汪鵬程，熊小路，焦 俊，龔文平，楊小梅，溫博海

貝氏柯克斯體5種重組表面蛋白抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特異性和敏感性分析

汪鵬程1,2，熊小路1，焦 俊1，龔文平1，楊小梅1，溫博海1

目的 使用貝氏柯克斯體5種重組表面蛋白作為包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于血清學(xué)檢測的特異性和敏感性分析。方法 本研究建立由貝氏柯克斯體的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組表面蛋白抗原分別包被的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，然后分別檢測貝氏柯克斯體實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清和Q熱患者血清中IgG特異性抗體。結(jié)果 8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清中除1份血清與RplL反應(yīng)為陰性外其它均為陽性；11份Q熱患者血清中除1份血清與RplL、1份血清與OmpH反應(yīng)為陰性外，其它血清反應(yīng)均為陽性。將這5種重組蛋白分別與莫氏立克次體、黑龍江立克次體、恙蟲病東方體實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清反應(yīng)，除1份黑龍江立克次體感染小鼠血清與GroEL反應(yīng)為陽性外，其它血清反應(yīng)均為陰性。另外，Com1對斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱、恙蟲病患者血清的陽性反應(yīng)率平均為22.2%，GroEL為25.0%，Mip為25.0%，OmpH為25.0%，RplL為13.9%。結(jié)論 這些結(jié)果證明這5種重組蛋白抗原均可被貝氏柯克斯體感染血清所識(shí)別。所建立的ELISA方法具有良好特異性和敏感性，可用作Q熱血清學(xué)診斷。

貝氏柯克斯體；Q熱； 表面蛋白；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31170161) and the National Science and Technology Major Project of China (No. 2013ZX10004803). Corresponding authors: Xiong Xiao-lu, Email:xiongxlu624@sohu.com; Wen Bo-hai, Email:bohaiwen@sohu.com

Q熱(Q fever)是由貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)引起的一種重要的人獸共患病，為全球性廣泛分布[1]。人群Q熱暴發(fā)流行常常源于羊群的貝氏柯克斯體暴發(fā)感染，因此“Q熱”又俗稱“羊流感”。貝氏柯克斯體易感染家畜，主要是羊、牛，導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失；而貝氏柯克斯體感染的家畜又是人Q熱的主要傳染源，可引起人群Q熱的暴發(fā)和流行。2007年荷蘭大范圍暴發(fā)由貝氏柯克斯體感染羊所致的“羊流感”，造成數(shù)千人感染和多人死亡,引起了國際社會(huì)強(qiáng)烈關(guān)注[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示Q熱疫區(qū)遍布世界各國，在我國的分布十分廣泛,目前至少有20多個(gè)省市自治區(qū)報(bào)道過Q熱病例,其中四川、云南、內(nèi)蒙、新疆和西藏等地還發(fā)生過Q熱的流行[3]。Q熱早期主要表現(xiàn)為發(fā)熱、疲乏等，無特異性的臨床癥狀，容易誤診為一般的流感。因此，早期確診對于Q熱患者的有效治療與Q熱流行的控制十分重要。

人Q熱診斷主要依賴血清學(xué)診斷，常用方法為間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。由于貝氏柯克斯體為感染性很強(qiáng)的呼吸道傳播病原菌，需要在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，因此難以在普通實(shí)驗(yàn)室制備大量IFA抗原片供Q熱血清學(xué)診斷，另外由于IFA操作較為復(fù)雜、難以標(biāo)準(zhǔn)化等限制IFA血清學(xué)診斷Q熱在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。目前，國際上已采用貝氏柯克斯體抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)代替IFA作為Q熱實(shí)驗(yàn)室診斷的方法。

本實(shí)驗(yàn)室采用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)[4]和表面蛋白質(zhì)組學(xué)[5]等方法，鑒定出Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL等為貝氏柯克斯體主要菌體表面蛋白，并證明其為主要血清免疫源性蛋白，可以作為Q熱血清學(xué)診斷候選抗原，因此，本實(shí)驗(yàn)室已克隆表達(dá)5種主要表面蛋白抗原，制備Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組蛋白。本研究用這5種重組蛋白作為抗原建立ELISA方法,檢測貝氏柯克斯體實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清以及Q熱患者血清對重組蛋白的反應(yīng)性，并同時(shí)檢測其它立克次體感染小鼠血清和患者血清，以初步評(píng)價(jià)這5種重組蛋白為抗原的ELISA的特異性和敏感性，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Ni-NTA純化試劑盒為德國QIAGEN產(chǎn)品；低分子量蛋白Marker等為中科瑞泰(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品；FITC、HRP標(biāo)記羊抗小鼠/人IgG為北京博奧森公司產(chǎn)品；96孔ELISA板購自美國康寧公司。ELISA包被液、封閉液、TMB反應(yīng)底物、終止液均購自eBioscience公司。貝氏柯克斯體、黑龍江立克次體、莫氏立克次體、恙蟲病東方體等IFA抗原片為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 立克次體菌株與實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清 貝氏柯克斯體(新橋株)、莫氏立克次體(Wilmington株)、黑龍江立克次體(054株)、恙蟲病東方體(Karp株)為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所立克次體學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。用以上立克次體分別腹腔接種6周齡BALB/c小鼠，感染4周后取血，分離血清-20 ℃凍存?zhèn)溆?。血清用相?yīng)的立克次體抗原片間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示效價(jià)≥1∶200。

1.3 立克次體患者血清 Q熱、斑點(diǎn)熱、斑疹傷寒、恙蟲病患者血清分別由安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院柳燕教授、廣州市第八人民醫(yī)院、江蘇省疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)。以上患者血清用相應(yīng)的立克次體抗原片按常規(guī)方法使用間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示效價(jià)均≥1∶100。

1.4 貝氏柯克斯體重組蛋白制備 將本室制備的表達(dá)貝氏柯克斯體Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL的大腸埃希氏菌[4]分別接種含氨芐青霉素100 μg/mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2 h后加入終濃度為240 μg/mL的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，然后對誘導(dǎo)表達(dá)菌做聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以鑒定其是否能夠表達(dá)目的蛋白。將鑒定后的大腸埃希氏菌接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，并用IPTG誘導(dǎo)大腸埃希氏菌表達(dá)目的蛋白，然后用Qiagen公司的Ni-NTA試劑盒從大腸埃希氏菌中親和層析純化目的蛋白。

1.5 重組蛋白與立克次體感染小鼠血清或患者血清做ELISA分析 用ELISA包被液稀釋貝氏柯克斯體重組蛋白至3 μg/mL，再將其分別加到ELISA板(每孔100 μL)4 ℃包被過夜。包被結(jié)束后棄上清，加入PBST(含0.05%Tween的PBS)進(jìn)行洗滌(每孔加入200 μL，搖振5 min)，拍干后每孔加入200 μL封閉液4 ℃過夜，PBST洗滌3次后待用。用大腸埃希氏菌裂解液(5 mg/mL)中和每份待檢血清，然后用封閉液對其作1∶200稀釋。將每份稀釋血清加入到相應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次后每孔加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠或人IgG抗體(每孔100 μL)，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次后每孔加入100 μL TMB底物，10 min后加入100 μL終止液，立即于酶標(biāo)儀上測定每孔OD450值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組血清與單個(gè)蛋白反應(yīng)OD450值差異采用單因素K平方差分析及Student-Newman-Keuls分析，P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SAS 9.1軟件完成。統(tǒng)計(jì)正常血清與每個(gè)蛋白反應(yīng)OD450值，以正常小鼠血清或正常人血清與單個(gè)蛋白反應(yīng)OD450平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為cut-off值來判斷感染血清與該蛋白反應(yīng)陽性及陰性結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 貝氏柯克斯體重組蛋白的純化 將表達(dá)貝氏柯克斯體Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL的大腸埃希氏菌分別接種含有氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基并使用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)；采用Ni-NTA對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE分析確認(rèn)表達(dá)的重組蛋白分子量與預(yù)期大小一致(圖1)。

圖1 SDS-PAGE分析貝氏柯克斯體5種重組蛋白在大腸埃希氏菌表達(dá)

Fig.1 Expression of 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiiinE.colicells analyzed by SDS-PAGE

2.2 ELISA分析貝氏柯克斯體重組蛋白與感染小鼠血清反應(yīng) 將貝氏柯克斯體、莫氏立克次體、黑龍江立克次體、恙蟲病東方體感染小鼠血清以及正常小鼠血清各8份與5種貝氏柯克斯體蛋白進(jìn)行ELISA反應(yīng)，結(jié)果顯示5種貝氏柯克斯體重組蛋白中除RplL與1份貝氏柯克斯體感染小鼠血清反應(yīng)為陰性外，其它蛋白與8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清反應(yīng)均為陽性，每種蛋白與8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清反應(yīng)的OD值均顯著高于與其它立克次體感染小鼠血清反應(yīng)的OD值(Com1:F=36.509,P<0.001; GroEL:F=67.436,P<0.001; Mip:F=631.337，P<0.001; OmpH:F=17.636,P<0.001; RplL:F=17.733,P<0.001)。其它立克次體感染小鼠血清與這5種貝氏柯克斯體蛋白反應(yīng)，除GroEL與1份黑龍江立克次體感染血清反應(yīng)為陽性外，其余均為陰性，見表1和圖2。

2.3 ELISA分析貝氏柯克斯體重組蛋白與患者血清反應(yīng) 將11份Q熱、13份斑點(diǎn)熱、12份恙蟲病、11份斑疹傷寒患者血清、17份正常人血清與5種貝氏柯克斯體蛋白進(jìn)行ELISA反應(yīng)，結(jié)果顯示5種貝氏柯克斯體重組蛋白至少與11份Q熱患者血清反應(yīng)陽性，每一種蛋白與Q熱患者血清的平均OD值均顯著高于與其它立克次體病患者血清的反應(yīng)值(Com1:F=44.902,P<0.001; GroEL:F=26.263,P<0.001; Mip:F=30.445,P<0.001; OmpH:F=23.455，P<0.001; RplL:F=23.704,P<0.001)。其它立克次體感染患者血清與這5種貝氏柯克斯體蛋白的反應(yīng)陽性數(shù)為0或1～4份，見表2，圖3。

表1 立克次體感染小鼠血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應(yīng)OD450值及陽性數(shù)

Tab.1 Reaction intensities and positive rates of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

重組蛋白R(shí)ecombinantprotein小鼠血清Serafrommiceinfectedwithdifferentrickettsiae貝氏柯克斯體莫氏立克次體黑龍江立克次體恙蟲病東方體正常血清CoxiellaburnetiiRickettsiamooseriRickettsiaheilongjiangensisOrientiatsutsugamshiNormalseraCom10.885±0.319(8/8,100%)0.209±0.021(0/8,0%)0.204±0.021(0/8,0%)0.207±0.021(0/8,0%)0.162±0.036(0/8,0%)GroEL1.324±0.386(8/8,100%)0.191±0.020(0/8,0%)0.209±0.055(1/8,12.5%)0.189±0.027(0/8,0%)0.145±0.032(0/8,0%)Mip1.126±0.110(8/8,100%)0.191±0.017(0/8,0%)0.184±0.019(0/8,0%)0.177±0.026(0/8,0%)0.180±0.033(0/8,0%)OmpH0.881±0.483(8/8,100%)0.170±0.011(0/8,0%)0.161±0.015(0/8,0%)0.155±0.010(0/8,0%)0.163±0.032(0/8,0%)RplL0.657±0.334(7/8,87.5%)0.168±0.011(0/8,0%)0.164±0.011(0/8,0%)0.146±0.011(0/8,0%)0.140±0.046(0/8,0%)

3 討 論

貝氏柯克斯體主要血清反應(yīng)蛋白Com1是最早鑒定的貝氏柯克斯體外膜蛋白[6]，GroEL是一種熱休克蛋白 (HspB)[7]，Mip是一種與毒力相關(guān)、存在菌體表面的肽基脯氨酸異構(gòu)酶[8]，OmpH 是一種促進(jìn)菌體內(nèi)蛋白向菌體外釋放的外膜伴侶蛋白[9]，RplL則是一種細(xì)菌核糖體蛋白(L12)。這些蛋白均可存在菌體表面，當(dāng)貝氏柯克斯體感染時(shí)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體。因此，本研究使用Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組蛋白分別作為包被抗原進(jìn)行ELISA，檢測貝氏柯克斯體感染血清以及其他幾種主要立克次體感染血清中抗體，分析這5種貝氏柯克斯體蛋白抗原在Q熱血清學(xué)診斷中的特異性和敏感性。

圖2 立克次體感染小鼠血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應(yīng)強(qiáng)度散點(diǎn)圖

Fig.2 Reaction intensities of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

表2 立克次體感染患者血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應(yīng)OD450值及陽性率

Tab.2 Reaction intensities and positive rates of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

重組蛋白R(shí)ecombinantprotein患者血清e(cuò)rafrompatientssufferedfromdifferentrickettsialdiseasesQ熱斑疹傷寒斑點(diǎn)熱恙蟲病正常血清QfeverEndemictyphusSpottedfeverTsutsugamushiNormalseraCom10.901±0.241(11/11,100%)0.311±0.116(2/11,18.2%)0.327±0.142(3/13,23.1%)0.327±0.142(3/12,25%)0.186±0.058(0/17,0%)GroEL0.882±0.388(11/11,100%)0.310±0.081(3/11,27.3%)0.332±0.139(4/13,30.8%)0.295±0.118(2/12,16.7%)0.178±0.074(0/17,0%)Mip0.798±0.257(11/11,100%)0.329±0.093(2/11,18.2%)0.346±0.164(4/13,30.8%)0.346±0.102(3/12,25%)0.186±0.071(0/17,0%)OmpH0.739±0.280(10/11,90.9%)0.349±0.115(3/11,27.3%)0.343±0.160(4/13,30.8%)0.284±0.080(2/12,16.7%)0.183±0.069(0/17,0%)RplL0.544±0.156(10/11,90.9%)0.290±0.106(3/11,27.3%)0.292±0.117(2/13,15.4%)0.235±0.067(0/12,0%)0.163±0.065(0/17,0%)

檢測結(jié)果顯示8份貝氏柯克斯體感染小鼠血清中除1份血清與RplL蛋白反應(yīng)為陰性外其它均為陽性；11份Q熱患者血清中除1份血清與RplL蛋白、1份血清與OmpH蛋白反應(yīng)為陰性外，其它血清反應(yīng)均為陽性。該結(jié)果證明這些蛋白做ELISA診斷抗原檢測Q熱特異性IgG抗體有很好的敏感性。將這5個(gè)重組蛋白與莫氏立克次體(地方性斑疹傷寒病原體)、黑龍江立克次體(遠(yuǎn)東斑點(diǎn)熱病原體)、恙蟲病東方體(恙蟲病病原體)感染小鼠血清反應(yīng)，除1份黑龍江立克次體感染小鼠血清與GroEL反應(yīng)為陽性外，其它血清反應(yīng)均為陰性，證明這5種重組蛋白抗原均可被貝氏柯克斯體感染血清所識(shí)別。所建立的ELISA方法具有良好特異性和敏感性，可用作Q熱血清學(xué)診斷。為進(jìn)一步分析這5種重組蛋白在Q熱血清學(xué)診斷中的特異性，將這5種重組蛋白分別作為抗原進(jìn)行ELISA，檢測11份斑疹傷寒患者血清、13份斑點(diǎn)熱患者血清、12份恙蟲病患者血清。結(jié)果顯示Com1對這3種立克次體感染患者血清的陽性反應(yīng)率平均為22.2%，GroEL為25.0%，Mip為25.0%，OmpH為25.0%，RplL為13.9%。提示熱休克蛋白GroEL、肽基脯氨酸異構(gòu)酶Mip、外膜蛋白OmpH為細(xì)菌的保守蛋白，其血清學(xué)交叉反應(yīng)較明顯。由于本研究所收集的患者血清絕大多數(shù)來自農(nóng)村地區(qū)，Q熱為農(nóng)村常見病，因此這些貝氏柯克斯體IgG抗體陽性的斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱、恙蟲病患者可能曾經(jīng)患過Q熱。因此，可使用這5種貝氏柯克斯體蛋白抗原進(jìn)行ELISA，檢查患者血清中的特異性IgM抗體可以排除這種血清交叉反應(yīng)，提高ELISA血清學(xué)診斷的特異性。

圖3 立克次體感染患者血清與貝氏柯克斯體重組蛋白的ELISA反應(yīng)強(qiáng)度散點(diǎn)圖

Fig.3 Reaction intensities of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA using 5 recombinant proteins ofCoxiellaburnetiias antigen

本研究首次將貝氏柯克斯體Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重組蛋白分別作為ELISA包被抗原，檢測貝氏柯克斯體、莫氏立克次體、黑龍江立克次體、恙蟲病東方體實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清和臨床患者血清，檢測結(jié)果證明它們均有識(shí)別貝氏柯克斯體感染血清的良好特異性和敏感性。Q熱為我國農(nóng)村地區(qū)常見傳染病，使用這5種貝氏柯克斯體重組蛋白抗原建立的ELISA將為我國Q熱血清學(xué)診斷提供新的有效方法。

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Specificity and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay with five recombinant surface protein antigens ofCoxiellaburnetii

WANG Peng-cheng1,2,XIONG Xiao-lu1,JIAO Jun1,GONG Wen-ping1,YANG Xiao-mei1,WEN Bo-hai1

(1.StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,the105thHospitalofPLA,Hefei230031,China)

In order to evaluate the usefulness of recombinant proteins ofCoxiellaburnettias serodiagnostic markers for Q fever, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coated with each of five recombinant surface protein antigens (Com1, GroEL, Mip, OmpH, or RplL) ofCoxiellaburnetiiwas assessed for specificity and sensitivity in detection of specific IgG antibodies in sera from mice experimentally infected withC.burnetiiand patients suffered from Q fever. As a result, all of 8 sera fromC.burnetii-infected mice positively reacted with the five recombinant proteins, except for one serum which negatively reacted with RplL, while all of 8 sera from mice infected withRickettsiamooseri,Rickettsiaheilongjiangensis, orOrientiatsutsugamshinegatively reacted with the five proteins, except for one serum which positively reacted with GroEL. In addition, the average positive ratio of 11 sera from patients with endemic typhus, 13 sera from patients with spotted fever, and 12 sera from patients with tsutsugamushi disease were 22.2% for reaction to Com1, 25.0% for GroEL, 25.0% for Mip, 25.0% for OmpH, and 13.9% for RplL, respectively. Results suggest that the ELISA with Com1, GroEL, Mip, OmpH, or RplL has high specificity and sensitivity for serological diagnosis of Q fever.

Coxiellaburnetii; Q fever; surface protein; enzyme-linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.005

國家自然科學(xué)基金(No.31170161)和國家科技重大項(xiàng)目(No.2013ZX10004803)聯(lián)合資助

熊小路，Email: xiongxlu624@sohu.com; 溫博海，Email: bohaiwen@sohu.com

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071;

2.中國人民解放軍第105醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230031

R446.5

A

1002-2694(2015)12-1111-05

2015-03-09；

2015-06-11