宋麗青，劉必謙，王亞軍，周湘池

(寧波大學海洋學院應用海洋生物學教育部重點實驗室,浙江寧波315211)

氨基葡萄糖及其自然氧化產(chǎn)物抗氧化功能研究

宋麗青，劉必謙，王亞軍，周湘池

(寧波大學海洋學院應用海洋生物學教育部重點實驗室,浙江寧波315211)

以自制的小型單電滲析裝置于實驗室制備氨基葡萄糖。經(jīng)不同時間存放后氨基葡萄糖（Glucosam ine,GNH2）發(fā)生褐變反應，分別對無色、淡黃色、黑色的G-NH2進行抗氧化性實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G-NH2隨著存放時間的延長顏色加深，其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,6-Bis(diphenylphosphino)hexane,DPPH）清除能力大幅增強，5mg/m L時DPPH清除能力達到峰值97.09%；同樣其還原力也隨之增強，1mg/m L濃度的G-NH2還原鐵氰化鉀在700 nm波長下的吸光值由0.566上升到1.9698，是同濃度谷胱甘肽（Glutathione,GSH）相應值的2.8倍；而·OH清除能力隨著G-NH2顏色的加深急劇下降，且具有一定濃度依賴性，實驗濃度為5mg/m L時，無色G-NH2清除·OH能力為74.06%，淡黃色G-NH2清除率為16.46%，呈現(xiàn)黑色時已不具備·OH清除能力。

氨基葡萄糖;美拉德反應;變色;抗氧化性;自由基清除

美拉德反應（maillard reaction,MR）又稱為非酶褐變反應，由氨基化合物（蛋白質(zhì)或氨基酸等）和羰基化合物（還原糖等）之間發(fā)生經(jīng)過一系列復雜反應最終生成褐黑色物質(zhì)。美拉德反應過于復雜，反應機理、產(chǎn)物組成及其性質(zhì)未研究透徹,但已有報道，不同氨基化合物和羰基化合物類反應物結(jié)構(gòu)越復雜，產(chǎn)物相應越復雜［1-3］。

氨基葡萄糖(Glucosam ine，G-NH2)是甲殼素的最終水解產(chǎn)物，是一種天然的氨基單糖，幾乎分布于人體所有組織，參與構(gòu)造人體組織和細胞膜，是蛋白多糖大分子合成的中間物質(zhì)［4］。它是葡萄糖的一個羥基替代為氨基的化合物。已有研究表明，G-NH2具有廣泛的生理功能，在抗菌消炎、增強免疫力、抗腫瘤、傷口愈合以及食品保鮮等方面有著重要應用價值［5-8］。然而GNH2的性質(zhì)不穩(wěn)定，由于其是還原性糖類物質(zhì)，且?guī)в邪被?，容易受溫度、光照等環(huán)境影響自身發(fā)生美拉德反應，顏色由剛制備時的無色轉(zhuǎn)變成淡黃，最終加深變成黑色［9-11］。在常溫下，G-NH2單一物質(zhì)發(fā)生的美拉德反應，由于反應物的結(jié)構(gòu)和成分相對簡單，其美拉德反應產(chǎn)物組分也相對較少，成分相對明確。主要反應機理為分子內(nèi)羰氨反應、分子間脫水縮合和烯醇化反應，生成產(chǎn)物主要有羥甲基糠醛、吡嗪雜環(huán)、吡喃、呋喃、還原酮等［10-12］。

氨基葡萄糖（G-NH2）自然狀態(tài)下發(fā)生美拉德反應，顏色隨存放時間延長而加深，G-NH2溶液由最初的無色漸變成淡黃色、褐色直至黑色。本文研究了不同存放時間的G-NH2溶液的抗氧化能力的變化，以便更好地應用不同階段的G-NH2所具有的性質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

氨基葡萄糖（Glucosamine,G-NH2）以本實驗室自制的小型單電滲析槽實驗室制備。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,6-Bis(diphenylphosphino)hexane,DPPH)購自Sigma公司;維生素C（Vitam in C,VC）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、乙酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、過氧化氫等其它試劑均為化學分析純；氨基葡萄糖鹽酸鹽（DC級）由浙江金殼藥業(yè)有限公司提供。

1.2儀器與設(shè)備

自制小型單電滲析槽：用有機玻璃自制體積為100m L的長立方形電滲析槽，槽的一個側(cè)面為空，供裝陰離子交換膜。陰極位于槽內(nèi)，陽極在外。電極絲為鉑金絲。電源為寧波產(chǎn)DCPOWERSUPPLYDF1730SL3A。

T6型可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；3001型全波長掃描多功能酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；DK-S22電熱恒溫水浴箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電子天平，梅特勒-托利多公司；D-37520離心機，美國賽默飛世爾科技公司；IONSEPTM特種分離膜購自杭州埃爾環(huán)?？萍加邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 氨基葡萄糖制備

1)制備開始。將分離膜陰膜裝在槽的空出一側(cè)，并壓緊防滲漏。槽內(nèi)裝入20%的氨基葡萄糖鹽酸鹽飽和溶液，放入以自來水流水作為外液的容器中。保證電滲析低溫環(huán)境，在外液中定時更換冰袋。

2)制備終止。待內(nèi)液pH值9～10；銀離子濁度法檢測實驗樣液，未檢出氯離子。

此時槽內(nèi)外離子交換接近停止，終止電滲析。將內(nèi)液裝袋低溫儲藏或冷凍干燥成干粉末后冷藏保存。

1.3.2 樣品處理

配制10mg/m L氨基葡萄糖（Glucosam ine,G-NH2）溶液于磨口帶塞透明玻璃瓶中，放置于實驗室窗臺上，不避光。無色G-NH2：現(xiàn)制現(xiàn)用；淡黃色G-NH2：室溫30°左右，不避光放置20 d；黑色G-NH2：室溫30°左右，不避光放置6個月。

1.3.3 DPPH清除能力

取不同階段存放的氨基葡萄糖（Glucosamine,GNH2），分別配制濃度為0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mg/m L的G-NH2備用。以1mg/m L的維生素C（Vitam in C,VC）作為對照。取0.1m L樣品加入2×10-4mol/L的DPPH的乙醇溶液0.1m L，混勻，于常溫下避光反應30m in。使用酶標儀測定反應液在517 nm波長處的吸光值(Ai)。測定0.1m L 2×10-4mol/L的DPPH溶液和0.1m L無水乙醇混合物的吸光值(A0)及0.1m L樣品液和0.1m L無水乙醇混合物的吸光值(Aj)。清除率越大抗氧化性越好［13］。

DPPH清除率計算公式：

清除率=［A0-(Ai-Aj)］/A0×100%

1.3.4 還原力測定

取不同階段存放的G-NH2，分別配制濃度為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mg/m L的G-NH2和1mg/m L的谷胱甘肽（GSH）備用，以GSH為對照。取1m L樣品液于1m L pH值6.6的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，加入1 m L 1%鐵氰化鉀，混勻，50℃恒溫水浴20m in。迅速冷卻，加1m L 10%三氯乙酸，終止反應并離心(3000 r/ m in)10min，取上清液1m L，并加1m L ddH2O和0.2 m L 0.1%三氯化鐵，混合均勻，室溫靜置10min后取0.2m L于酶標板中，使用酶標儀測定700 nm波長處的吸光度，當所得吸光度越大，說明樣品的還原能力就越強［14］。

1.3.5·OH清除能力

取不同階段存放的G-NH2，分別配制濃度為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mg/m L的G-NH2和1mg/m L的維生素C（VC）備用，以VC為對照。以Fenton反應檢測樣品對·OH清除能力［15］。取0.15m L樣品液于0.5m L 3.75mmol/L鄰二氮菲溶液中，以pH值7.40磷酸緩沖液補至2m L，充分混勻后，依次加入0.5m L 3.75mmol/L硫酸亞鐵和0.5m L 0.03%過氧化氫溶液，于37℃恒溫水浴中反應60m in，測定536 nm波長處吸光值，記為A樣。0.5m L蒸餾水代替雙氧水組，測得536 nm吸光度記為A未。不加樣品液組得536 nm處吸光度，記為A損。

·OH清除率計算公式：

2 結(jié)果

2.1 DPPH清除能力

圖1 不同顏色G-NH2的DPPH清除能力Fig 1 The scavenging activitieson DPPH radicalsof differentcolorsw ith G-NH2

DPPH的乙醇溶液顯紫色，是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大吸收。當有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子由于被配對使其濃度減小而溶液顏色變淺，相應在517 nm波長處的吸光度變小。這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學計量關(guān)系，因而可用分光光度計進行定量分析［16］。不同顏色的G-NH2的DPPH自由基的清除作用如圖1所示。

由上圖可知G-NH2具有DPPH清除能力。淡黃色G-NH2比無色G-NH2的DPPH清除能力略微好一些，隨濃度0.25mg/m L到5mg/m L，清除率從29.45%上升到57.24%。而黑色G-NH2的DPPH清除能力大幅上升，隨濃度增大，0.25 mg/m L時清除率為62.37%，在2.5mg/m L達到96.05%，之后清除率趨于穩(wěn)定，最高為5 mg/m L G-NH2的DPPH清除能力是97.16%，高于1 mg/m LVC的DPPH清除率95.31%。說明G-NH2的非酶褐變反應隨時間的延長，能清除DPPH自由基的產(chǎn)物濃度增多強度增大。

2.2 還原力測定

還原能力的測定是以樣品是否為良好的電子供體為指標。鐵氰化鉀還原法是測定樣品總還原力的經(jīng)典方法。具有良好還原能力的樣品供應的電子不僅能使Fe3+還原成Fe2+，還可以與自由基反應，使之成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應。反應液在700 nm處吸光值越大表明樣品的還原力越強［17］。不同顏色的G-NH2還原能力如圖2所示。

圖2 不同顏色G-NH2的還原能力Fig 2 The reducing powerof differentcolorsof G-NH2

由上圖可知G-NH2具有較好的還原能力。淡黃色G-NH2還原能力隨濃度增大而提高，在3mg/m L質(zhì)量濃度后還原能力上升趨緩。黑色G-NH2的還原能力在低濃度時有一個緩上升趨勢，2.5mg/m LG-NH2濃度下，700 nm波長的吸光值達2.1277，接著趨于下降。在3mg/m L的濃度位置黑色和淡黃色G-NH2還原能力一致。1mg/m L濃度G-NH2在變成黑色后還原能力是同濃度GSH的2.8倍。G-NH2褐變反應產(chǎn)物還原力主要來源于還原酮類物質(zhì)，隨著反應時間增加，還原酮類物質(zhì)積累增多，還原能力增強；反應時間進一步增加，還原性物質(zhì)分解［18］。

2.3·OH自由基清除能力

羥基自由基(·OH)清除率能有效反映物質(zhì)抗氧化能力。在其氧原子上含有一個未配對電子，具有很強的得電子能力。在過渡金屬離子催化作用下，過氧化氫可發(fā)生均裂產(chǎn)生羥自由基(·OH)［19］，反應式如下:

圖3 不同顏色G-NH2的·OH清除能力Fig 3 The scavenging activitieson·OH radicalsof differentcolorsof G-NH2

由圖3可知剛制備的無色G-NH2具有較好的·OH自由基清除能力，且隨著G-NH2濃度的增大，·OH自由基清除能力增強，最高達74.06%。在3mg/m L濃度時與1mg/m l VC的·OH清除能力一致。但是剛制備的無色G-NH2在常溫不避光環(huán)境下放置后，隨著時間增長，G-NH2自身發(fā)生相應美拉德反應，淡黃色G-NH2的·OH自由基清除能力急劇下降。變成黑色的G-NH2已經(jīng)不具備·OH自由基清除能力。

3 討論

3.1 受試條件

氨基葡萄糖非酶褐變反應變色前后不同階段產(chǎn)物的抗氧化能力產(chǎn)生了變化。其機理十分復雜，褐變程度與溫度、pH值、加熱時間、還原劑等條件密切相關(guān)，不管是用于食品保鮮還是抗氧化性等方面，G-NH2在常溫不避光環(huán)境下受試最為合理。

3.2 G-NH2美拉德反應機理

G-NH2是葡萄糖2號位羥基替換為氨基的一種化合物，分子式C6H13NO5，分子量為179。它自身由于含有氨基、環(huán)氧基以及多個羥基而性質(zhì)活潑，新鮮制備G-NH2具備一定抗氧化能力。另一方面，正是由于其為還原性糖類，且?guī)в邪被伦陨砗苋菀装l(fā)生美拉德非酶褐變反應，使得自身原本的結(jié)構(gòu)改變從而相應的性質(zhì)也改變。

美拉德反應是一個極其復雜的過程，通常被分為初級、中級與高級3個不同程度的階段［2］。本研究的G-NH2美拉德反應可能發(fā)生在G-NH2分子之間或者GNH2自身作為糖胺直接進入美拉德反應的高級反應階段。根據(jù)常規(guī)氨基酸和還原性糖的美拉德反應機理推斷總結(jié)G-NH2美拉德反應基本路線如圖4［11,20-22］。

圖4 氨基葡萄糖美拉德反應基本框架Fig 4 Thebasic framework of G-NH2maillard reaction

目前已有研究較為認可的G-NH2美拉德反應為分子內(nèi)羰胺縮合、反醇醛縮合和分子間脫水縮合、烯醇化反應。氨基葡萄糖和葡萄糖一樣有鏈式結(jié)構(gòu)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此以鏈式結(jié)構(gòu)作圖。見圖5和圖6［21-23］。

圖5 氨基葡萄糖分子內(nèi)美拉德反應Fig 5 G-NH2intramolecularmaillard reaction

圖6 氨基葡萄糖分子間美拉德反應Fig 6 G-NH2intermolecularmaillard reaction

3.3 DPPH清除能力和還原力變化

實驗結(jié)果顯示，G-NH2在室溫不避光環(huán)境下放置，隨著時間的增長，美拉德反應的深入，DPPH清除能力和還原能力趨于增強。羰氨縮合、Amadori/Heyns重排形成醛糖、還原酮或者抗氧化肽片段，使得DPPH清除能力和還原能力的提高。還原酮物質(zhì)通過提供電子來破壞自由基鏈式反應，它可以與一些過氧化物的前體物反應阻止過氧化物的生成，從而達到抗氧化的目的［24］。還原酮、不飽和醛等產(chǎn)物擁有比G-NH2自身更好的清除自由基，阻斷自由基連鎖反應的能力，使得DPPH清除能力和還原能力提高。Yu等［25］人分析了葡萄糖-酪氨酸-組氨酸體系生成的美拉德反應產(chǎn)物組分，其中包括大量揮發(fā)性的呋喃酮、吡喃酮、烯酮、醛類、吡嗪等物質(zhì)以及酚類物質(zhì)，指出該產(chǎn)物的抗氧化性與產(chǎn)物中的酚類、還原性酮類濃度有關(guān)。

還原力測定實驗中，黑色G-NH2在2.5mg/m L濃度下，700 nm波長的吸光值達2.1277，接著趨于緩慢下降。Jun等［22］將氨基葡萄糖進行美拉德反應，100℃下加熱2 h，降解產(chǎn)物中確證有2-（四羥基丁基）-5-（3,4-二羥基-1-反式-正丁巴比妥）-吡嗪，而在40℃實驗時未檢出該物質(zhì)。同理，黑色高濃度G-NH2還原力趨于下降可能是因為鐵氰化鉀還原法實驗需在高溫50℃恒溫水浴20min，隨濃度增高，黑色G-NH2發(fā)生更進一步的復雜反應，還原酮等小分子降解、烯醇化或者醇醛縮合最終聚合生成大分子褐色類黑精，使得高濃度GNH2的還原能力下降，亦或50℃水浴下產(chǎn)物成分中生成了一些其他物質(zhì)抑制了還原性物質(zhì)的還原能力［20］。

3.4·OH清除能力下降

在·OH清除能力測定結(jié)果中，反應物G-NH2本身具有很強的·OH清除能力，且其能力具有濃度依賴性，隨著G-NH2的褐色反應的加深，其清除能力下降。本實驗結(jié)果與唐杰等以氨基葡萄糖美拉德反應產(chǎn)物作為研究的結(jié)果一致。Remko等［26］和郭靜［27］對G-NH2進行量子化學研究表明G-NH2結(jié)構(gòu)中-NH2官能團是最活潑的，它與鄰位的羥基由于電子的相互作用，十分容易發(fā)生親核反應。在G-NH2美拉德反應中，游離氨基在堿性條件存在，隨著反應進行pH值減小，當pH≤4時，氨基質(zhì)子化，其反應活性降低［28-29］。從本實驗結(jié)果看，G-NH2的·OH清除能力，在無色時最強，變黃色時大量下降，到黑色就完全失去了·OH清除能力。這一現(xiàn)象表明正是G-NH2本身具有很強的·OH清除能力，因為顏色逐漸變深意味著越來越多的G-NH2因發(fā)生美拉德反應而減少，其活性氨基含量下降，這種能力也隨之下降直至完全消失。與葡萄糖相比，G-NH2多了2位上的氨基，正是這個差異導致G-NH2具有了·OH清除能力［30］。游離氨基清除·OH自由基化學式：

項惠丹等［31］和Yoshimura等［32］以蛋白質(zhì)/氨基酸與還原糖類美拉德產(chǎn)物進行·OH自由基清除實驗結(jié)果為隨反應時間延長，產(chǎn)物的·OH自由基清除能力提高。進一步說明了本實驗G-NH2自身褐變產(chǎn)物與蛋白質(zhì)或氨基酸與還原糖類反應生成的產(chǎn)物有很大的區(qū)別。氨基葡萄糖單糖自身褐變反應產(chǎn)物對比于其他學者用蛋白質(zhì)或氨基酸與還原性糖類的反應產(chǎn)物，其中的組分相對較少，缺少清除·OH自由基的物質(zhì)或者因某種組分的存在而抑制了對·OH自由基的清除。

4 結(jié)論

1）雖然G-NH2因褐變失去清除·OH自由基的能力，但褐變產(chǎn)物卻獲得了新的、較強的還原能力和DPPH清除能力。而后兩種性能，也是抗氧化、保健類物質(zhì)所需要的優(yōu)良性能。所以G-NH2及其自然氧化物，分別具有不同的功能，都具有較好應用前景。

2）G-NH2易發(fā)生褐變，因而純度較高的G-NH2比較難以制備。本實驗自制電滲析器適用于實驗室規(guī)模制備G-NH2。由于制備過程中容易觀察和控制電滲析條件，產(chǎn)物不需要再處理就可以直接保存，有效防止了褐變發(fā)生。液體G-NH2可以在普通冰箱冷凍室保存幾年不發(fā)生褐變。固體G-NH2在真空、低溫條件下，目前保存一年以上也沒有發(fā)生褐變。

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G lucosam ineantioxidant function and it’snatural oxidation products

SONG Li-qing,LIU Bi-qian,WANGYa-jun,ZHOU Xiang-chi

(Key Laboratory ofApplied Marine Biotechnology ofM inistry of Education,SchoolofMarine Sciences, Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Glucosam ine was prepared by m initype electrodialyzer designed and produced in laboratory.Natural oxidation products of glucosam inewere prepared by storing G-NH2in the same environmentw ith differentperiods of time.The reaction changed G-NH2from colorless to yellow,even black.Antioxidant experiment results suggested that G-NH2’s ability of scavenging the DPPH free radicals increased over time and reached to 97.01%at the concentration of 5mg/m L.Its ability of reducing was strengthened.With the concentration of 1mg/m L,A700nm wavelength absorbance value increased from 0.566 to 1.9698,which was 2.8 times of thatof the same concentration of GSH.However,the scavenging activities of hydroxyl free radical fell sharply w ith the deepening of G-NH2color,in a concentration dependentmanner.The scavenging activities of hydroxyl free radical of colorless G-NH2at 5mg/m L was 74.06%,the pale yellow’swas16.46%,theblack’shad no function.

glucosamine;maillard reaction;discoloration;antioxidant function;radicalscavenging

TS201.2

A

2095－1736（2015）03－0025－05

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.025

2014-09-26；

2014-11-24

浙江省重大科研社會發(fā)展資助項目（2004C13037號）;寧波市科技計劃項目（2006B100069)

宋麗青，碩士研究生,主要從事氨基葡萄糖應用開發(fā)；

劉必謙,博士,研究員,主要研究方向為生物資源開發(fā)利用和現(xiàn)代生物技術(shù)，E-mail:lbqhy@nbu.edu.cn。