王春雷， 趙憲坤， 高季平， 葉蘊(yùn)靈， 趙貝貝

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

蕓薹屬(Brassica)中有多種重要農(nóng)業(yè)及園藝作物，如油菜、白菜、甘藍(lán)等。根據(jù)禹氏三角原理，以及植物自身基因組特點(diǎn)，蕓薹屬可分為白菜(Brassica rapa)、甘藍(lán)(B.oleracea)和黑芥(B.nigra)3個(gè)基本種及甘藍(lán)型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)和埃塞爾比亞芥菜(B.carinata)3個(gè)復(fù)合種［1-2］。多數(shù)蕓薹屬野生種和部分蕓薹屬作物表現(xiàn)自交不親和性(Self-incompatibility，SI)［3-5］。

SI是顯花植物防止近親繁殖、促進(jìn)雜交、保持物種遺傳多樣性的一種典型機(jī)制。根據(jù)花器官形態(tài)有無差異，SI可分為異形自交不親和性(Hetermorphic SI)和同形自交不親和性(Homomorphic SI)。異形自交不親和性指同種植物花器官形態(tài)不止一種，SI與花器官的形態(tài)差異有關(guān);同形自交不親和性是指植物花器官形態(tài)相同，其自交不親和性由內(nèi)在的遺傳特征所控制。在這類植物中，自交不親和性絕大多數(shù)由1個(gè)基因座(S-locus)上的復(fù)等位基因控制，這個(gè)位點(diǎn)至少包括1個(gè)雌蕊S基因和1個(gè)雄蕊S基因。這些S基因產(chǎn)物決定了花粉在柱頭和花柱組織中的命運(yùn)(停止生長或完成受精)。依據(jù)花粉S基因表達(dá)時(shí)期和位置不同，又可將同形自交不親和性分為配子體型自交不親和性(Gametophytic SI，GSI)和孢子體型自交不親和性(Sporophytic SI，SSI)2類。GSI植物花粉的表現(xiàn)型由花粉本身單一基因型所決定，S等位基因中的一個(gè)基因與花粉所含S基因相同時(shí)，花柱內(nèi)花粉管的生長將被阻礙而不能受精、結(jié)實(shí)。茄科、薔薇科、罌粟科等SI屬于該類型［6］。SSI植物花粉的行為由產(chǎn)生花粉的植株(孢子體)的基因型所決定，S基因間存在上下位關(guān)系，因而花粉的基因型與表現(xiàn)型未必一致，十字花科、菊科等SI屬于該類型［7］。因此SSI相對(duì)于GSI更加復(fù)雜。

SSI相關(guān)研究主要以蕓薹屬植物為材料，目前取得一些成果，這些成果對(duì)于揭示蕓薹屬SI機(jī)理具有重要意義。本文對(duì)蕓薹屬SI相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 蕓薹屬SI決定因子

1.1 S位點(diǎn)糖蛋白

S位點(diǎn)糖蛋白基因SLG是被鑒定的第一個(gè)蕓薹屬S位點(diǎn)基因，該基因編碼一個(gè)堿性糖蛋白，并在柱頭特異表達(dá)。利用免疫化學(xué)法，首先從B.oleracea植株柱頭分離出該蛋白質(zhì)，由于該蛋白質(zhì)編碼基因與S位點(diǎn)緊密連鎖，所以該蛋白質(zhì)被命名為SLG［8］。隨后，在B.rapa植株柱頭同樣分離出該蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在成熟花柱中含量更高［9］。隨著SLG基因堿基序列被鑒定，人們發(fā)現(xiàn)SLG基因堿基序列在不同等位基因間呈高度多態(tài)性。這些特征符合SI雌蕊決定因子的要求，這使人們誤以為SLG可能就是蕓薹屬SI雌蕊決定因子。但是隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在一些蕓薹屬植株中，雖然SLG基因是失活的，但該植株依然表現(xiàn)為SI［10］。這說明SLG并不是SI雌蕊決定因子。但SLG的發(fā)現(xiàn)為雌蕊SI決定因子最終鑒定奠定了基礎(chǔ)。

1.2 雌蕊決定因子

蕓薹屬SI雌蕊決定因子S受體激酶SRK是在SLG發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究獲得的［11］。在SLG被發(fā)現(xiàn)后，從玉米中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)植物類受體蛋白激酶ZmPK1，該激酶胞外受體結(jié)構(gòu)域與SLG高度相似［12］。這使人們推測(cè)在蕓薹屬S位點(diǎn)也存在類似激酶參與SI反應(yīng)。利用SLG基因堿基序列合成探針，通過基因組文庫篩選，成功獲得一個(gè)與SLG連鎖的，編碼包含激酶結(jié)構(gòu)域的基因［13］。該基因在柱頭乳突細(xì)胞中特異表達(dá)，并在開花時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大［14］，編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括3個(gè)主要部分:胞外域(也叫S域)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域。在不同S等位基因間，胞外域表現(xiàn)出高度多態(tài)性，其氨基酸序列歧異度能夠達(dá)到30%。在同一S位點(diǎn)中，SLG與SRK胞外域DNA序列相似度能達(dá)到90%以上，表現(xiàn)為高度同源［13，15-17］。當(dāng)SRK胞外域被 SLG替換后，植物表現(xiàn)為自交親和性(Self-compatibility，SC)［18］。

早先，人們并不能確定SRK和SLG中哪個(gè)是雌蕊SI決定因子，主要是因?yàn)閮烧逥NA序列高度相似，并且都在乳突細(xì)胞中特異表達(dá)，等位基因間都呈現(xiàn)高度多態(tài)性。通過基因沉默抑制SRK表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)SRK和 SLG表達(dá)都被抑制［19］。隨后，Takasaki等［20］將SRK-9基因轉(zhuǎn)入B.rapa植株，該植株能夠抑制S-9純合子植株花粉萌發(fā)和生長，而轉(zhuǎn)SLG-9基因植株卻不能抑制。此外，SLG編碼區(qū)DNA序列缺失的植株及S位點(diǎn)沒有SLG基因的植株都表現(xiàn)SI［16，21］。這些結(jié)果說明SRK就是蕓薹屬SI雌蕊決定因子。

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入SRK-9和SLG-9的B.rapa植株比只轉(zhuǎn)入SRK-9的植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的SI［20］。但是，轉(zhuǎn)入SRK-910和SLG-910的B.napus卻沒有觀察到相似結(jié)果［22］。說明雖然SLG不是SI反應(yīng)必要因子，但是它能夠強(qiáng)化一些S基因型植株的SI。Dixit等［23］發(fā)現(xiàn)，在2個(gè)自交親和的B.oleracea植株中，SLG表達(dá)量很低，而SRK雖然能夠正常表達(dá)，但是不能形成SRK蛋白。

1.3 花粉決定因子

蕓薹屬SI花粉決定因子為富含半胱氨酸蛋白(S-locus cysteine-rich protein，SCR)/(S-locus protein 11，SP11)，是雌蕊SI決定因子SRK的配體［24-25］。SCR/SP11分子量較小，由50個(gè)左右氨基酸組成，在花藥絨氈層特異表達(dá)。隨著花粉發(fā)育、絨氈層降解，SCR/SP11附著在花粉表面。在不同等位基因之間，SCR/SP11脫氧核苷酸序列呈現(xiàn)高度多態(tài)性，不同等位基因DNA序列相似度小于50%［24，26-29］。同時(shí)，不同等位基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間，也存在一些保守氨基酸序列，例如，8個(gè)高度保守的半胱氨酸序列，第1、2半胱氨酸之間的甘氨酸序列，以及第3、4半胱氨酸之間的芳香族氨基酸殘基等［24，26，29-30］。

1.4 SCR/SP11等位基因間顯隱性關(guān)系

由于SCR/SP11在孢子體絨氈層細(xì)胞中形成，植株攜帶的1對(duì)復(fù)等位基因SCR/SP11存在顯隱性關(guān)系。根據(jù)SCR/SP11等位基因顯隱性關(guān)系，可以把SCR/SP11基因分成2類:花粉顯性S基因型(Class I)和花粉隱性S基因型(Class II)。一般情況下，Class I基因相對(duì)Class II基因表現(xiàn)為顯性［31-32］。Class I等位基因之間，表現(xiàn)為共顯性或者顯隱性關(guān)系。Class II等位基因之間存在顯隱性關(guān)系［33］。在含有Class I和Class II的SCR/SP11雜合子植株中，Class I的SCR/SP11能夠在植株絨氈層中正常表達(dá)，而Class II的SCR/SP11卻無法正常表達(dá);但是在Class II的SCR/SP11純合子植株中，這些Class II的SCR/SP11是能夠表達(dá)的。這說明Class II SCR/ SP11的表達(dá)受到Class I SCR/SP11抑制。研究發(fā)現(xiàn)，在攜帶2個(gè)不同Class II SCR/SP11的雜合子植株中，被抑制表達(dá)的SCR/SP11基因啟動(dòng)子區(qū)域在絨氈層中發(fā)生高度甲基化［34］，但是該甲級(jí)化形成原理尚不清楚;在同時(shí)攜帶Class I和Class II SCR/ SP11雜合子植株中，被抑制表達(dá)Class II SCR/SP11基因啟動(dòng)子區(qū)域在絨氈層細(xì)胞中也發(fā)生高度甲基化，并且Class I S位點(diǎn)序列能夠形成一個(gè)sRNA，該sRNA負(fù)責(zé)調(diào)控該序列甲基化的發(fā)生，并且該sRNA序列與 Class II SCR/SP11基因啟動(dòng)子區(qū)域一段DNA序列高度同源［35］。這說明在不同類型雜合子中，SCR/SP11表達(dá)調(diào)控機(jī)理存在差異。

2 蕓薹屬其他參與SI反應(yīng)的因子

2.1 M位點(diǎn)蛋白激酶

M位點(diǎn)蛋白激酶(MLPK)是一個(gè)膜錨定胞質(zhì)蛋白激酶，是利用經(jīng)典遺傳學(xué)方法分析 SC品種“Yellow Sarson”所獲得［36］。MLPK基因編碼蛋白質(zhì)具有2種異構(gòu)體，且都能與SRK作用［37］。在mlpk突變體植株乳突細(xì)胞中轉(zhuǎn)入野生型MLPK基因，能夠使這些乳突細(xì)胞重新抑制自身花粉萌發(fā)和生長，表現(xiàn)為SI。一般認(rèn)為，在自交授粉反應(yīng)中，MLPK與SRK直接作用，形成MLPK-SRK受體，傳遞SI反應(yīng)［37］。將反義MLPK基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)也能引起自交親和性突變［38］。但是，在轉(zhuǎn)入野生型MLPK基因的mlpk突變體植株中并沒有發(fā)現(xiàn)MLPK與SRK直接作用的證據(jù)，說明兩者作用關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

2.2 臂展重復(fù)蛋白

臂展重復(fù)蛋白(Armadillo repeat containing protein，ARC1)是通過酵母雙雜篩選獲得的，一個(gè)能與SRK相互作用，并能夠被SRK磷酸化的蛋白質(zhì)［39］。ARC1含有U-box和ARM repeat 2個(gè)結(jié)構(gòu)域。ARC1基因在柱頭中特異表達(dá)，當(dāng)ARC1表達(dá)被抑制后，能夠部分打破SI［40］，說明ARC1是SI正向調(diào)控因子。ARC1具有E3泛素化連接酶活性，在SI反應(yīng)中，ARC1受到MLPK與SRK復(fù)合體作用，被磷酸化后激活泛素化途徑，降解花粉萌發(fā)生長所需要的蛋白質(zhì)，抑制花粉萌發(fā)［41］。

2.3 Exo70A1

Exo70A1是在尋找ARC1的作用底物時(shí)，利用酵母雙雜篩選系統(tǒng)獲得的［42］。Exo70A1定位在柱頭乳突細(xì)胞質(zhì)膜上，過量表達(dá)Exo70A1能夠部分打破SI，而抑制Exo70A1表達(dá)能夠抑制花粉粘附、水合，從而使花粉不能萌發(fā)。由于Exo70A1是Exocyst復(fù)合體的一部分，該復(fù)合體主要是在動(dòng)物和酵母極性分泌中起作用［43-44］，這說明Exo70A1參與了親和授粉后乳突細(xì)胞分泌作用。在SI反應(yīng)中，SRK被激活，并引起 ARC1磷酸化，激發(fā)泛素化途徑降解Exo70A1，導(dǎo)致不親和花粉不能水合和萌發(fā)［42，45］。

3 蕓薹屬SI反應(yīng)細(xì)胞水平上的變化

SI涉及花粉和花柱的相互識(shí)別，其最終結(jié)果是導(dǎo)致不親和花粉不能萌發(fā)。水合是花粉萌發(fā)的早期活動(dòng)。在SI反應(yīng)中，阻止乳突細(xì)胞向花粉提供水分是抑制花粉萌發(fā)的第一步［46］。Iwano等［47］利用GFP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在親和授粉時(shí)花粉與乳突細(xì)胞接觸部位微絲明顯變多，不親和授粉時(shí)花粉與乳突細(xì)胞接觸部位微絲發(fā)生重排。此外，親和授粉時(shí)乳突細(xì)胞頂端微絲聚合，不親和授粉時(shí)乳突細(xì)胞頂端微絲則減少。微絲解聚劑細(xì)胞松弛素D能夠明顯抑制親和花粉水合和萌發(fā)，進(jìn)一步說明微絲參與花粉水合過程。利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)親和授粉時(shí)乳突細(xì)胞頂端液泡朝花粉附著部位移動(dòng)重布，不親和授粉則會(huì)導(dǎo)致液泡破裂。這些結(jié)果說明不同授粉能夠引起乳突細(xì)胞微絲骨架發(fā)生不同變化，進(jìn)一步引起液泡位置發(fā)生改變，通過控制乳突細(xì)胞水分供給從而控制花粉水合［48］。Samuel等［49］研究了 SI反應(yīng)中花粉和乳突細(xì)胞微管變化情況，發(fā)現(xiàn)親和授粉后，微管網(wǎng)絡(luò)發(fā)生局部分解。這些研究結(jié)果對(duì)于我們認(rèn)清SI信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有重要意義。

4 擬南芥SI的相關(guān)研究

擬南芥屬于擬南芥屬，與蕓薹屬植物同屬十字花科，親緣關(guān)系較近。研究擬南芥SI機(jī)理，有助于揭示蕓薹屬SI機(jī)理。擬南芥是常用的模式植物，具有個(gè)體小、生活史短、易轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)。但是擬南芥是SC的，為了獲得 SI擬南芥植株，將琴葉擬南芥SP11/SCR和SRK基因克隆轉(zhuǎn)入擬南芥C24生態(tài)型后，使該植株成功獲得穩(wěn)定SI［50］。利用該SI系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)一些與蕓薹屬SI不一樣的現(xiàn)象。

在擬南芥中，AtAPK1b基因與蕓薹屬M(fèi)LPK基因高度同源，分布于擬南芥2號(hào)染色體上，其位置與B.rapa MLPK基因所在位置相近。但是抑制AtAPK1b基因表達(dá)后，并不能減弱擬南芥SP11/SCRSRK植株 SI表型，說明 AtAPK1b并不是擬南芥SP11/SCR-SRK植株SI反應(yīng)必須因子［51］。此外，比較擬南芥和琴葉擬南芥基因組發(fā)現(xiàn)，在擬南芥C24生態(tài)型中，只存在ARC1基因部分序列片段，并且在這些片段之間嵌有一些其他基因序列［51-52］。由于擬南芥C24生態(tài)型轉(zhuǎn)入SP11/SCR-SRK基因后能獲得穩(wěn)定SI，說明在擬南芥SI反應(yīng)中，也不需要ARC1蛋白參與［53-54］。同時(shí)，在擬南芥基因組還發(fā)現(xiàn)一個(gè)與B.napus ARC1高度同源的基因AtPUB17，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于植物U-Box家族，抑制該基因后同樣不影響擬南芥 SP11/SCR-SRK植株 SI表型［53］，進(jìn)一步說明ARC1蛋白不參與擬南芥SI反應(yīng)。此外，研究發(fā)現(xiàn)參與蕓薹屬SI反應(yīng)的Exo70A1同樣不參與擬南芥SI反應(yīng)。利用轉(zhuǎn)基因手段過量表達(dá)At Exo70A1后，擬南芥SP11/SCR-SRK植株SI表型沒有發(fā)生改變［51］。這說明蕓薹屬 SI反應(yīng)中MLPK-ARC1-Exo70A1級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能并沒有參與擬南芥SI反應(yīng)。這提示在擬南芥植物SI反應(yīng)中，可能存在其他路徑［55-56］。當(dāng)然，也不能排除在這些與蕓薹屬SI反應(yīng)因子基因高度同源的基因，具有不同的功能［51］。

將SP11/SCR-SRK基因轉(zhuǎn)入擬南芥Col-0生態(tài)型，植株只在成熟的花蕾和開花早期表現(xiàn)SI［54］。利用化學(xué)誘變的方法，從Col-0 SP11/SCR-SRK后代中篩選到具有穩(wěn)定SI表型的植株［57］。研究發(fā)現(xiàn)在該類具有穩(wěn)定SI表型植株中，RNA依賴型RNA聚合酶RDR6失活。RDR6主要在反式作用元件干擾RNAs(Trans-acting short interfering RNA，ta-siRNAs)形成過程中起作用。另外，ARGONAUTE7是RDR6下游調(diào)控因子，專門負(fù)責(zé)生長素反應(yīng)因子(Auxin response factor，ARF)的反式作用元件ta-siRNAs的形成。當(dāng) ARGONAUTE7失去功能后，Col-0 SP11/ SCR-SRK植株也表現(xiàn)出穩(wěn)定的型SI表［56］。利用轉(zhuǎn)基因方法在Col-0 SP11/SCR-SRK植株中過量表達(dá)ARF3基因也能使其獲得穩(wěn)定的SI表型［57］。這些研究結(jié)果表明，生長素參與了擬南芥SI反應(yīng)。

5 展望

近年來，蕓薹屬SI研究取得一系列重要進(jìn)展，對(duì)SI反應(yīng)基本路徑有了一定認(rèn)識(shí)。未來相關(guān)研究可能會(huì)集中在SCR/SP11顯隱性調(diào)控機(jī)制，SI識(shí)別后信號(hào)傳遞路徑，以及蕓薹屬和擬南芥屬SI是否具有相同信號(hào)傳遞路徑等方面。這些工作對(duì)進(jìn)一步揭示蕓薹屬SI調(diào)控機(jī)理具有重要作用。

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