胡雪丹， 張 曼， 侯 茜， 徐錦華， 劉 廣， 姚協(xié)豐， 李蘋芳， 陳學好，羊杏平

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014；2.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225000）

葫蘆小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)相關(guān)性

胡雪丹1，2， 張 曼1， 侯 茜1， 徐錦華1， 劉 廣1， 姚協(xié)豐1， 李蘋芳1， 陳學好2，羊杏平1

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014；2.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225000）

為了能夠快速準確判斷葫蘆小孢子發(fā)育時期，通過對葫蘆花器外觀形態(tài)與花藥顯微結(jié)構(gòu)的觀察，并將其與小孢子發(fā)育時期進行聯(lián)系。結(jié)果顯示：葫蘆小孢子經(jīng)過四分體時期、單核期和二核期后發(fā)育成成熟花粉粒；在頂芽生長點肉眼可辨別花芽和葉芽的1 d和2 d時，在6.3～6.7 mm的花蕾中，小孢子多處于單核期，此時葫蘆花雄蕊的花粉管干癟較適合花藥、小孢子培養(yǎng)；發(fā)育到第3 d、4 d時，花粉管較飽滿，此時基本為發(fā)育成熟的花粉粒。表明可以根據(jù)葫蘆花蕾的形態(tài)、大小及小孢子的發(fā)育時期，確定花藥、小孢子培養(yǎng)最佳時期所對應的選蕾標準。

葫蘆；小孢子；發(fā)育時期；花器形態(tài)

葫蘆為葫蘆科（Cucurbitaceae）葫蘆屬，一年生攀援草本植物。學名［Lagenaria siceraria（Molina）Standl.］，又名瓠瓜、瓠子、扁蒲、蒲瓜、夜開花等［1］。葫蘆是適宜嫁接的優(yōu)良砧木，葫蘆科植物的常規(guī)遺傳育種方法育種周期長、難度大和遺傳性狀不穩(wěn)定。單倍體育種技術(shù)為縮短育種年限、提高育種效率提供了可能，但在葫蘆科蔬菜作物中，自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低［2］。為了獲得單倍體，研究者嘗試通過離體雄核發(fā)育途徑（花藥或小孢子培養(yǎng)）、雌核發(fā)育途徑（未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)、外源化學藥劑、正常花粉或輻射過的花粉授粉誘導的孤雌生殖）等手段誘導單倍體［3］。近年來，花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，為單倍體離體培養(yǎng)的應用帶來了曙光。在花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)時，花粉發(fā)育時期的選擇是影響離體誘導單倍體成功的重要因素之一。不同植物種類誘導愈傷組織形成和胚狀體發(fā)生的適宜小孢子發(fā)育時期是不同的，多數(shù)物種誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期是單核靠邊期［2-7］。許多研究結(jié)果表明小孢子發(fā)育時期與花器外部形態(tài)密切相關(guān)，可以依據(jù)花器形態(tài)特征，特別是花蕾的大小，即可判斷植物小孢子發(fā)育時期［8-11］。為此，通過對葫蘆小孢子配子體發(fā)育時期的細胞學觀察，找出小孢子各發(fā)育時期對應的花器與花藥外觀形態(tài)，研究其相關(guān)性，為葫蘆小孢子發(fā)育時期的鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

供試葫蘆品種為相生FMT，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所瓜類研究室提供，于2014年10月播種，11月定植于溫室，常規(guī)管理。

1.2 方法

1.2.1 花蕾形態(tài)觀察與測量 從葫蘆植株頂端花芽與葉芽肉眼可辨認第1 d開始為觀察期，每天13∶00點選擇15朵大小相等的花蕾做標記，并每天用毫米尺測量記錄長度。取樣時間是15∶00—17∶00，用鑷子按生長天數(shù)取葫蘆花蕾放入自封口塑料袋內(nèi)，用冰盒帶回實驗室。用游標卡尺測量花蕾縱徑，然后用鑷子剝?nèi)ポ嗥?、花瓣，取出花藥，進行觀察拍照。

取生長了1～16 d的花蕾兩組，將樣品去萼片、花瓣，置于0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的2.5%的戊二醛溶液中抽真空固定后4℃過夜，處理好的樣品在EVO-LS10掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 小孢子發(fā)育過程觀察 本研究參考錢春桃等［12］方法進行染色體制片，并進行改良，較適于對不同發(fā)育時期的小孢子進行觀察。采集1 d到6 d的花蕾樣品，用改良卡諾液（1體積無水酒精 ∶3體積冰醋酸）固定24 h，用75%的酒精保存在4℃冰箱中備用。

用鑷子輕輕夾取少許花藥置于載玻片，并擠壓出花粉母細胞，去除雜質(zhì)，用醋酸洋紅染色和卡寶染色液染色，采用火焰微烤和45% 醋酸分色制片，使用Olympus（BX-51）顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 葫蘆花蕾形態(tài)觀察

從第一批葫蘆花蕾肉眼可辨直至第一批花蕾開花后，統(tǒng)計花蕾每天的生長值（表1），選取相對應大小的花蕾及剝?nèi)セㄝ?、花瓣后的花藥取樣拍照（圖1）?；ɡ偕L值記錄從第1 d標記到開花，歷時16 d；取樣從第1 d標記到花敗，歷時18 d。

表1 葫蘆花蕾各時期生長值Table 1 The grow th values of the groud buds

表1可知，花蕾在前期（第1～13 d）生長勢較緩慢，待到14 d與15 d時生長迅速，開花前一天生長值是開花前兩天生長值的3倍。由圖1可見，在觀察期第1 d，花蕾緊貼葉腋處皺縮，著生濃密白色絨毛的萼片將花冠緊緊包裹，去花瓣與萼片后，花藥相對小且干癟，整體呈深綠色。發(fā)育第2 d、3 d后，花蕾與花藥均漸大并相對飽滿，深綠色變淺，萼片開始展開。隨著發(fā)育進程的推進，花蕾似鐘形均勻緩慢生長，花萼逐漸開展，花冠長勢超過花萼，花蕾與花藥顏色由深綠色經(jīng)過淺綠色、黃色，最終變成白色，并準備開放。

圖1 葫蘆各時期花器形態(tài)Fig.1 Gourd bud morphology at each developmental phase

2.2 葫蘆花藥發(fā)育過程

葫蘆花是單性花，通過掃描電鏡的觀察，葫蘆花為雄蕊之間花絲部分合生在一起，雄蕊群通過花絲合生成3個單體，花藥相互分離，形成一個球體狀的聚藥雄蕊（圖2A、圖2B）。葫蘆科部分植物為雄蕊5個，這3個單體是5個雄蕊通過兩兩合生、另一個離生而形成的三體雄蕊［13］。通過顯微掃描可以觀察到葫蘆花雄蕊確實是由3個單體組成，其中合生的兩個單體（圖2C）體積明顯比離生的單體（圖2D）大一倍。3個單體緊密簇生形成不規(guī)則的球體，花藥呈管狀環(huán)繞，位于合生花絲形成的肉質(zhì)聯(lián)合體頂端（圖2A、圖2B）。

在花芽與葉芽可以肉眼分辨后1 d或2 d，葫蘆花雄蕊的花粉管干癟，發(fā)育3 d或4 d后花粉管逐漸飽滿，花藥表皮有一條明顯的淺溝（圖2E），隨著發(fā)育，淺溝加深，其他方面沒有明顯差異。發(fā)育至第14 d時，花瓣從青色轉(zhuǎn)為白色，花藥的淺溝開始開裂?；ㄋ幊墒旌?，花蕾開放時，花藥在淺溝處縱裂，花粉粒沿裂縫散出，布滿花粉管外圍（圖 2F、圖2G）。發(fā)育到第18 d時，花蕾開敗，花粉粒從著生處散落，僅留下開裂的花粉管（圖2H）。

2.3 葫蘆小孢子配子體的發(fā)育途徑

成熟小孢子的發(fā)育途徑為：四分體時期-單核小孢子早期-單核小孢子中期-單核靠邊期-二細胞花粉早期-二細胞花粉中期-二細胞花粉晚期-成熟花粉時期（圖3）。

經(jīng)細胞學染色結(jié)果顯示：在葫蘆品種相生FMT發(fā)育1 d的樣品中（圖1），花蕾大小小于5.9 mm時小孢子還處于母細胞或者更前期；花蕾大小在5.9～6.2mm時，小孢子基本處于四分體時期（圖3A）；在發(fā)育2 d的樣品中（圖1），花蕾大小在6.3～6.7 mm時，小孢子基本處于單核期，此時胼胝質(zhì)破裂，小孢子從四分體中釋放出來（圖3B），隨著大液泡的形成，細胞內(nèi)細胞核從細胞中央被擠向細胞壁較厚的一側(cè)，即從小孢子單核早期經(jīng)過單核中期進入單核靠邊期（圖3C～圖3E）；在發(fā)育2～3 d的樣品中（圖1），花蕾大小在6.8～7.2 mm時小孢子基本處于二細胞期（圖3F～圖3H），可以看到第1次有絲分裂前后的多種狀態(tài)：其中一部分觀察不到染色的細胞核此時期為小孢子進入了第1次有絲分裂的間期，大部分為已經(jīng)完成第1次有絲分裂具有1個營養(yǎng)細胞和1個生殖細胞的二核期小孢子。營養(yǎng)細胞的體積大，靠近大液泡，生殖細胞體積小，貼近花粉壁。隨著小孢子繼續(xù)發(fā)育，生殖核會向細胞的中央遷移，從二細胞早期進入二細胞晚期。在大于7.2 mm的大花蕾中，大部分小孢子體積顯著變大變圓，可以看到擁有3個萌發(fā)孔和三股溝的成熟花粉粒（圖3I）。

圖2 花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Anther developmental structure

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)相關(guān)性分析花蕾大小在6.3～6.7 mm時，小孢子基本處于單核期，而在葫蘆植株頂芽生長點處肉眼可辨花芽與葉芽后1 d的花蕾，其大小為5.5～6.5mm；發(fā)育到第2 d時，花蕾長度為6.0～7.0 mm。經(jīng)觀察統(tǒng)計，花蕾大小在5.9～6.2 mm時，小孢子基本處于四分體時期；花蕾大小在6.3～6.7 mm時，小孢子基本處于單核期；花蕾大小在6.8～7.2 mm時，小孢子基本處于二細胞期。此時花蕾緊貼葉腋處皺縮著，著生濃密白色絨毛的萼片將花冠包裹，花瓣未露出花萼；去花瓣與萼片后，花藥相對小且干癟，整體呈深綠色。所以后期花藥與小孢子培養(yǎng)所需的小孢子單核靠邊期取樣時，應在可辨花芽與葉芽后發(fā)育1～2 d的花蕾中挑選大小為6.3～6.7 mm的花蕾用于培養(yǎng)。

2.4.2 小孢子發(fā)育時期與花藥結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

在觀察1 d、2 d時，掃描電鏡下葫蘆花蕾的合生花絲皺縮，外圍環(huán)繞的花粉管干癟有皺褶（圖2A和圖2C），對應了葫蘆花器觀察期1 d、2 d時外觀形態(tài)不飽滿，此時葫蘆小孢子多處于四分體到二核期。發(fā)育3 d、4 d后，小孢子逐漸發(fā)育成飽滿的成熟花粉粒，花粉管也趨于飽滿，花藥表皮有一條不明顯淺溝，隨著發(fā)育，淺溝加深（圖2E、圖2F）直至后期開裂散出成熟花粉。

圖3 葫蘆小孢子各發(fā)育階段的細胞學特征（×400）Fig.3 M orphological characteristics at each developmental stage of gourd m icrospore（×400）

3 討論

隨著單倍體育種技術(shù)的不斷成熟，花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)的優(yōu)勢日漸體現(xiàn)，在葫蘆花藥和小孢子培養(yǎng)誘導單倍體的過程中，確定小孢子發(fā)育時期與花蕾外部形態(tài)特征的對應關(guān)系對于花藥培養(yǎng)成功與否起著決定性的作用。通過對花粉染色制片觀察小孢子雄配子發(fā)育途徑細胞學特征，與其對應的花器外觀和花藥形態(tài)的相關(guān)性，得出結(jié)論：葫蘆小孢子雄配子體發(fā)育經(jīng)歷四分體時期、單核期和二核期后發(fā)育成為成熟花粉粒；在葫蘆植株頂芽生長點肉眼可辨別花芽和葉芽的1 d、2 d時，大小為6.3～6.7 mm的不飽滿花蕾適宜做培養(yǎng)材料，此時花粉管干癟，花器整體呈深綠色。在植物花藥或小孢子培養(yǎng)過程中，取材時期對于培養(yǎng)成功與否起著決定性的作用。本試驗為鑒定小孢子發(fā)育時期，快速找到小孢子單核期提供了簡易的方法。

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（責任編輯：袁 偉）

Relationship between m icrospore development period and flower organ morphology of bottle gourd（Lagenaria siceraria）

HU Xue-dan1，2， ZHANG Man1， HOU Qian1， XU Jin-hua1， LIU Guang1， YAO Xie-feng1， LIPing-fang1，CHEN Xue-hao2， YANG Xing-ping1
（1.Institute of Vegetable，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China；2.College ofHorticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Researches on the relationship between the gourdmicrospore developmentand flower organmorphologywere carried out to find a way to identify the microspore developmental period quickly and acccurately through observing bottle gourd flower appearance and anthermicrostructure.The results showed thatbottle gourdmicrosporewent through tetrad stage，uninucleate stage，binucleate stage，and finally developed to themature pollen grain.In the growth of plant bud，the flower bud and leaf bud could be differentiated in the first one or two days.The bud size in 6.3-6.7mm weremostly at the uninucleate stage ofmicrospore.At thismoment，the staminal tubeswere shrivelled and suitable for anther andmicrospore culture.In the 3rd or 4th day，the tubes were full，and themicrospore had basically grown intomature pollen grain.The develpoment period of gourd microspore could be determined by themorphology and size of the buds，which helps to define the standard of bud selection corresponding to the optimal stage of anther and microspore culture.

gourd；microspore；developmental stage；flower organ morphology

S642.9

A

1000-4440（2015）06-1407-06

胡雪丹，張 曼，侯 茜，等.葫蘆小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)相關(guān)性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（6）：1407-1412.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.06.033

2015-05-25

國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-NO.8）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃項目（BE2012323）

胡雪丹（1990-），女，江蘇泰州人，碩士研究生，研究方向為葫蘆游離小孢子培養(yǎng)。（E-mail）276518157＠qq.com

羊杏平，（E-mail）xingping＠jaas.ac.cn