秦 偉 金 寰 羅孝美 陳遠壽

(遵義醫(yī)學院生理學教研室，貴州 遵義 563000)

硫化氫減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的機制

秦 偉 金 寰 羅孝美 陳遠壽

(遵義醫(yī)學院生理學教研室，貴州 遵義 563000)

目的 觀察硫化氫(H2S)對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀、體質(zhì)量、一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，探討H2S減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的機制。方法 將40只雄性SD大鼠隨機分為對照組、嗎啡依賴組、硫氫化鈉(NaHS)組和羥胺(HA)組。嗎啡依賴組按劑量遞增原則皮下注射嗎啡，NaHS組和HA組分別于注射嗎啡前30 min腹腔注射NaHS和HA，對照組注射等量生理鹽水。納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀確定模型成功建立，然后觀察四組大鼠戒斷癥狀和體質(zhì)量變化，比色法測定大鼠血漿及海馬組織NO含量，Real time PCR測定海馬組織nNOS mRNA表達量。結(jié)果 嗎啡依賴組和HA組與對照組比較，戒斷癥狀積分升高(P<0.05)，體質(zhì)量下降(P<0.05)，血漿和海馬組織NO含量以及NOS活性升高(P<0.05)；NaHS組與依賴組相比，戒斷癥狀積分降低(P<0.05)，體質(zhì)量增加(P<0.05)，NO含量以及NOS活性下降(P<0.05)而NaHS組與對照組比較，戒斷癥狀、體質(zhì)量、NO含量以及NOS活性均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 外源性H2S可減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀，控制嗎啡依賴大鼠體質(zhì)量的下降，其作用機制可能與外源性H2S抑制NO的產(chǎn)生、下調(diào)nNOS mRNA表達有關(guān)。

硫化氫；嗎啡依賴；戒斷癥狀；體質(zhì)量；一氧化氮/一氧化氮合酶

長期應用阿片類藥物會使機體產(chǎn)生軀體性和精神性依賴，一旦突然停藥，機體將產(chǎn)生流汗、顫抖、發(fā)熱、血壓升高、肌肉疼痛和痙攣等一系列生理功能紊亂，即戒斷綜合征〔1〕。目前臨床上主要采用脫毒治療，但是其復吸率卻高達95%。因此，研究藥物依賴的發(fā)生機制和尋找治療藥物依賴的新途徑有著重要的理論意義和社會意義。目前研究認為，H2S在神經(jīng)、心血管以及免疫系統(tǒng)等方面均發(fā)揮著重要作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中能有效減緩缺血性腦梗死、阿爾茨海默病、熱驚厥、帕金森病的發(fā)生發(fā)展〔2，3〕。近年有研究報道，外源性硫氫化鈉(NaHS)可減輕海洛因成癮大鼠戒斷癥狀，提高大鼠伏隔核H2S水平，而海洛因會降低大鼠伏隔核H2S水平〔4〕，課題組最近的研究也觀察到外源性H2S可減輕大鼠學習記憶減退及神經(jīng)元損傷，提示H2S具有抗阿片類物質(zhì)依賴作用，但其作用機制有待進一步研究。阿片類物質(zhì)依賴的機制十分復雜，可能涉及體內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，如去甲腎上腺素、多巴胺、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)等多種因素。因此，該研究通過建立嗎啡依賴大鼠模型，采用比色分析法和Real time PCR技術(shù)，結(jié)合嗎啡依賴大鼠戒斷實驗，觀察H2S對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響以及NO/NOS變化。

1 材料與方法

1.1 動物分組 清潔級雄性SD大鼠(由重慶第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供)40只，體重為180～220 g。隨機分為對照組(生理鹽水)、依賴組(嗎啡依賴大鼠)、NaHS組(嗎啡依賴大鼠+NaHS)、羥胺(HA)組(嗎啡依賴大鼠+HA)，每組10只。

1.2 實驗試劑 鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠)；鹽酸納洛酮注射液(益僑湖南制藥有限公司)；NaHS與HA(購自美國Sigma公司)；NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；nNOS mRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(日本TaKaRa生物工程公司)。根據(jù)GenBank查出nNOS和β-actin的引物序列，nNOS上游5′CCTATGCCAAGACCCTGTGTGA3′，下游3′CATTGCCAAAGGTGCTGGTG5′，產(chǎn)物長度132 bp；β-actin上游5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游3′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG5′，產(chǎn)物長度150 bp。

1.3 儀器設備 Eppendof Mastercycler Gradient PCR儀由德國Eppendorf 公司生產(chǎn)，Icycler 熒光定量PCR儀由美國BIO-RAD 公司生產(chǎn)，Tu-1810 紫外分光光度計由北京通用分析儀器公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 建模 按逐日遞增的原則，采用皮下注射鹽酸嗎啡復制嗎啡依賴大鼠模型，以同樣方法給予等量生理鹽水建立對照組模型，第10天給予5 mg/kg納洛酮皮下注射誘發(fā)戒斷癥狀，參照柳田知司標準進行戒斷評分〔5〕，確定嗎啡依賴大鼠模型是否成功建立。第10～12天，每天按50 mg/kg注射一次嗎啡維持依賴大鼠模型。NaHS組和HA組分別于注射嗎啡前30 min給予腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)和HA(12.5 mg/kg)。

1.4.2 戒斷癥狀及體重觀察 各組大鼠分別于戒斷前和戒斷后60 min稱重，并計算體重變化值。戒斷癥狀的觀察參照柳田知司評分標準，分別記錄可數(shù)和不可數(shù)癥狀，可數(shù)癥狀包括大鼠齒顫、扭體﹑站立﹑濕狗樣抖﹑伸展﹑清理皮毛等，分別記錄各自出現(xiàn)的次數(shù)不可數(shù)癥狀為上瞼下垂，每2分鐘評定一次。以上癥狀觀察30 min，全部癥狀得分之和為戒斷評分。

1.4.3 NO含量測定 各組大鼠戒斷癥狀評分結(jié)束后，35%水合氯醛(1 ml/kg)麻醉，斷頭取血，剝離出完整海馬凍存。血漿NO的測定采用硝酸還原酶法。海馬NO的測定，首先將凍存海馬組織取出后勻漿，低溫低速離心10 min(3 000 r/min)，取離心好的勻漿上清液分別測定總蛋白含量和NO含量，參照考馬斯亮藍蛋白試劑盒和NO測試盒說明書操作。

1.4.4 nNOS mRNA表達的檢測 取出凍存液中的海馬組織，采用Real-time PCR方法提取組織中總RNA，并檢測RNA的純度和濃度。實驗中RNA純化、純度和含量測定、逆轉(zhuǎn)錄及擴增步驟按試劑盒說明書進行操作。目的基因的相對定量方法采取以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)進行統(tǒng)計。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析，運用S-N-K法進行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 H2S對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀及體重的影響 納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀發(fā)現(xiàn)，嗎啡依賴組、HA組大鼠均出現(xiàn)濕狗樣抖、伸展、扭體、理毛、齒顫以及直立等癥狀，戒斷癥狀分值明顯高于對照組(P<0.05)，表明成功建立嗎啡依賴大鼠模型。而NaHS組的戒斷癥狀分值低于嗎啡依賴組(P<0.05)，NaHS組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。納洛酮催促后60 min，嗎啡依賴組和HA組體重變化明顯高于對照組(P<0.05)，NaHS組的體重變化低于嗎啡依賴組(P<0.05)，NaHS組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2 H2S對嗎啡依賴大鼠血漿及海馬組織NO含量的影響 與對照組比較，嗎啡依賴組、HA組大鼠血漿和海馬組織NO含量顯著增高(P<0.05)，而NaHS組大鼠血漿和海馬組織NO含量低于嗎啡依賴組(P<0.05)，NaHS組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.3 H2S對嗎啡依賴大鼠海馬組織nNOS mRNA表達的影響 嗎啡依賴組、HA組大鼠海馬組織的nNOS mRNA表達嗎啡(1.82±0.34、1.88±0.45)較對照組增加(0.88±0.17，P<0.05)，NaHS組的nNOS mRNA表達(0.96±0.27)低于嗎啡依賴組(P<0.05)，而NaHS組與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠戒斷癥狀評分和體重變化比較±s)

與對照組比較：1)P<0.05；與嗎啡依賴組比較:2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠血漿及海馬組織NO含量比較

3 討 論

而近年來人們發(fā)現(xiàn)H2S在機體內(nèi)廣泛存在，具有重要的細胞保護作用。最近的研究表明，使用H2S的海洛因成癮大鼠戒斷癥狀明顯低于單獨使用海洛因組大鼠，外源性NaHS可以抑制腺苷酸環(huán)化酶/cAMP途徑，影響海洛因依賴大鼠伏隔核cAMP信號通路〔6〕，提示H2S及其同系物對嗎啡依賴有積極作用，有望開發(fā)成為一種新型的防治阿片類物質(zhì)依賴的藥物，但其作用機制及應用前景尚有待于進一步研究和證實。

課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)外源性硫氫化鈉可提高嗎啡依賴大鼠血漿H2S含量，降低伏核和海馬cAMP含量，減輕嗎啡依賴大鼠學習記憶減退及海馬神經(jīng)元損傷〔7～9〕。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)H2S作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，能有效緩解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，并能減輕相應臨床癥狀。本研究結(jié)果提示外源性H2S可減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀及體質(zhì)量變化，由此推測將H2S或者同系物開發(fā)成為一種新型的防治阿片類物質(zhì)依賴的藥物成為可能。

近年來，已經(jīng)證實NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著細胞間信息傳導的作用，能夠介導許多生理和病理過程，其中包括參與嗎啡的耐受和依賴過程。在對阿片類物質(zhì)濫用的研究中證實，阿片濫用者血清NO含量高于普通人群，因此有研究者認為NO可能介導了阿片類物質(zhì)依賴和耐受的形成〔10〕。NOS作為NO生物合成的關(guān)鍵酶，不同的NOS催化合成的NO在不同的組織細胞中發(fā)揮著不同的生物學效應。以往實驗研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的NO在嗎啡依賴和戒斷的形成中通過NMDA/NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導通路產(chǎn)生效應，其中神經(jīng)元型NO合酶(nNOS)的活性直接影響此通路中NO的合成〔11〕，提示中樞內(nèi)NO和nNOS在嗎啡依賴和戒斷的形成中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)嗎啡依賴大鼠血漿和海馬組織NO含量顯著增高，海馬組織的nNOS mRNA表達增加，這與以往文獻報道的結(jié)果是一致的。然而給予外源性H2S供體NaHS后，大鼠血漿和海馬組織NO含量以及海馬nNOS mRNA表達均低于嗎啡依賴組。由此推測，H2S減輕嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的原因，可能是由于H2S抑制了以上基因的表達，當然也有可能是與其他因素相互作用的結(jié)果。

1 Jiang H，Han Y，Du J，etal.Factors associated with one year retention to methadone maintenance treatment program among patients with heroin dependence in China〔J〕.Subst Abuse Treat Prev Policy，2014；9(1)：11-5.

2 Li FH，Ming L，Tsun P，etal.Hydrogen sulfide：neurophysiology and nourothology〔J〕.Antioxid Redox Signal，2011；15(2)：405-19.

3 Russo CD，Tringali G，Ragazzoni E，etal.Evidence that hydrogen sulfide can modulate hypothalamo-pituitary-adrenal axis function：in vitro and in vivo studies in the rat〔J〕.J Neuroendocrinol，2000；12(3)：225-33.

4 Jiang LH，Wang J，Wei XL，etal.Exogenous sodium hydrosulfide can attenuate naloxone-precipitated withdrawal syndromes and affect cAMP signaing pathway in heroin-dependent rat′s nucleus accumbens〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012；16(14)：1974-82.

5 張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法(上冊)〔M〕.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學,北京醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1998：1073-81.

6 Yang HY，Wu ZY，Wood M，etal.Hydrogen sulfide Attenuates opioid dependence by suppression of adenylate cyclase/cAMP pathway〔J〕.Antioxid Redox Signal,2014；20(1)： 31-41.

7 秦 偉，劉曉紅，肖順武.新型氣體信號分子H2S對嗎啡依賴大鼠伏核和海馬cAMP水平研究〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2009；19(17)：2623-5.

8 秦 偉，金 寰，羅孝美，等.硫化氫對嗎啡依賴大鼠空間學習記憶及海馬NMDA受體表達的影響〔J〕.遵義醫(yī)學院學報，2011；34(5)：453-6.

9 秦 偉，金 寰，羅孝美，等.硫化氫對嗎啡依賴大鼠學習記憶的影響及機制研究〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2014；24(26)：18-21.

10 魏 潔，張引國，李積勝.嗎啡條件性位置偏愛與海馬一氧化氮合酶的關(guān)系〔J〕.中國行為醫(yī)學科學，2005；14(5):394-5.

11 秦承偉，張勵才，曾因明.毀損大鼠中縫背核內(nèi)觸液神經(jīng)元對嗎啡依賴和戒斷的影響〔J〕.中國應用生理學雜志，2007；23(3)：286-91.

〔2015-03-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

貴州省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目(No.20083066)；貴州省衛(wèi)生廳項目(No.gzwkj2013-1-013)；遵義醫(yī)學院重點學科建設項目(No.XZXK-20120702)

秦 偉(1976-)，男，副教授，碩士，主要從事阿片成癮及神經(jīng)疾病的研究。

R915；Q423

A

1005-9202(2015)12-3235-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.021