趙星宇 李冬松 王云亭 王榮國

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，吉林 長春 130021)

電針在骨骼肌修復(fù)中對I型膠原蛋白的影響

趙星宇 李冬松 王云亭1王榮國2

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，吉林 長春 130021)

目的 通過Ⅰ型膠原蛋白(collagen-Ⅰ)表達(dá)的時程變化規(guī)律觀察骨骼肌修復(fù)過程中電針防止過度纖維化的作用。方法 使用60只新西蘭兔建立腓腸肌急性鈍挫傷模型后，隨機(jī)分為模型對照組(A組)；電針阿是穴組(B組)；電針足三里組(C組)；電針阿是穴+足三里組(D組)。于制模后7、14、28 d取材，通過免疫組化技術(shù)檢測組織中collagen-Ⅰ在骨骼肌修復(fù)過程中的表達(dá)水平。結(jié)果 急性骨骼肌鈍挫傷后7 d，電針組與A組中collagen-Ⅰ表達(dá)無明顯差異；急性骨骼肌鈍挫傷后14 d，各組collagen-Ⅰ表達(dá)持續(xù)增加，但電針組collagen-Ⅰ表達(dá)的上升幅度顯著低于A組(P<0.05)；急性骨骼肌鈍挫傷后28 d，電針組中collagen-Ⅰ表達(dá)呈下降趨勢，而A組中collagen-Ⅰ表達(dá)繼續(xù)增加(P<0.05)。結(jié)論 (1)電針治療能通過降低collagen-Ⅰ的表達(dá)水平，抑制骨骼肌的過度纖維化，防止瘢痕的形成，有利于損傷骨骼肌的修復(fù)；(2)電針刺激阿是穴+足三里的療效優(yōu)于單獨(dú)選用阿是穴或足三里，兩穴具有協(xié)同作用。

電針；骨骼??；鈍器傷；波形蛋白；Ⅰ型膠原蛋白

治療骨骼肌損傷的目的在于促進(jìn)骨骼肌纖維再生并同時抑制細(xì)胞外基質(zhì)過度纖維化，防止瘢痕的形成，盡可能使損傷骨骼肌恢復(fù)正常收縮功能。研究證實電針有預(yù)防傷口纖維化粘連的作用〔1〕。肌纖維中Ⅰ型膠原蛋白(collagen-Ⅰ)作為組織纖維化的主要標(biāo)志物，已在對各臟器纖維化疾病的研究中得到證實〔2，3〕。本研究對急性骨骼肌鈍挫傷動物模型應(yīng)用電針進(jìn)行治療，通過觀察collagen-Ⅰ的表達(dá)水平，探討電針對防治過度 纖維化的作用。

1 材料及方法

1.1 對象 健康成年新西蘭兔60只，雌雄不限，體重(2.0±0.2)kg，北京海淀興旺動物養(yǎng)殖場〔SCXK(京)2011-0010〕提供，于中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所動物室普通環(huán)境飼養(yǎng)〔SYXK(京)2010-0032〕。隨機(jī)分為模型對照組(A組，n=15)：模擬電針治療組固定；電針阿是穴組(B組，n=15)；電針足三里組(C組，n=15)；電針阿是穴+足三里組(D組，n=15)。

1.2 主要儀器及試劑 韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS200E，南京濟(jì)生)；骨骼肌急性鈍挫傷砸傷器(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院)；圖像分析軟件(Image-Pro Plus Version 6.0，美國Media Cybernetics)； collagen-Ⅰ兔多克隆抗體(lot:No 9A79C，武漢博士德)，vimentin鼠單克隆抗體(lot:E2611，美國SANTA CRUZ)； SV-002-兔IgG(lot：07B21CJ，武漢博士德)，SV-001-鼠IgG(lot：06J26CJ，武漢博士德)。

1.3 方法

1.3.1 建立動物模型 所有動物在實驗前1 d雙側(cè)小腿剃毛、稱重、禁食；3%戊巴比妥鈉30 mg/kg體重耳緣靜脈注射麻醉，將動物右側(cè)在上側(cè)臥位固定于造模臺，右后肢置于伸膝、踝背屈約90°固定，便于腓腸肌顯示。在腓腸肌距跟骨后緣8 cm處標(biāo)記打擊位置，用砸傷器造成一次性鈍挫傷，打擊面積為1 cm2，能量為9.75 J。打擊處皮膚完整，脛腓骨無骨折。放回籠中，家兔麻醉蘇醒后自由活動。所有動物在麻醉、術(shù)前、術(shù)后的喂養(yǎng)、室溫及其他管理條件一致。通過解剖和病理證實急性鈍挫傷模型制作成功。

1.3.2 干預(yù)方法 創(chuàng)面常規(guī)處理：外用25 g/L安爾碘處理，1次/d，保持干燥避免感染。電針各組在創(chuàng)面常規(guī)處理的基礎(chǔ)上，于造模后24 h開始電針治療。用兔固定器固定動物后，將雙后肢伸出，取左后肢“足三里(ST36)”穴(參照《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》)，主針刺入穴位區(qū)15 mm，輔針在旁開5 mm處刺入皮下。阿是穴分別取距打擊部位遠(yuǎn)、近端各10 mm處，針刺入穴區(qū)15 mm，針刺后接電針儀。電針參數(shù)：頻率2 Hz，0.4 mA，時間15 min，隔日1次，直到取材前1 d結(jié)束治療。所有電極同步刺激，參數(shù)一致。A組進(jìn)行模擬固定，但不進(jìn)行電針刺激。

1.3.3 取材及標(biāo)本處理 于造模后7、14、28 d，從各組分別取5只動物，麻醉后切開小腿后側(cè)皮膚，暴露腓腸肌于造模部位取材。取造模區(qū)骨骼肌組織10×10×3 mm3，4%多聚甲醛固定3 d，脫水、透明、浸蠟、包埋，5 μm切片行免疫組化染色。于A組健側(cè)腓腸肌對應(yīng)部位取材作為正?？瞻讓φ铡?/p>

1.3.4 指標(biāo)和方法 采用兩步法免疫組化檢測：切片脫蠟至水；3%H2O2，室溫10 min，蒸餾水洗2 min×3次；滴加封閉液，室溫10 min；甩去多余液體，不洗；滴加一抗(濃度1∶50)，4℃過夜；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV-002)，37℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；DAB顯色：取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色10 min；蒸餾水洗滌；脫水，透明，封片。

1.4 實驗結(jié)果分析 免疫組化切片分別在物鏡下隨機(jī)選取6個視野采集圖像，輸入Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件，胞質(zhì)染成棕黃色為陽性，分析其平均光密度值(OD)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和非參數(shù)檢驗。

2 結(jié) 果

骨骼肌損傷后7 d，A組與各電針組中collagen-Ⅰ均有所表達(dá)，與正常空白對照相比差異顯著(P<0.05)，各電針組與A組相比無顯著差異(P>0.05)。骨骼肌損傷后14 d，A組與各電針組中collagen-Ⅰ表達(dá)繼續(xù)增加，各電針組與A組相比，上升幅度顯著低于A組(P<0.05)；B組及C組collagen-Ⅰ表達(dá)強(qiáng)度明顯高于D組(P<0.05)；C組表達(dá)強(qiáng)度高于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。骨骼肌損傷后28 d，A組與各電針組中collagen-Ⅰ表達(dá)繼續(xù)增加，電針組collagen-Ⅰ表達(dá)則呈下降趨勢；B組及C組collagen-Ⅰ表達(dá)強(qiáng)度明顯高于D組(P<0.05)；C組表達(dá)強(qiáng)度高于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1，圖1。

表1 7、14、28 d各組家兔腓腸肌collagen-Ⅰ的OD值

與正?？瞻讓φ战M比較：1)P<0.05；與A組比較：2)P<0.05；與D組比較：3)P<0.05

圖1 7、14、28 d各組家兔腓腸肌collagen-Ⅰ的表達(dá)(DAB，×40)

3 討 論

本研究選用成熟的、單次致傷的腓腸肌急性鈍挫傷模型，可以最大程度地模擬臨床損傷過程。9.75 J的致傷能量經(jīng)預(yù)實驗證實造模成功，沒有引起骨折。致傷能量可以精確控制，具有可重復(fù)性，模型穩(wěn)定。組織修復(fù)可分再生和瘢痕修復(fù)，再生是由損傷周圍的同種細(xì)胞來修復(fù)；瘢痕修復(fù)是再生能力弱或缺乏的組織，發(fā)生缺損后，只能由肉芽組織填補(bǔ)，由纖維結(jié)締組織修復(fù)，而后形成瘢痕，不能通過原來組織再生修復(fù)。修復(fù)過程中，肌纖維再生和瘢痕組織相互依賴、相互競爭，兩者的平衡是損傷骨骼肌恢復(fù)正常收縮功能的前提。經(jīng)自然愈合的嚴(yán)重的骨骼肌損傷難以完全恢復(fù)到未損傷前的功能狀態(tài)，瘢痕的形成會阻礙肌纖維再生，影響肢體功能，引起后遺疼痛并增加再次損傷的概率。因而，提高骨骼肌損傷后功能恢復(fù)的研究主要應(yīng)放在如何抑制ECM過度纖維化這個方面。

針灸可糾正腧穴處氣血流動的失衡，進(jìn)而達(dá)到治療疾病并促進(jìn)傷口愈合的目的。其作為特殊的中醫(yī)外治手段，通過電療技術(shù)刺激穴位，調(diào)節(jié)經(jīng)絡(luò)氣血，增強(qiáng)機(jī)體防御能力，以促進(jìn)機(jī)體功能恢復(fù)，具有治療安全、操作簡單、儀器輕便、可在各層醫(yī)療機(jī)構(gòu)得到推廣的優(yōu)勢。阿是穴是病痛局部的反應(yīng)點(diǎn)，是經(jīng)絡(luò)氣血在病理情況下一時聚留之處〔4〕。有研究證實，在阿是穴針刺后Na，K-ATP酶活性得到增加〔5〕，在一定程度上可修復(fù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的正常代謝〔6〕，并改善局部血流情況，從而修復(fù)超微結(jié)構(gòu)的損傷變化，達(dá)到治療骨骼肌損傷的目的。

足三里是補(bǔ)益氣血的大穴，解剖位置位于脛骨前肌上。吳立紅等〔7〕發(fā)現(xiàn)電刺激足三里可以對抗大鼠運(yùn)動性疲勞，其機(jī)制可能是通過改善大鼠整體健康狀況，提高能量代謝效率，糾正自由基代謝失衡，減少代謝產(chǎn)物的堆積，從而達(dá)到治療目的。

電針的刺激參數(shù)和電流強(qiáng)度是影響療效的重要因素。在前期實驗〔8〕中我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)用0.2 mA和0.4 mA電流電針足三里+阿是穴均有減少膠原纖維在創(chuàng)面所占比例和增加肌纖維面積的作用，并且0.4 mA的效果更好，0.6 mA對創(chuàng)區(qū)可能存在二次損害效應(yīng)。關(guān)于觀察時間點(diǎn)的選擇，我們考慮：肌肉再生是從損傷后的2～3 d開始，到2 w達(dá)到高峰，并在隨后減弱；瘢痕組織即纖維化的形成是在損傷后的2～3 w，并隨著時間的推移而增大〔9〕。7 d是炎癥反應(yīng)和再生均存在的一個時間點(diǎn)，便于觀察治療的早期效果；14 d是纖維化進(jìn)行活躍的時期，便于觀察纖維化的進(jìn)展；28 d是修復(fù)的結(jié)局，便于觀察修復(fù)結(jié)果。

collagen主要由成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌，到目前為止，已有28種主要類型的collagen被確認(rèn)，它們是骨、軟骨、肌腱、皮膚及肌肉的重要組成部分〔10〕。collagen的生物相容性和促進(jìn)傷口愈合的能力使collagen在傷口愈合中扮演重要角色〔11〕。但我們同時發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重的肌肉創(chuàng)傷中，成纖維細(xì)胞的大量增生將會導(dǎo)致過度纖維化，堅韌的瘢痕組織的大量形成，借助機(jī)械屏障阻礙SC遷移到損傷區(qū)域，并提供不適當(dāng)?shù)募?xì)胞分化信號，從而阻礙骨骼肌的再生〔12〕。collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ是骨骼肌中的主要膠原〔13〕，在骨骼肌損傷后修復(fù)過程中，早期形成的肉芽組織中富含collagen-Ⅲ，collagen-Ⅰ的量很少，其彈性很好而張力差；后期的疤痕組織中則以collagen-Ⅰ為主，張力好但彈性很差〔14〕。所以，我們有理由相信在這種膠原蛋白代謝失衡、基質(zhì)重構(gòu)的過程中，collagen-Ⅰ的過度沉積是導(dǎo)致骨骼肌瘢痕形成的主要原因。我們的實驗結(jié)果說明，在骨骼肌修復(fù)早期collagen-Ⅰ積極參與骨骼肌的再生，為骨骼肌正常形態(tài)和功能的恢復(fù)提供支架與橋梁，電針治療并沒有明顯抑制其表達(dá)，這與Thais等〔12〕的觀點(diǎn)是相似的，他們認(rèn)為在骨骼肌修復(fù)的早期，低功率激光加速肌肉的修復(fù)正是通過提高肌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)collagen的合成來完成的。而骨骼肌損傷14 d時電針已開始對ECM的纖維化進(jìn)行抑制。28 d，電針治療能降低collagen-Ⅰ的過度沉積，抑制損傷骨骼肌中ECM的過度纖維化，有效防止了瘢痕形成。

綜上所述，我們認(rèn)為電針治療能通過降低collagen-Ⅰ的表達(dá)水平，抑制骨骼肌的過度纖維化，防止瘢痕的形成，有利于損傷骨骼肌的修復(fù)；電針刺激阿是穴+足三里的療效優(yōu)于單獨(dú)選用阿是穴或足三里，兩穴具有協(xié)同作用。

1 羅 榮，楊玉龍，李 鴻.電針早期介入預(yù)防手術(shù)后粘連〔J〕.中國康復(fù)理論與實踐，2006；12(8):699-700.

2 Tsukada S，Parsons CJ，Rippe RA.Mechanisms of liver fibrosis〔J〕.Clin Chim Acta，2006；364(1-2)：33-60.

3 American Thoracie Society.Idiopathic pulmonary fibrosis：diagnosis and treatment〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000；161(2)：646-64.

4 郭紅波.阿是穴針刺頸型頸椎病62例療效評價〔J〕.按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)，2011；2(3)：21-3.

5 屈竹青，盧磊厚.針刺對延遲性肌肉結(jié)構(gòu)損傷過程中肌漿網(wǎng)、肌膜Ca，Mg-ATP酶及肌膜Na，K-ATP酶活性的影響〔J〕.北京體育大學(xué)學(xué)報，1994；17(1)：33-8.

6 李澎濤，于鴻玲.針刺對家兔超負(fù)荷運(yùn)動骨骼肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子活度的影響〔J〕.中國針灸，1994；(6)：30-2.

7 吳立紅，方劍喬，邵曉梅，等.經(jīng)皮穴位電刺激足三里對抗大鼠運(yùn)動性疲勞〔J〕.中國臨床康復(fù)，2005；9(40)：114-7.

8 王榮國，王云亭，肖 誠，等.不同電流強(qiáng)度電針對兔骨骼肌鈍挫傷后改善微循環(huán)、抗纖維化和抗氧化能力初探〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)，2012；27(5)：400-5.

9 Ohsawa Y.Skeletal muscle regeneration therapy〔J〕.Rinsho Shinkeigaku，2011；51(11)：922.

10 Yun YR，Lee SJ，Jeon E，etal.Fibroblast growth factor 2-functionalized collagen matrices for skeletal muscle tissue engineering〔J〕.Biotechnol Lett，2012；34(6)：771-8.

11 Somasundaram R，Schuppan D.Type Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，and Ⅵ collagens serve as extracellular ligands for the isoforms of platelet-derived growth factor(AA，BB，and AB)〔J〕.J Biol Chem，1996；271：26884-91.

12 Thais OF de S，Dayane AM，Raquel AMF，etal.Phototherapy with low-level laser affects the remodeling of types Ⅰ and Ⅲ collagen in skeletal muscle repair〔J〕.Lasers Med Sci，2011;26(6)：803-14.

13 Bailey AJ.Molecular mechanisms of ageing in connective tissues〔J〕.Mech Ageing Dev,2001;19(122)：735-55.

14 Kellett J.Acute soft tissue injuries-a review of the literature〔J〕.Med Sci Sports Exerc，1986;18(5)：489-500.

〔2014-12-25修回〕

(編輯 郭 菁)

The effect of electroacupuncture influencing vimentin and collagen-Ⅰ in skeletal muscle repair

ZHAO Xing-Yu,LI Dong-Song,WANG Yun-Ting,etal.

The First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,Jilin,China

Objective To investigate the roles of electroacupuncture in prevention of excessive fibrosis of the skeletal muscle.Methods The acute skeletal muscle contusion model was produced at the gastrocnemius by specific device;all rabbits were divided into model control group(group A);electroacupuncture stimulation ouch point group(group B);electroacupuncture stimulation tsusanli group(group C);electroacupuncture stimulation ouch point and tsusanli group(group D). At 7,14,28th day after injury,and the expressions of vimentin and collagen-Ⅰwere tested by immunohistochemistry.Results At 7th day after injury,the expression of collagen-Ⅰ were no significant differences between the electroacupuncture groups and group A;at 14th day after injury,the expression of collagen-Ⅰ were increased continually in each group,but the rises of the expression of collagen-Ⅰ in the electroacupuncture groups were significantly lower than that of group A,P<0.05;At 28th days after injury,the expression of collagen-Ⅰ in the electroacupuncture groups were showing a decreasing trend,but the expression of collagen-Ⅰ in group A was increased continually,P<0.05，group B> group C>group D.Conclusions The electroacupuncture treatment could inhibit excessive fibrosis of skeletal muscle to prevent scar formation by reducing the expression of collagen-Ⅰ,which is beneficial to skeletal muscle repair. The curative effect of combined tsusanli and ouch point group is better than tsusanli or ouch point group separately,the two points have a synergistic effect.

Electroacupuncture;Skeletal muscle;Contusion injury;Collagen-Ⅰ

國家自然科學(xué)基金資助項目(81173343)

王云亭(1965-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事手外疾病、四肢軟組織缺損的修復(fù)與重建研究。

趙星宇(1986-)，男，醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)科常見病及多發(fā)病的診斷與治療研究。

R68

A

1005-9202(2015)12-3188-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.002

1 中日友好醫(yī)院 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)