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C17-吡唑琳基甾體衍生物誘導Hela 細胞凋亡研究

2015-06-11 02:21:56范寧娟白育斌
動物醫(yī)學進展 2015年12期
關(guān)鍵詞:甾體吡唑衍生物

范寧娟,白育斌,師 偉,段 敏*

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院,陜西楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學理學院,陜西楊凌712100)

在甾體分子結(jié)構(gòu)的D-環(huán)引入含N、O、S等雜原子的雜環(huán)后將使得甾體衍生物呈現(xiàn)廣泛的生物活性[1]。在雜環(huán)衍生物中,吡唑啉基甾體化合物因為具有止痛、抗菌、抗癌等功效為人們所熟悉,合成含有吡唑啉基的此類衍生物已經(jīng)成為甾體結(jié)構(gòu)改造和修飾的重 要 分 支[2-5]。2013 年,我 們 合 成 了 一 系 列新穎的吡唑啉基甾體衍生物,體外細胞毒活性試驗顯示部分化合物對肺癌(NCI-H460)、宮頸癌(Hela)和肝癌(HepG2)3種人體癌細胞具有較好的抑制活性,其中化合物1對Hela細胞的半數(shù)抑制率為12.5 μg/mL,細胞周期分析試驗證明吡唑啉基甾體衍生物1(圖1)具有誘導細胞周期停滯的特性[6]。據(jù)此推測吡唑啉基甾體衍生物1抑制Hela細胞增殖的活性可能與其誘導細胞周期停滯有關(guān)。

圖1 吡唑啉基甾體衍生物1結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of derivative 1of steroidal derivatives

為了進一步研究其生物學功能,本研究將檢測C17-吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細胞的凋亡的作用及機制,為進一步明確其抗腫瘤活性研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細胞購于中國科學院細胞庫細胞株信息庫。RPMI-1640培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購 自Gibico 公 司;Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù) 有 限 公 司;Bax、PARP、Bcl-2、β-actin 抗 體 購 于Santa Cruz。辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗和ECL 顯 色 試 劑 盒 購 自Pierce 公 司;Annexin-VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品合成 C17-吡唑琳基甾體衍生物1參考文獻[6]進行合成,將合成的樣品溶于二甲基亞砜(DMSO)中,最終配制成2μg/μL 的儲存液(含0.5 mL/L DMSO)備用,DMSO終濃度不超過10mL/L。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與處理 Hela細胞用100 mL/L胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。用2.5mL/L 的胰蛋白酶(含0.4mL/L的EDTA)消化傳代。

1.2.3 形態(tài)學觀察 將Hela細胞接種至12孔板,待貼壁后,用12.5μg/mL的C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理12、24、36、48h,吸棄培養(yǎng)基,每孔加入200μL的PBS和2μL的AO/EB染色液(各含100 μg/mL),室溫避光孵育10min,用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用DMSO 處理的細胞作為陰性對照。

1.2.4 流式細胞儀檢測吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細胞凋亡率的影響 將Hela細胞接種于6孔板中,用,同時設(shè)置不用藥物處理的正常細胞為對照,于藥物處理后不同的時間點(0、12、24、36、48h)收集細胞,1 000r/min 離心5 min,棄掉上清,用PBS洗滌2次,收集細胞。先加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞,然后加入5μL Annexin V-FITC 和10μL 碘化丙啶染色液,輕輕混勻,最后于室溫(20℃~25℃)避光孵育10min~20 min。孵育過程中可以重懸細胞2 次~3 次以改善標記效果。隨即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 用分光光度法檢測Caspase-3、-8和-9的活性 用12.5μg/mL 的藥物處理Hela細胞,分別于不同時間點(0、12、24、36、48h)收集細胞。按照試劑盒說明書在收集的沉淀細胞中加入200μL 的Lysis buffer,吹打均勻,置冰上裂解1h,其間渦旋振蕩3次,10 000r/min 離心1min,吸取上清至新的1.5mL EP管中。用BCA 法檢測所提取的蛋白質(zhì)濃度。分別吸取50μL 含總蛋白量為150μg的細胞裂解上清液,然后加入50μL 的2×Reaction buffer和5μL 的Caspase substrate,37 ℃避光孵育4h。以Lysis buffer 和Reaction buffer作為空白對照。在400nm 波長處測定吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)因子的變化

①細胞總蛋白的提取。收集細胞,PBS洗2次,加入400μL的預(yù)冷的含有1mmol/L PMSF的RIPA 裂解液,冰上裂解1h,期間渦旋混勻4 次,12 000r/min離心20min,取上清,加入4×loading buffer,煮沸10min,置-80℃保存?zhèn)溆?。②線粒體蛋白與細胞漿蛋白的提取。收集細胞,PBS洗2次,4 ℃、600r/min離心10min,棄上清。加入1mL含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的線粒體分離試劑,重懸細胞,勻漿細胞,4 ℃、600r/min離心10 min,將上清移至新的離心管中,4℃、11 000r/min 離心10 min(上清為去除了線粒體的胞漿蛋白液,沉淀為線粒體)。冷卻后,置于-80℃中保存?zhèn)溆谩"踂estern blot分析與細胞凋亡相關(guān)因子的變化。取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,將蛋白轉(zhuǎn)至用甲醇活化的PVDF膜上,用含有50g/L脫脂奶粉的PBS封閉2h,用含20g/L 脫脂奶粉的一抗4 ℃孵育過夜。次日,將PVDF 膜用PBST 洗滌3 次,每次6 min。然后將PVDF膜置于用20g/L脫脂奶粉稀釋的HRP標記的二抗中,室溫孵育1h,將PVDF 膜用PBST 緩沖液振搖洗滌5次,每次5min。將ECL試劑顯影。

1.2.7 統(tǒng)計分析 將試驗所得結(jié)果用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0 進行單因素方差分析,試驗數(shù)據(jù)運用Dunnet t的雙尾檢驗多重比較法進行顯著性檢驗,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 C17-吡唑琳基甾體衍生物1誘導Hela細胞凋亡的形態(tài)學變化

透射電鏡觀察C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理的Hela細胞,細胞核濃縮,隨著時間的延長,細胞核發(fā)生明顯的碎裂(圖2A)。熒光顯微鏡下觀察AO/EB 染色后的Hela 細胞,對照組細胞只被AO 染色,細胞核內(nèi)呈均勻的亮綠色熒光;而處理組細胞于12h開始出現(xiàn)核內(nèi)染色質(zhì)固縮,隨著處理時間的延長,細胞核發(fā)生明顯的碎裂,晚期凋亡細胞的胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色斑點(圖2C)。

2.2 C17-吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細胞凋亡率的影響

根據(jù)Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書,運用雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示,藥物處理細胞24h時,細胞凋亡率為21.3%,與對照組相比顯著極差異,在48h時細胞的凋亡率為52.4%,與對照組相比差異極顯著,表明C17-吡唑琳基甾體衍生物1能夠誘導Hela細胞發(fā)生凋亡,且細胞的凋亡率與處理時間正相關(guān)(圖2B)。

圖2 吡唑啉基甾體衍生物1誘導Hela細胞凋亡Fig.2 C17-pyrazolinyl steroidal derivative induced apoptosis of Hela cells

2.2 C17-吡 唑 琳 基 甾 體 衍 生 物1 對Hela 細 胞Caspase活性的影響

利用Caspase檢測試劑盒檢測C17-吡唑琳基甾體衍生物1對Hela細胞Caspase分子的活化的影響。12.5μg/mL的C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理Hela細胞后,Caspase-8分子活性無顯著變化;而Caspase-3和Capase-9分子的活性在藥物處理12h后發(fā)生了顯著變化,在36h時,Caspase-3與Caspase-9的活性達到最高,與0h對照組細胞相比活性分別增加到了6.22和3.76倍,差異極顯著(圖3A)。

2.3 C17-吡唑琳基甾體衍生物1促進Caspase-3的切割底物PARP的降解

Caspase-3的切割底物PARP 在C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理后12h開始發(fā)生降解,隨著藥物處理時間的延長,PARP發(fā)生降解的程度越明顯,表明PARP能夠被活化后的Caspase-3 切割,細胞內(nèi)存在依賴于Caspase-3的其他凋亡信號轉(zhuǎn)導通路被激活(圖3B)。

2.4 C17-吡唑琳基甾體衍生物1 對線粒體通路中Bax與Bcl-2蛋白表達水平的影響

Western blot檢測表明,C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理Hela細胞后,細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達量隨處理時間而增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表達量則逐漸降低(圖4A)。

2.5 C17-吡唑琳基甾體衍生物1 對線粒體通路中Bax與Cytochrome c轉(zhuǎn)位的影響

通過Western blot檢測表明,藥物處理Hela細胞12h后,可以在胞漿中檢測到Cytochrome C,并且其表達量隨時間的延長而逐漸增加,說明Cytochrome C由線粒體釋放到胞漿,同時在胞漿中Bax表達量隨時間延長而降低(圖4B)。

圖3 吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細胞Caspase活性的影響Fig.3 The effect of C17-pyrazolinyl steroidal derivative on Caspases activities of Hela cells

圖4 C17-吡唑啉基甾體衍生物1對Hela細胞Ba、Bcl-2和細胞色素C的作用Fig.4 The effect of C17-pyrazolinyl steroidal derivative on Bax,Bcl-2,and cytochrome C in Hela cells

3 討論

細胞凋亡是一種由基因控制的程序性細胞死亡[7]。細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),早期凋亡時,細胞核固縮,核內(nèi)染色質(zhì)凝集,細胞質(zhì)濃縮。中晚期凋亡時,細胞膜內(nèi)陷,細胞核碎裂,有凋亡小體的產(chǎn)生[8]。本研究利用AO/EB 染色,觀察C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理后Hela細胞核形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物處理的Hela細胞的染色質(zhì)固縮,隨著處理時間的延長,核碎裂更加嚴重,最終導致凋亡小體的產(chǎn)生,為典型的凋亡細胞特征。

Caspases蛋白酶為天冬半胱氨酸蛋白酶,其介導的蛋白質(zhì)裂解在細胞凋亡過程中起著重要的作用[9]。細胞凋亡的信號通路主要包括死亡受體通路和線粒體通路[10]。死亡受體通路主要依賴于Caspase-8活化,線粒體通路的激活主要依賴于Caspase-9活化[11]。本研究檢測了Caspases活性,C17-吡唑琳基甾體衍生物1處理后,能夠活化Hela細胞內(nèi)的Caspase-3 和Caspase-9,而Caspase-8 的活性沒有顯著差異,表明該藥物能夠通過線粒體途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。

Bcl-2家族在細胞凋亡過程中起重要作用,其家族成員主要包括促凋亡蛋白Bax、Bad、Bak 和抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w 等,其中Bcl-2 和Bax是調(diào)控細胞凋亡的兩個關(guān)鍵蛋白[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn),C17-吡唑琳基甾體衍生物1 處理Hela細胞后,Bax/Bcl-2的比率升高,胞漿內(nèi)游離的Bax 轉(zhuǎn)移到線粒體中,從而改變了線粒體膜的通透性,進而使線粒體中的促凋亡分子Cyt c釋放到胞質(zhì)中,參與線粒體介導的細胞凋亡通路。綜上所述,合成的C17-吡唑琳基甾體衍生物1 能夠通過線粒體途徑誘導Hela細胞發(fā)生凋亡,為進一步研究其抗腫瘤作用提供了依據(jù)。

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