錫林高娃， 薛曉陽， 吳金花， 布日額

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028400;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028400)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種 重要的人畜共患致病菌。人感染該菌可引發(fā)肺炎、盆腔炎、心包炎、產(chǎn)褥感染等，甚至是膿毒癥、敗血癥等全身性感染［1-2］。在動(dòng)物則引發(fā)奶牛乳腺炎，其檢出率可達(dá)到30%以上［3］，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量減低，乳中含有致病菌及其毒素，乳腺纖維化和奶牛淘汰等后果，從而給奶牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失［4-7］。目前我國(guó)奶牛乳腺炎尚未引起重視，缺乏快速檢測(cè)預(yù)警機(jī)制和技術(shù)支持［8］。因此研究和建立牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的快速分子檢測(cè)方法，對(duì)于該病菌的預(yù)警性監(jiān)測(cè)、溯源和傳播機(jī)制研究等都具有十分重要意義。

致病性金黃色葡萄球菌彈性纖維結(jié)合蛋白(EBPS)是其致病機(jī)制中的關(guān)鍵因子，該致病菌主要是通過其菌體表面的EBPS與宿主的細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合，繼而引起宿主感染［9］。EBPS基因組全長(zhǎng)基因序列含有1 486 bp，所編碼的EBPS蛋白質(zhì)分為N端、3個(gè)疏水區(qū)和C端，其中N端的59個(gè)氨基酸全部暴露在細(xì)胞膜外，在侵染宿主的過程中起配體作用，與金黃色葡萄球菌的致病性密切有關(guān)［10］。因此，我們選擇該基因N端的粘附配體序列作為靶標(biāo)片段，通過對(duì)靶片段序列的外源性表達(dá)，制備相應(yīng)抗體，為研究其致病機(jī)制以及建立快速分子檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、血清及動(dòng)物 pET30a-nEBPS重組質(zhì)粒由內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所構(gòu)建并提供，表達(dá)宿主菌株BL21(DE3)、牛源金黃色葡萄球菌陽性血清均由內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所保存。新西蘭白兔購(gòu)自青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗牛IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品，多功能DNA純化回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、高純度質(zhì)粒小量制備試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，雙色預(yù)染蛋白Marker為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。HiTraPTM抗體純化柱購(gòu)自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 pET30a-nEBPS的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET30anEBPS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，以終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)菌對(duì)照。誘導(dǎo)6 h后，收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2 nEBPS重組蛋白的純化 超聲波破碎6 h的菌體，收集離心后的上清液和沉淀進(jìn)行 SDSPAGE電泳分析，鑒定目的蛋白質(zhì)的表達(dá)形式。對(duì)以可溶形式表達(dá)的重組蛋白按Ni NTA Purification System使用說明進(jìn)行純化。

1.2.3 nEBPS重組蛋白的鑒定 純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，以5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，以牛源金黃色葡萄球菌陽性血清(1∶100稀釋)為一抗，37℃孵育1 h，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗牛IgG抗體(1∶5 000稀釋)為二抗，37℃孵育50 min，在二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液中顯色。

1.2.4 兔抗nEBPS蛋白多克隆抗體的制備 取純化的nEBPS蛋白2 mg，與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，背部皮下多點(diǎn)免疫新西蘭白兔，14 d后取純化的蛋白質(zhì)與弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行第2次免疫，14 d后進(jìn)行第3次免疫，14 d后注射不加佐劑的抗原2 mg進(jìn)行加強(qiáng)免疫，7 d后經(jīng)心臟采血，分離血清備用。每次免疫前均采集血清，間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)。

1.2.5 兔抗nEBPS蛋白抗體效價(jià)的測(cè)定

1.2.5.1 間接ELISA方法 以純化的nEBPS重組蛋白包被酶標(biāo)板，以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照血清，將抗nEBPS兔血清和陰性對(duì)照血清同時(shí)進(jìn)行1∶100～1∶51 200倍比稀釋，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，以免疫血清OD值與陰性對(duì)照血清OD值的比值大于2.1判為陽性。

1.2.5.2 凝集試驗(yàn) 將抗nEBPS兔血清進(jìn)行1∶2～1∶512倍比稀釋，分別與同一金黃色葡萄球菌菌體進(jìn)行凝集試驗(yàn)，同時(shí)以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照，判定能夠凝集的最高稀釋度。

1.2.6 多克隆血清的純化 將兔抗nEBPS蛋白多克隆血清8倍稀釋樣品以12 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。參照HiTraPTM抗體純化柱子說明書進(jìn)行純化。平衡柱子:流速1 ml/min，用5～10倍柱體積的平衡液平衡柱子;上樣:流速1 ml/min，上樣后用5～10倍柱體積的上樣緩沖液洗雜，流速1 ml/min;洗脫:流速1.5 ml/min，用洗脫緩沖液直接洗脫;調(diào)pH值:將洗脫樣品用中和緩沖液調(diào)pH值為中性備用。

1.2.7 純化抗體的鑒定 采用Bradford法測(cè)定純化后抗體的濃度。取純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，檢測(cè)純度。間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，以純化的nEBPS重組蛋白包被酶標(biāo)板，以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照血清，檢測(cè)純化后的兔抗nEBPS兔血清效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET30a-nEBPS的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

以終濃度為0.8 mmol/L的 IPTG對(duì) pET30anEBPS誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，超聲波破碎細(xì)胞，經(jīng)SDSPAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)大部分以可溶形式表達(dá)(圖1)。采用鎳離子親和層析法純化蛋白質(zhì)，Bradford法測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度為2.16 mg/ml。

圖1 nEBPS重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein nEBPS

2.2 nEBPS重組蛋白的活性

取純化的nEBPS重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，與牛源金黃色葡萄球菌陽性血清作用。結(jié)果表明，該nEBPS蛋白能與牛源金黃色葡萄球菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而空載體菌表達(dá)蛋白與牛源金黃色葡萄球菌陽性血清不發(fā)生反應(yīng)(圖2)。

2.3 兔抗nEBPS蛋白多克隆抗體的效價(jià)

純化后的nEBPS重組蛋白經(jīng)過4次免疫新西蘭白兔后，血清效價(jià)已明顯升高(圖3)。心臟采血分離血清，以間接ELISA和凝集試驗(yàn)測(cè)定最后分離的高免血清效價(jià)。結(jié)果表明，間接ELISA檢測(cè)到的最低效價(jià)達(dá)1∶25 600(圖4)，凝集試驗(yàn)測(cè)定的凝集效價(jià)達(dá)1∶128。

2.4 多克隆血清的純化及純化抗體的鑒定

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.2 Western blot of expressed products

圖3 間接ELISA檢測(cè)的抗nEBPS蛋白血清抗體增長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of anti-nEBPS antibodies by indirect ELISA

圖4 抗nEBPS蛋白的高免兔血清抗體間接ELISA檢測(cè)Fig.4 Antibody detection of rabbit serum immunized with nEBPS protein by indirect ELISA

利用HiTraPTM抗體純化柱子純化血清，收集處于峰值的純化抗體，共計(jì)10 ml(圖5)。用Bradford法測(cè)得純化抗體的濃度為1.5 mg/ml。兔多克隆抗體SDS-PAGE分析結(jié)果(圖6)顯示:IgG抗體是具有4條多肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其中2條較長(zhǎng)的為相對(duì)分子量較大的相同重鏈(H鏈約5.5×104)，2條較短的為相對(duì)分子量較小的相同輕鏈(L鏈約2.5× 104)。鏈間由二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成一個(gè)由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子，經(jīng)煮沸處理后重鏈、輕鏈分開，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明獲得了高純度的抗體，重鏈清晰可見，輕鏈有點(diǎn)彌散。間接ELISA檢測(cè)，純化抗體效價(jià)可達(dá)0.686(OD450值)，陰性血清對(duì)照為0.102，P/N值達(dá)6.7。

圖5 兔多克隆抗體紫外吸收曲線Fig.5 The UV absorption curve of rabbit polyclonal antibody

圖6 兔多克隆抗體SDS－PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analy sis of rabbit polyclonal antibody

3 討論

彈性蛋白是由細(xì)胞分泌的原彈性蛋白單體交錯(cuò)形成的，生理狀態(tài)下的彈性蛋白(如間質(zhì)膠原蛋白質(zhì)以及其他基質(zhì))是不溶的聚合纖維形式，原因可能是分泌的原彈性蛋白交錯(cuò)結(jié)構(gòu)中的賴氨酸迅速被賴氨酰氧化酶氧化所致［11］。彈性纖維結(jié)合蛋白(EBPS)在結(jié)構(gòu)上不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的彈性結(jié)合蛋白［12］。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染的絕大多數(shù)組織為富含彈性結(jié)合蛋白的組織，所以有研究者開始探索金黃色葡萄球菌是否是通過特異性結(jié)合彈性結(jié)合蛋白來感染宿主。本試驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌確實(shí)通過其表面分子量為4.5 ×104的EBPS蛋白結(jié)合到彈性結(jié)合蛋白的N-端結(jié)構(gòu)域上，該結(jié)構(gòu)域中并沒有VGVAPG六肽識(shí)別序列［13］，且結(jié)合位點(diǎn)與彈性纖維結(jié)合蛋白相關(guān)的極性C-末端也不相同，這就表明彈性蛋白中與EBPS結(jié)合的位點(diǎn)特異性是針對(duì)金黃色葡萄球菌的［14］。由此可以看出EBPS在金黃色葡萄球菌感染宿主的過程中，起到至關(guān)重要的作用。

內(nèi)蒙古自治區(qū)是中國(guó)乳品業(yè)主產(chǎn)區(qū)，奶牛乳腺炎的控制和原料乳致病菌的檢測(cè)對(duì)于保證乳品安全有著重要意義。本試驗(yàn)將乳源性致病性金黃色葡萄球菌EBPS基因編碼的膜表面蛋白質(zhì)在體外獲得高效表達(dá)，并研究其抗原性，為利用其高效表達(dá)蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物制備的高效亞單位抗體，研發(fā)檢測(cè)牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的快速、高效、特異檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)及民生意義，也具有巨大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值及潛在的市場(chǎng)前景。

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