李凌云 張斌豪 張必翔

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·論 著·(實驗研究)

套管針技術在肝原位移植瘤模型的應用

李凌云 張斌豪 張必翔

目的 研究套管針技術在肝原位種植瘤中的作用，及其安全性和有效性。方法 裸鼠皮下接種HCCLM3細胞，成瘤后將皮下瘤組織分別用套管針技術和傳統(tǒng)肝包膜切開法進行肝癌組織原位移植。統(tǒng)計兩種方法的手術時間、出血量、術后并發(fā)癥發(fā)生率。利用HE染色檢測肝原位移植瘤。結果 兩種方法肝原位移植瘤的成瘤率均為100%，應用套管針技術組手術時間為(15.60±0.84) min明顯低于包膜切開組的(21.40±2.37) min(P<0.001)，且術中出血量(6.06±2.05) mg明顯低于包膜切開組的(25.25±7.07) mg(P<0.001)。傳統(tǒng)包膜切開組術后腸粘連等并發(fā)癥高于套管針技術組。結論 套管針技術可以安全、有效地應用于肝原位移植瘤模型，提高手術效率，減少術中出血量和術后并發(fā)癥的發(fā)生率，使肝臟原位移植瘤更符合實驗要求。

套管針；肝癌；原位種植；動物模型

肝臟由于其特殊的組織結構，在腫瘤原位種植中存在很多特殊的困難。首先其質地脆弱且血流豐富，傳統(tǒng)的肝內組織種植容易出血并且將種植組織沖出肝臟；其次肝實質內血竇豐富，細胞種植不易固定，很容易沿肝竇及血管擴散從而使原位種植失敗?；|膠的應用從一定程度上解決了肝內細胞種植的問題，但是這一產品還存在很多缺陷，如注射時間不易把握、種植過程中的細胞擴散尚未徹底解決、價格昂貴等。相反，肝內組織種植由于組織的固定形態(tài)不容易發(fā)生種植過程中細胞擴散。因此，只要解決了種植過程中的出血問題，肝內組織種植較細胞種植具有更大的優(yōu)勢。我們采用套管針技術進行肝癌組織原位種植，與傳統(tǒng)的肝包膜切開法進行比較，研究其可行性、安全性和有效性。

材料與方法

一、材料

1.細胞、動物與試劑 人肝癌細胞系HCCLM3由本實驗室保存。細胞用含5mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)加10%胎牛血清(Gibico公司)培養(yǎng)，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雄性4～6周齡Balb/c裸小鼠由同濟醫(yī)院實驗動物中心訂購，無特殊病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。

2.皮下成瘤試驗 消化貼壁細胞成單細胞懸液并計數(shù)，將5×106肝癌細胞懸浮在200 μl生理鹽水中，吹打混勻后接種到裸鼠肩胛皮下。共接種4處皮下瘤備用。2周后皮下瘤直徑約1 cm，消毒皮膚去除皮下瘤，修剪腫瘤周圍纖維結締組織。取腫瘤外圍鮮嫩組織，用刀片切成直徑約1 mm的小塊組織置于冰上生理鹽水中用于肝臟原位移植。腫瘤離體至移植時間不超過3 h。

3.腫瘤組織移植專用套管針的制作 選擇內徑約1 mm的針頭和合適規(guī)格的套管針內芯組合做成組織移植專用套管針。要求套管針針芯完全插入針腔后，前端稍超出針尖。將明膠海綿撕成小塊后自針尖逆向填塞針腔約5 mm，近針尖部位預留約2 mm空間待填塞組織用。用同樣方法將預先準備好的腫瘤組織塊放入預留針腔內后，插入套管針針芯待用。

4.建立肝內原位移植瘤模型 肝內原位腫瘤移植分為兩組，即套管針推注組(n=10)和傳統(tǒng)的肝臟包膜切開組(n=10)。裸鼠用乙醚吸入麻醉，選擇上腹正中切口約8 mm，暴露肝臟左外葉。選擇肝左外葉遠端為腫瘤種植部位。套管針推注組直接將填塞號明膠海綿和腫瘤組織的套管針刺入肝實質約5 mm，然后推動針芯至有較大阻力感時停止推注。右手固定針芯，左手扶住針頭并沿針芯方向退出針頭。腫瘤組織與明膠海綿被完整植入肝實質，小棉球壓迫止血(圖1)。包膜切開組用眼科剪刺破肝包膜至肝實質約深3 mm，將組織塊直接塞入竇道中，小棉球壓迫止血后用明膠海綿覆蓋包膜破口。止血并確定植入組織塊未脫出后將肝臟復位，關腹。

二、檢測指標與檢測方法

1.手術時間與術中出血量評估 術中分別記錄兩組所用手術時間。為評估手術出血量，術前準備無菌小棉球，稱重保證每個小棉球重量為5 mg。術中用小棉球止血或清理殘血，在完成每只動物肝內移植術后稱量所用棉球的總重量。稱量所得的術中所用棉球總重量減去棉球使用前的預計重量(棉球數(shù)×5 mg)即代表術中出血量。

圖1 套管針技術肝內原位種植過程

2.解剖學與組織學觀察 肝內種植2周后B超每周觀察腫瘤大小一次，B超測定以腫瘤直徑大于0.5 cm為成癌標準，并繪制生長曲線。種植后6周末處死裸鼠，仔細觀察腫瘤大小、形態(tài)以及周圍淋巴結、各內臟有無腫瘤轉移;腹水的量與性狀；腸粘連梗阻等并發(fā)癥。

3.HE染色鑒定肝內移植瘤 10%甲醛固定肝內移植瘤，石蠟包埋切片，進行HE染色以確定移植瘤形成。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩種種植方法術中比較

套管針技術組術中出血量為(6.06±2.05) mg，明顯低于包膜切開組的(25.25±7.07) mg，P<0.001，差異有統(tǒng)計學意義。套管針技術組手術時間為(15.60±0.84) min，明顯低于包膜切開組的(21.40±2.37) min，P<0.001，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

二、肝臟原位瘤成瘤情況

兩種方法肝原位移植瘤的成瘤率均為100%。術后2周初診動物腹部均可觸及肝內單發(fā)結節(jié)，同時超聲檢查輔助診斷均證實肝內成瘤。兩組動物肝內種植瘤成長狀況無顯著差異(圖2)。

三、大體解剖與組織學檢測

種植后6周末處死裸鼠，解剖腹部各臟器，我們發(fā)現(xiàn)動物左外葉肝臟均已成瘤。兩組動物肝內移植瘤大小無明顯差異。通過HE染色證實肝內移植瘤形成(圖3)。

表1 兩組術中情況及術后成瘤比較

圖2 肝內移植瘤生長曲線

圖3 肝內移植瘤及正常肝(HE染色，×100)

四、術后并發(fā)癥比較

套管針組腫瘤均位于肝內，未發(fā)生腹腔內轉移、腸粘連等并發(fā)癥。傳統(tǒng)包膜切開組術后腸粘連等并發(fā)癥明顯高于套管針技術組。其中4只(40%)發(fā)生腫瘤與大網(wǎng)膜或腸壁粘連，5只(50%)發(fā)生左外葉肝與中葉粘連，腫瘤侵犯腹壁發(fā)生切口轉移和腹腔種植轉移各1只(10%)。

討 論

腫瘤原位種植是腫瘤生物學研究，尤其是腫瘤器官特異性轉移相關研究中常用的方法[1-2]，包括腫瘤細胞種植和組織種植。在歐美發(fā)達國家，由于肝癌發(fā)病率低，在肝癌方面的研究較少。其研究主要集中在乳腺癌、結直腸癌、肺癌、前列腺癌等方面[3-4]。在乳腺癌[5-6]，結腸癌[7-8]等方面的研究，其原位腫瘤動物模型的制作多采用細胞注射或傳統(tǒng)的組織種植。而在皮下、乳腺、胃腸道等結締組織豐富的組織或器官，運用以上方法并無多大困難。

我國肝癌發(fā)病率高，是影響國民健康的重大疾病[9-10]，為探討肝癌的發(fā)病機制需開展大量的研究工作。肝癌研究同其他腫瘤有著相同的研究模式，但肝臟由于其特殊的組織結構，在腫瘤原位種植中存在很多困難，如肝內組織種植容易出血而將種植組織沖出肝臟、細胞種植不易固定等。影像醫(yī)學有關于超聲介導下進行肝內細胞懸液注射[11-13]，但這種方法較開腹肝內注射更難避免腫瘤細胞逆流而導致腹腔種植轉移。肝內組織種植由于組織的固定形態(tài)不容易發(fā)生種植過程中細胞擴散，可以在肝內形成單發(fā)腫瘤以模擬肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。因此只要解決了出血問題，這一技術具有更廣闊的應用前景。目前，肝內組織種植仍沿用傳統(tǒng)的被膜切開技術[14-17], 少有文獻報道快捷可行的新方法。

我們在動物模型制作過程中探索性應用套管針技術，發(fā)現(xiàn)這一技術可以將肝癌組織更準確地種植到理想的部位，并利用針腔中的明膠海綿填充進針形成的竇道而起到充分止血的目的(圖4)。這一技術可以縮短手術時間，減少肝臟出血和腸梗阻等種植并發(fā)癥。同時，本技術更能按照實驗需要在肝臟特定部位形成單發(fā)腫瘤，提高肝臟移植瘤的有效性。我們發(fā)現(xiàn)包膜切開組小鼠因術中失血較多，術后體溫明顯降低且麻醉恢復時間延長。因此，套管針技術較包膜切開法更為安全，可以降低動物死亡率。

圖4 套管針技術肝內原位種植原理

另外，應用套管針技術進行組織種植可以擴展到肝臟以外的組織或器官。雖然其他一些組織或器官用傳統(tǒng)的組織移植方法不存在太大困難，但由于套管針技術具有安全快捷和微創(chuàng)等特點，同樣可以在這些組織器官應用。例如，皮下組織種植需要切開縫合皮膚[18]，而套管針技術只需要像使用注射器那么簡單；胃腸壁腫瘤組織種植需要縫合部分腸壁[19]，發(fā)生腸梗阻概率較高，而套管針技術不會引起腸腔狹窄。因此，本技術在其他組織器官腫瘤組織種植中的應用有待進一步研究。

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Role of trochar technique on estabilishing the orthotopic intrahepatic tumor xenografting model

LiLingyun*,ZhangBinhao,ZhangBixiang.

*DivisionofGeneralSurgery,No. 3People’sHospital,Jingzhou434001,China

,ZhangBinhao,Email:bhzhang8@163.com

Objective To investigate the role of trochar in the estabilishment of orthotopic intrahepatic tumor xenografting model. Methods The subcutaneous tumors were generated by inoculating HCCLM3 cells subcutaneously to the athymic mice. The mall pieces of the subcutaneous tomors were transplanted to the left lateral hepatic lobes with trochar technique or conventional discission of the hepatic capsule. The operative time, intrahepatic blood losss and postoperative complications were assessed. HE staining was used to judge if the intrahepatic tumor formed. Results All of the mice formed intrahepatic tumors after transplantation of the tumor tissues either by the trochar technique or discission of the hepatic capsule. The mean surgical duration of the trochar group was 15.06 min, significantly shorter than the discission group (21.4 min). The intrahepatic blood loss and the incidence of postoperative complications such as intestinal obstruction in the trochar group were also significantly reduced when compared with the discission group. Conclusions These results provide evidence that trochar technique can be appplied to establish the orthotopic intrahepatic tumor xenograftiong mocdel efficiently and securely. The present investigation also indicates that the trochar technique is better than the conventional discission of the hepatic capsule when being applied to intrahepatic tumor transplantation.

Trochar; Liver cancer; Orthotopic xenografting; Animal model

434001 湖北荊州,荊州市第三人民醫(yī)院普通外科(李凌云);華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院肝臟外科中心(李凌云、張斌豪、張必翔)

張斌豪，Email：bhzhang8@163.com

R735.7

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.06.022

2015-06-02)