王麗新

（寧夏醫(yī)科大學(xué)高等衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，寧夏 銀川 750004）

近年來由于環(huán)境污染的日益加劇，平流層臭氧消耗的增加，到達地球表面的紫外線（UV）增多，已成為影響人類健康最重要的環(huán)境因素之一。許多皮膚疾病的發(fā)生與UV損傷有著密切關(guān)系，如光老化、多形性日光疹、紅斑狼瘡、皮膚腫瘤等。

IL-10是紫外線引起光損傷的重要細胞因子，UV照射后1L-10產(chǎn)生增多，主要來自于角質(zhì)形成細胞（KC）、黑素細胞和浸潤表皮的巨噬細胞，具有較強的抗炎及免疫抑制活性。我們制備不同的動物含藥血清作用于經(jīng)過紫外線照射后的HaCaT細胞，以檢測不同動物含藥血清對HaCaT細胞分泌IL-10的影響，從而探討其治療機制。

1 實驗材料

細胞：人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT細胞株，購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

實驗動物：SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量250～350g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

儀器設(shè)備：超凈工作臺、全波長酶標儀、紫外可見光分光光度計、紫外線光療儀、二氧化碳孵箱、超速低溫離心機、6孔培養(yǎng)板。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、無噬菌體胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、人IL-10ELISA檢測試劑盒、EDTA。

藥物：實驗所用藥物均購自銀川市中醫(yī)院藥劑科。甲氨蝶呤片（MTX）（上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，國藥準字H31020644）。光敏湯Ⅰ號藥用白茅根20g，生石膏20g，生地15g，丹皮15g，紫草9g，金銀花12g，連翹12g，大青葉15g，藿香10g，佩蘭10g，薏苡仁15g，滑石9g，車前子12g，竹葉6g，烏梅10g，防風(fēng)10g[1，2]。光敏湯Ⅱ號為在光敏湯Ⅰ號基礎(chǔ)上加黃芪12g，枸杞子12g，甘草9g。

2 實驗方法

中藥提取液的制備：由寧夏醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室加工完成。分別稱取光敏湯Ⅰ號中藥材1200g，光敏湯Ⅱ號中藥材1398g（為成人6天的劑量），加6倍的雙蒸水浸泡2h，密閉，中火煎煮1h，濾出藥液，藥渣再加雙蒸水4倍，煎煮0.5h，濾出藥液，合并2次藥液，取上清液，于60℃水浴分別濃縮至400mL（每毫升藥液分別含3g、3.5g生藥）。

動物血清藥配制：取30只SD大鼠隨機分為光敏湯Ⅰ號組、光敏湯Ⅱ號組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組、UVB陽性對照組及空白對照組，每組6只。2個中藥組分別給予相應(yīng)的中藥提取液灌胃（按照人和動物體表面積折算成人2倍的劑量），用量為16mL/（kg·d）；甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組以蒸餾水溶解液灌胃，用量為0.4mg（16mL）/（kg·d）；UVB陽性對照組及空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃。每日分2次灌飼，連續(xù)5天，在最后1次給藥2h后取腹主動脈采血（無菌操作），分離血清，56℃滅活30min后分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

細胞接種：將HaCaT細胞凍存管從冷凍箱中取出后立即置于37℃水浴中，輕輕晃動凍存管，解凍細胞。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有10mLMEM培養(yǎng)液的離心管中，用吸管吹打使細胞均勻懸浮。將離心管放入離心機中，20℃，1000轉(zhuǎn)/min，離心5min，棄上清液，加入MEM完全培養(yǎng)液，用吸管吹打均勻后進行細胞計數(shù)，并將細胞密度調(diào)整為5×105個/mL。再將細胞懸液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶3mL細胞懸液，將其置于37℃，5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞貼壁后進行實驗。準備8個6孔板（分別供6、12、24、48h檢測使用），取培養(yǎng)瓶內(nèi)亞融合狀態(tài)、對數(shù)期生長的HaCaT細胞，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化后制成單細胞懸液，使用細胞計數(shù)板計數(shù)后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，轉(zhuǎn)種至6孔細胞培養(yǎng)板，每孔3mL。

HaCaT細胞實驗分組：將接種至6孔板的細胞分為5組，光敏湯Ⅰ號組、光敏湯Ⅱ號組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組、UVB陽性對照組及空白對照組。待HaCaT細胞完全貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，實驗組分別加入相應(yīng)濃度的動物血清培養(yǎng)24h；空白對照組及UVB陽性對照組加入蒸餾水動物血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

紫外線照射：加藥培養(yǎng)24h后吸棄各孔培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，并用少量PBS覆蓋細胞，以30mJ/cm2劑量的UVB照射，照射距離15cm。照射時將空白對照組用無菌錫紙覆蓋，并將6孔板置于水浴中接受照射，以防產(chǎn)熱。照射完畢吸出PBS，空白對照組及UVB對照組每孔加入DMEM/F12培養(yǎng)液3mL，實驗組各孔加入相應(yīng)濃度的溶液3mL繼續(xù)培養(yǎng)。

收集細胞及培養(yǎng)上清液：6h、12h、24h、48h后，用Eppendof管收集細胞培養(yǎng)上清液， 每管收集500μL，-20℃保存。待所有標本收集完后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測上清液中IL-10的表達。

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析進行檢驗，對各組間的總的比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義的進一步用LSD法做兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

各組HaCaT細胞表達IL-10的水平比較見表1?？瞻讓φ战M12h、24h、48h、72h后，上清液中IL-10的濃度為35～39 pg/mL，UVB陽性對照組IL-10為48～71 pg/mL，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與UVB陽性對照組比較，藥物治療組在UVB照射后12h、24h、48h、72h，IL-10的分泌量都有所下降，在紫外線照射24h后，光敏湯Ⅰ、Ⅱ號組與UVB陽性對照組分泌的IL-10有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；UVB照射48h后，光敏湯Ⅰ、Ⅱ號組、甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組與UVB陽性對照組分泌的IL-10比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；UVB照射后72h，光敏湯Ⅰ、Ⅱ號組與UVB陽性對照組分泌的IL-10比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；光敏湯Ⅱ號組UVB照射后72h，與甲氨蝶呤（MTX）陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；光敏湯Ⅰ號組與甲氨蝶呤（MTX）組在各個時段分泌的IL-10含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組HaCaT細胞表達IL-10的水平比較 （pg/mL，±s）

表1 各組HaCaT細胞表達IL-10的水平比較 （pg/mL，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與UVB陽性對照組比較，#P＜0.05；與MTX陽性對照組比較，△P＜0.05。

組別 12h 24h 48h 72h光敏湯Ⅰ號組 45.74±10.61* 49.32±12.12*# 60.21±13.23*# 58.65±11.24*#光敏湯Ⅱ號組 43.85±12.34 47.47±9.15*# 58.46±7.37*# 47.87±13.33*#△MTX陽性對照組 45.56±8.36* 50.37±15.95* 61.96±12.84*# 60.97±8.65*UVB陽性對照組 48.86±11.33* 59.34±27.96* 78.35±10.31* 70.67±9.41*空白對照組 35.29±8.37 36.23±9.89 38.32±8.64 38.85±11.31

4 討 論

紫外線是傷害性光線的一種，是引起皮膚損傷的最常見因素，使皮膚松弛，粗糙，萎縮，皺紋加深加粗，色素沉著，毛細血管擴張，癌變等。光老化皮膚在組織學(xué)上的變化主要表現(xiàn)為表皮厚度因增生或重度萎縮明顯不均一，表皮與真皮連接變平，真皮炎性細胞浸潤較為多見，彈性纖維增粗、排列紊亂或聚集成團，微血管擴張并扭曲，周圍常有炎性細胞浸潤；黑素細胞灶性增生等[3]。角質(zhì)形成細胞（KC）位于皮膚的表皮層，是表皮的主要構(gòu)成細胞，也是中波段紫外線（UVB）作用的靶部位，參與固有免疫應(yīng)答及皮膚炎癥反應(yīng)。KC主要是通過釋放細胞因子而間接地影響機體的免疫功能，UV照射可使KC的IL-1、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10等基因表達及分泌增多， IL-15基因表達及分泌減少，導(dǎo)致皮膚免疫抑制[4，5，6]?，F(xiàn)代實驗研究證實，人永生化角質(zhì)形成細胞株（HaCaT細胞）經(jīng)UVB照射后，IL-10、TNF-α、IL-1β等細胞因子的分泌量明顯增加。

根據(jù)中醫(yī)辨證論治原則，筆者選取臨床常用的清熱除濕、涼血解毒藥物，組成光敏湯Ⅰ號。方中白茅根清熱解毒、利尿；生石膏清熱生津，止渴，生地、丹皮、紫草入血分，能清熱涼血，金銀花、連翹、大青葉清熱解毒，疏散風(fēng)熱，善治上焦之風(fēng)熱邪氣；藿香、佩蘭芳香化濕，內(nèi)能化濕，外能解表，薏苡仁健脾、利水滲濕，滲利中焦之濕熱邪氣；滑石、車前子利尿通淋，使?jié)駸嶂皬男”愣猓恢袢~清心利尿，除心煩，小便黃；烏梅酸能斂陰生津，防風(fēng)既能祛風(fēng)解表，又能祛風(fēng)濕，可去除皮膚肌表風(fēng)濕之邪氣。本方藥物配伍，使上中下三焦各有出路，氣血并治，內(nèi)外兼顧，祛邪與扶正兼顧。光敏湯Ⅱ號在光敏湯Ⅰ號基礎(chǔ)上加入黃芪、枸杞子、甘草。黃芪補氣，能夠增強機體對外界刺激的抵抗力，枸杞養(yǎng)肝滋陰，兩藥與清熱除濕、涼血藥配伍使用，既能祛邪，又不傷正。現(xiàn)代藥理實驗證實，枸杞子的有效成分枸杞多糖具有抗紫外線，提高免疫力的作用[7]；而黃芪總苷也被證實具有抗皮膚衰老，抗氧[8]；甘草補氣、調(diào)和諸藥，同時具有抗炎、類激素樣作用[9]，是治療日光性皮炎的常用藥物。

從光敏湯對HaCaT細胞分泌IL-10的影響角度闡釋光敏湯治療光敏性皮炎的機制，可為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。

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[2] 郝秀霞，徐偉.清熱利濕法治療多形性光敏疹[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2003，24（3）：8.

[3] 劉仲榮.皮膚光老化的診斷[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，2008，26（3）：138-140.

[4] Amerio P，Toto P，F(xiàn)elieiani C，et al.Rethinking the role Of tumour Necrosis factoralpha in ultraviolet（UV）B-induced immunosuppression：altered immune response in UV-irradiated TNFRIR2 genetargeted mutant mice[J].Br J Dermatol，2001，144（5）：952-957.

[5] 李海英.紫外線照射HaCaT細胞起源的細胞因子與Thl/Th2失衡的相關(guān)性研究[D].昆明醫(yī)學(xué)院，2005.

[6] Artukovic M，Ikic M，Kustelega J，et al.Influence of UV radiation on immunological system and occurrence of autoimmune disease[J].Coll Antropol，2010，34：175-178.

[7]李紅光. 枸杞多糖在UVB輻射人角質(zhì)形成細胞氧化損傷中的保護作用[D].山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[8]劉曉丹. 黃芪總苷有效成分和三七總皂苷有效成分配伍抗PC12細胞氧化損傷作用的研究[D].湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[9]陳東波，曾繁濤. 甘草黃酮對紫外線照射無毛小鼠皮膚的防護作用[J].宜春學(xué)院學(xué)報，2014，36（6）：17-19.