The normal MDBK cells.

圖3 F1L和B2L基因 mRNA的RT-PCR鑒定

Fig.3 RT-PCR identification of F1L and B2L

3 討 論

Orf具高度接觸性、傳染性、誘導(dǎo)繼發(fā)感染，且人獸共患[7-8]，同時(shí)OrfV能在結(jié)痂部位或環(huán)境中長(zhǎng)期存在，重復(fù)感染同一宿主，還引起繼發(fā)感染，造成該病的防治較為困難。羊口瘡病的臨床治療采用保守療法，國(guó)內(nèi)通常是對(duì)患部進(jìn)行清洗，擦涂5%碘酊、高錳酸鉀，也可灌服解毒消瘡飲[9]，或使用抗生素控制繼發(fā)感染。國(guó)外有報(bào)道一些抗病毒藥物用于羊口瘡的治療，其中西多福韋常用于多種痘病毒的治療，包含西多福韋/硫酸鋁的一種膠體噴霧治療羔羊口瘡效果較好[10-11]。疫苗接種為防控羊口瘡的有效途徑，國(guó)外研究常用D1701株弱毒活疫苗，國(guó)內(nèi)也有各地方株活疫苗或滅活疫苗研究。郭良興[12]、田婷婷[13]等制備的OrfV滅活疫苗，具較好的免疫保護(hù)力。但常規(guī)疫苗免疫后可能會(huì)出現(xiàn)抗體持續(xù)時(shí)間短、抗體水平低、毒力返強(qiáng)等現(xiàn)象發(fā)生，同時(shí)國(guó)內(nèi)較難買(mǎi)到市售羊口瘡疫苗，所以研究羊口瘡新型疫苗具有重要意義。

(A) Cells transfected by pVAX1-F1L, green fluorescence was observed; (A-1) Isotype Control of pVAX1-F1L group, no specific green fluorescence; (B) Cells transfected by pVAX1-B2L, green fluorescence was observed; (B-1) Isotype Control of pVAX1-B2L group, no specific green fluorescence; (C)The normal MDBK cells, no specific green fluorescence; (D) Cells transfected by non-carrier of pVAX1 vector, no specific green fluorescence.

圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后IFA檢測(cè)結(jié)果(400×)

Fig.4 Detection of transient expression products from recombinant plasmids in MDBK cells by IFA(400×)

新型疫苗研究中，核酸疫苗的研究較為廣泛。核酸疫苗的本質(zhì)是含有某種抗原基因的重組真核表達(dá)載體[14]，重組表達(dá)載體依靠載體本身特有的病毒啟動(dòng)子和宿主的表達(dá)系統(tǒng)，從而使外源基因在細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。用于構(gòu)建核酸疫苗的真核表達(dá)載體有多種，如pHMG、pJA、pJW、pCMV、pCDNA3.1(+)、pVAX1等，帶有CMV啟動(dòng)子的載體調(diào)節(jié)功能，它帶有細(xì)菌復(fù)制子(Oric)，能在大腸桿菌中高效復(fù)制。其中，pVAX1載體是用于核酸疫苗的研究中較多的載體之一，是美國(guó)FDA認(rèn)可的可用于人的核酸疫苗研究的載體，其特征是攜帶強(qiáng)啟動(dòng)子pCMV和BGH ploy A信號(hào)，允許在大腸桿菌中進(jìn)行高拷貝復(fù)制和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平瞬時(shí)表達(dá)的蛋白，已在多種傳染病或寄生蟲(chóng)的疫苗研究中應(yīng)用。pVAX1載體是在pcDNA3.1載體的基礎(chǔ)上改造而成，該載體使用卡那霉素抗性基因替代pcDNA3.1載體的氨芐抗性基因，減少和人類(lèi)基因重組的可能[15]。由于pVAX1載體是一種非融合載體，要求插入序列中5′端含一個(gè)Kozak序列、起始密碼子ATG和終止密碼子TGA/TAG/TAA，以增強(qiáng)目的基因表達(dá)效率[16]。杜宇[17]等的研究已證實(shí)以pVAX1載體構(gòu)建的核酸疫苗不會(huì)引起小鼠機(jī)體產(chǎn)生自身免疫性疾病的抗DNA抗體，不會(huì)導(dǎo)致自身免疫疾病，從而證實(shí)了pVAX1載體的安全性。本研究采用pVAX1真核表達(dá)載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L和pVAX1-F1L，同時(shí)B2L和F1L基因序列本身自帶起始密碼子和終止密碼子，引物設(shè)計(jì)時(shí)5′端采用Kozak序列為ACCACC，以利于B2L和F1L基因的表達(dá)。此外，由于pVAX1載體在pCDNA3.1載體基礎(chǔ)上去掉多余的序列，故在細(xì)胞中只能瞬時(shí)表達(dá)不能篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系[6]。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建OrfV 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-F1L和pVAX1-B2L，從mRNA水平上檢測(cè)到重組質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L能在MDBK細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，IFA結(jié)果也從蛋白水平證實(shí)了二者的表達(dá)，本試驗(yàn)研究結(jié)果為羊口瘡病毒基因核酸疫苗及雙基因核酸疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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Construction and expression of recombinant plasmids of OrfV F1L and B2L genes in MDBK cells

LIU Ai1,2,FENG Jiang1,2,XIAN Si-mei1, 2,LIU Zong-sheng3,LI Peng-fei1,2,LUO Dai-bing1, 2

(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandVeterinaryPublicHealthofGuizhouProvince,Guiyang550025,China; 3.InstituteofSupervisionandInspectionforAnimalProductsQualityandSafety,Bijie551700,China)

In this study, we constructed eukaryotic recombinant expression plasmids of F1L and B2L genes of Orf Virus, and identified their expression in MDBK cells. The recombinant plasmids pVAX1-B2L and pVAX1-F1L were constructed based on the pMD18-T-F1L and pMD18-T-B2L which were constructed before. Then, they were identified by digestion with restriction enzymes and sequencing. The MDBK cells were transfected with pVAX1-B2L and pVAX1-F1L plasmids coated by liposome, and the RT-PCR and indirect immunofluoresence assay (IFA) were adopted to detect the expressions of pVAX1-B2L and pVAX1-F1L. Results indicated that the recombinant plasmids pVAX1-B2L and pVAX1-F1L were constructed and confirmed successfully by sequencing and digestion, and their instantaneous expressions were verified in the cytoplasm of MDBK cells by RT-PCR and IFA. The eukaryotic recombinant expression plasmids constructed in this study would lay the foundation for the further study on nucleic acid vaccine of OrfV.

Orf viurs; F1L gene; B2L gene; eukaryotic recombinant expression

Xian Si-mei, Email: xiansimei2005@163.com.

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.008

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目[黔科合LH字(2014)7667]，貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)(黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2015]4016)和畢節(jié)市科技局項(xiàng)目[畢科合字(2012)24號(hào)]。

鮮思美,Email:xiansimei2005@163.com.

1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025； 3.畢節(jié)市動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)所，畢節(jié) 551700

S852.65

A

1002-2694(2015)12-1124-05

2015-07-17；

2015-10-16

Supported by grants from the Science and Technology Department of Guizhou Province [Qiankehe LH (2014)7667], the Science and Technology Innovation Talents Team of Animal Disease Prevention and Control, and the Veterinary Public Health Security of Guizhou Province [Qiankehe talents team (2015)4016],and the Science and Technology Department of Bijie[Bikehe (2012)24].