周愛(ài)萍，賀擁軍，孫亞楠，張?jiān)鲑t

西安市非結(jié)核分枝桿菌感染現(xiàn)狀調(diào)查分析

周愛(ài)萍1，賀擁軍1，孫亞楠1，張?jiān)鲑t2

目的 了解西安市結(jié)核病患者中非結(jié)核分枝桿菌感染情況。方法 收集西安市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科分離培養(yǎng)的分枝桿菌臨床菌株，利用兩步PCR方法及PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，收集的202株分枝桿菌中有195株為結(jié)核分枝桿菌，3株為牛結(jié)核分枝桿菌，2份為鳥(niǎo)分枝桿菌，1份為堪薩斯分枝桿菌，1份為灰色鏈霉菌，非結(jié)核分枝桿菌感染率為1.5%(3/201)。結(jié)論 西安市尚存在一定比例非結(jié)核分枝桿菌感染，進(jìn)一步菌種鑒定有利于臨床正確診斷和合理用藥治療。

結(jié)核分枝桿菌；非結(jié)核分枝桿菌；菌種鑒定

結(jié)核病發(fā)病率目前在全球范圍內(nèi)一直居高不下，2014年WHO發(fā)布的全球結(jié)核病報(bào)告中，中國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，居世界第2位。結(jié)核病主要是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)感染引起的，而非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculousmycobacteria，NTM)感染人體后引起的NTM肺病與結(jié)核病的臨床表現(xiàn)較難區(qū)別。近年來(lái)非結(jié)核分枝桿菌疫情呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。由于MTBC與NTM對(duì)不同抗菌藥物敏感性不同，其治療方案存在很大差別，故二者的鑒別具有重要的臨床意義[1]。

本研究利用兩步法PCR技術(shù)和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法對(duì)來(lái)自西安市結(jié)核病院的202株臨床分離培養(yǎng)的分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定，以了解西安市結(jié)核病人中非結(jié)核分枝桿菌的感染比例，為結(jié)核病的臨床治療及預(yù)防控制工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集西安市結(jié)核病醫(yī)院2007年10月至2008年12月間通過(guò)BACTAC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的菌株202株。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、卡介苗(BCG)及不動(dòng)桿菌基因組DNA為本實(shí)驗(yàn)室保存。2×Taq PCR MasterMix、Taq酶、50 bp ladder DNA Mark購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；三磷酸脫氧核苷(dNTP)購(gòu)于Sigma公司；100 bp DNA ladder Plus購(gòu)于MBI Fermentas 公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于Omega公司；引物合成于上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 分枝桿菌基因組DNA的提取 參考沈國(guó)妙等的方法[2]，用水煮法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA。PCR擴(kuò)增時(shí)一般取1 μL作為模板。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[3]合成結(jié)核分枝桿菌菌種特異性引物(MISP1/MISP2)，引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。以BCG基因組DNA為陰性對(duì)照，H37Rv基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 45 s→64 ℃ 45 s→72 ℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。并取5份PCR陽(yáng)性產(chǎn)物，送上海美季生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[4]合成結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性引物(MTC-F/MTC-R)，引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。H37Rv基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 45 s→68 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 分枝桿菌菌種鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[5]合成分枝桿菌菌種鑒定引物(Hsp65-F/Hsp65-R)，擴(kuò)增hsp65基因高變區(qū)，引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。以H37Rv基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，不動(dòng)桿菌基因組DNA為陰性對(duì)照，同時(shí)選2份經(jīng)結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定為陽(yáng)性的菌株擴(kuò)增。PCR條件為：95 ℃ 5 min；然后95 ℃ 45 s→62 ℃ 45 s→72 ℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送上海美季生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行比對(duì)。

表1 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定用引物

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定 用結(jié)核分枝桿菌菌種特異性引物對(duì)202份臨床菌株DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。部分樣品的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。Marker為Fermentas 公司100 bp核酸ladder?？梢?jiàn)陽(yáng)性對(duì)照H37Rv在172 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照BCG無(wú)擴(kuò)增條帶。經(jīng)鑒定202份樣本中有195份樣本為結(jié)核分枝桿菌，另7份不是結(jié)核分枝桿菌。隨機(jī)選取5份樣本PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得的基因序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站所提供的Blast比對(duì)功能進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果均為結(jié)核分枝桿菌。

圖1 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定的結(jié)果

2.2 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定 對(duì)7份上述PCR擴(kuò)增陰性的樣本，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性引物PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。陽(yáng)性對(duì)照H37Rv在245 bp處出現(xiàn)特異性條帶， 3株菌(159、96和112)有相應(yīng)大小產(chǎn)物生成，為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株，4株沒(méi)有擴(kuò)增條帶。

圖2 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定結(jié)果

2. 3 分枝桿菌菌種鑒定 對(duì)7份已鑒定不是結(jié)核分枝桿菌的菌株，擴(kuò)增hsp65基因高變區(qū)并直接測(cè)序。序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast，結(jié)果有3株牛結(jié)核分枝桿菌，2株鳥(niǎo)分枝桿菌，1株堪薩斯分枝桿菌、1株灰色鏈霉菌。

3 討 論

NTM是指分枝桿菌屬中除了MTBC(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM作為一種環(huán)境微生物通常對(duì)人類(lèi)沒(méi)有致病作用。但20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著艾滋病感染者人數(shù)的增多，播放型NTM[6-7]感染報(bào)道不斷增加。中國(guó)NTM感染也呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)。1990年有報(bào)道我國(guó)NTM感染率為15.4%，2000年全國(guó)第4次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查表明，NTM占分離菌株的11.1%[8]，2010年全國(guó)第5次結(jié)核病學(xué)調(diào)查，以傳統(tǒng)生化方法(對(duì)硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)生長(zhǎng)試驗(yàn)法)在363株分離培養(yǎng)菌株中鑒定到83株NTM(22.9%)[9]。上海市肺科醫(yī)院報(bào)道，1998-2004年上海市NTM感染率也呈現(xiàn)出逐年上升趨勢(shì)[10]。由于NTM病的臨床癥狀與結(jié)核病十分相似，而大多NTM對(duì)抗結(jié)核藥物具有一定的耐受性，因此分枝桿菌菌種的鑒定對(duì)臨床針對(duì)性用藥而言，顯得十分重要。

傳統(tǒng)的分枝桿菌鑒定方法主要是PNB、TCH改良羅氏培養(yǎng)法，對(duì)NTM鑒定的準(zhǔn)確率低[11]。核酸擴(kuò)增的方法能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)分枝桿菌進(jìn)行鑒定，因此得到了廣泛的應(yīng)用。本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]首先擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌rv1508c基因中MTB種特異性序列，發(fā)現(xiàn)202株臨床分離株中有7株不是結(jié)核分枝桿菌，而后擴(kuò)增IS6110中MTBC特異性序列發(fā)現(xiàn)7株菌中有3株擴(kuò)增陽(yáng)性，4株為陰性。為進(jìn)一步確認(rèn)PCR鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)編碼分枝桿菌主要免疫反應(yīng)蛋白之一的hsp65基因特定核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7份樣本中有3株牛結(jié)核分枝桿菌、2株鳥(niǎo)分枝桿菌、1株堪薩斯分枝桿菌、1株灰色鏈霉菌。灰色鏈霉菌是鏈霉素的產(chǎn)生菌，為土壤習(xí)居菌，是機(jī)會(huì)致病菌。在長(zhǎng)期使用廣譜抗生素及機(jī)體免疫力低下的患者中能夠引起膿腫及敗血癥等。在本研究中考慮到患者的主要臨床表現(xiàn)及灰色鏈霉菌致病性及耐藥性，我們認(rèn)為可能是分枝桿菌在進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)的污染菌株。因此，西安市201株臨床分離分枝桿菌中，198株為MTBC(包括195株結(jié)核分枝桿菌和3株牛分枝桿菌)，另有3株為NTM，其感染率為1.5%(3/201)。該結(jié)果與上海市肺科醫(yī)院報(bào)道的上海市NTM感染率(平均2.29%)及2012年新英格蘭雜志上報(bào)道的中國(guó)NTM感染率(3.4%)[12]有一定可比性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2010年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果(22.9%)。

西安市結(jié)核病患者中存在一定比例的NTM感染，并且NTM大多對(duì)抗結(jié)核藥物有相當(dāng)?shù)哪褪苄?，因此?duì)于臨床難治的病例應(yīng)該進(jìn)行必要的菌種鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，為臨床用藥提供參考。

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Epidemiology of nontuberculous mycobacteria in Xi’an, China

ZHOU Ai-ping1,HE Yong-jun1,SUN Ya-nan1,ZHANG Zeng-xian2

(1.SchoolofMedicine,TibetUniversityforNationalities,Xianyang712082, China; 2.ClinicalLaboratory,Xi'anChestHospital,Xi'an710061, China)

Nontuberculous mycobacteria (NTM) are all the other mycobacteria which do not cause tuberculosis or leprosy. Recently, NTM disease presents a rising tendency in the world. The most common clinical manifestation of NTM disease is lung disease. The clinical symptoms of pulmonary NTM disease are similar to pulmonary TB but most of the NTM are resistant to anti-TB drugs. In order to examine the prevalence of NTM in Xi'an, two-step PCR and PCR-sequencing were used to identify the NTM strains from all the mycobacterial clinical isolates in this study. Of all the 202 clinical isolates, 195 wereM.tuberculosis, 3 wereM.bovis, 2 wereM.avium, 1 wasM.kansasii, 1 wasStreptomycesgriseus, and the prevalence rate was 1.5% (3/201). Our research showed that there was a certain proportion of NTM disease in Xi'an. The result indicates that strain identification is necessary for clinical resistant cases and can provide reference for clinical treatment.

Mycobacteriumtuberculosis; nontuberculosis; species identification

Zhou Ai-ping, Email: abby_aiping@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.023

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31200109)；西藏民族學(xué)院校內(nèi)項(xiàng)目青年學(xué)人培育計(jì)劃(No. 15MYQP06)和西藏自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. Z2012A33G20100)聯(lián)合資助

周愛(ài)萍，Email：abby_aiping@126.com

1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸陽(yáng) 712082； 2. 西安市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710061

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1196-04

2015-05-18；

2015-09-14

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31200109), the Young Scholars Training Program of Tibet University for Nationalities (No. 15MYQP06), and the Science and Technology Planning Project of Tibet Autonomous Region (No. Z2012A33G20100)