吳雁雯，張金池

（南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇省水土保持與生態(tài)修復(fù)重點實驗室，江蘇南京210037）

微生物碳酸酐酶在巖溶系統(tǒng)碳循環(huán)中的作用與應(yīng)用研究進(jìn)展

吳雁雯，張金池

（南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇省水土保持與生態(tài)修復(fù)重點實驗室，江蘇南京210037）

巖溶動力系統(tǒng)是一個三相不平衡開放系統(tǒng)，該系統(tǒng)在由生物圈主導(dǎo)的四圈層間進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)與能量流動，以CO2-H2O-CaCO3循環(huán)為主進(jìn)而對全球碳循環(huán)起到推動作用。碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)是一種以Zn為活動中心的金屬酶，在微生物中廣泛存在，通過催化CO2的水合反應(yīng)對巖溶動力系統(tǒng)中的碳循環(huán)起到驅(qū)動作用。綜述了微生物碳酸酐酶結(jié)構(gòu)與功能的研究歷程，系統(tǒng)闡述了該酶對巖溶動力系統(tǒng)碳循環(huán)的重要驅(qū)動作用，并結(jié)合化工業(yè)上對該酶開發(fā)應(yīng)用的相關(guān)成果，為破壞山體恢復(fù)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展提供新思路。

微生物碳酸酐酶；巖溶動力系統(tǒng)；碳循環(huán)；破壞山體恢復(fù)

巖溶生態(tài)系統(tǒng)是地球表層系統(tǒng)的重要組成部分，全球巖溶面積占陸地面積的12%。中國巖溶地區(qū)分布廣泛，發(fā)育成熟，類型多樣，該類型地區(qū)常見土壤遭受嚴(yán)重侵蝕，巖石裸露，植被難以生長等極端表現(xiàn)。

生物是地球表層系統(tǒng)中最為活躍的地質(zhì)營力之一，研究發(fā)現(xiàn)，通過以碳循環(huán)為主的作用過程，生物圈在地球表層系統(tǒng)中具有捕獲、賦存及轉(zhuǎn)化太陽能，驅(qū)動表層物質(zhì)與能量循環(huán)，引發(fā)包括巖溶作用在內(nèi)的各種表層地質(zhì)作用。隨著生物巖溶作用研究的不斷深入，張捷等［1］探究了地表與土壤中細(xì)菌、真菌對巖溶侵蝕過程的影響及其對CaCO3沉淀的促進(jìn)作用，并對研究結(jié)果作了初步探討和總結(jié)。通過分析，微生物在代謝過程中產(chǎn)生的有機酸及相關(guān)酶類可加快石灰?guī)r的溶蝕速率［2］。在眾多酶類中，微生物所產(chǎn)的碳酸酐酶已逐漸成為近年來研究的熱點。

自碳酸酐酶于1963年在Neisseria Sicca中被首次確定存在以來，該酶對石灰?guī)r的溶解作用逐漸引起學(xué)者關(guān)注，劉再華［3］以牛碳酸酐酶為材料的研究發(fā)現(xiàn)，生物中的碳酸酐酶是催化微生物風(fēng)化碳酸鹽巖的關(guān)鍵酶，并證明在室內(nèi)模擬條件下，對石灰?guī)r在高CO2分壓時其溶解速率可增加10倍，對白云巖則主要在低CO2分壓時溶解速率增加，可達(dá)3倍左右；余龍江等［4］在巖溶系統(tǒng)中加入細(xì)菌胞外碳酸酐酶粗提液，證明其對石灰?guī)r的溶蝕具有較強的驅(qū)動作用。

利用碳酸酐酶對巖石溶蝕的作用，加快巖石成土的速率，并與近年來發(fā)展較快的客土噴播技術(shù)相結(jié)合，從而提高該技術(shù)應(yīng)用的有效性。這一技術(shù)上的創(chuàng)新將對巖溶地區(qū)生態(tài)環(huán)境中巖壁裸露、水土大量流失等問題起到有效的治理與修復(fù)作用。

1 相關(guān)概念與背景

1.1巖溶動力系統(tǒng)中碳循環(huán)過程

巖溶生態(tài)系統(tǒng)由無機環(huán)境（包括偏堿性可溶巖，貧瘠土壤和具有雙層結(jié)構(gòu)的特殊水文系統(tǒng)）和有機生命（巖溶植被和地下生物群落）組成。其中的無機環(huán)境方面即為基于巖溶系統(tǒng)中的物質(zhì)與能量遷移、循環(huán)的研究而提出的“巖溶動力系統(tǒng)”(KDS)［5］，該系統(tǒng)是控制巖溶形成與演化，并受已有巖溶形態(tài)的制約，在巖石圈-水圈-大氣圈-生物圈界面上的、以CO2-H2O-CaCO3循環(huán)為主的三相不平衡開放系統(tǒng)?？捎脠D1所示概念模型來描述巖溶動力系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。

圖1 巖溶動力系統(tǒng)概念模型［6］Fig 1 Karstdynam ic system conceptualmodel［6］

由此可見，當(dāng)大氣中大量CO2進(jìn)入該系統(tǒng)時，就會促進(jìn)溶蝕作用的發(fā)生，進(jìn)入的CO2越多則溶蝕作用越強烈；而當(dāng)有大量CO2從該系統(tǒng)逸出時，就會促進(jìn)系統(tǒng)中沉積作用的發(fā)生，逸出的CO2越多，沉積作用越明顯。巖溶動力系統(tǒng)中存在豐富的碳酸鹽巖，而碳酸鹽巖中的碳庫容量占全球總碳量的99.5%，是地球上最重要的碳庫，因此巖溶作用的強度決定著全球碳循環(huán)的速率與進(jìn)程，即該系統(tǒng)可通過驅(qū)動巖溶作用調(diào)節(jié)大氣中CO2含量，從而對全球碳循環(huán)起到重要的源匯作用。

國際地質(zhì)對比計劃項目“IGCP379”的研究結(jié)果表明，生物對巖溶動力系統(tǒng)的運行過程具有不可替代的作用［7］。而微生物在該系統(tǒng)中則可通過自身代謝活動與產(chǎn)物，以CO2為中心環(huán)節(jié)將生物圈碳循環(huán)與“CO2-H2O-碳酸鹽巖”三相不平衡開放巖溶動力系統(tǒng)相耦聯(lián)［8］。因此，微生物的代謝活動在對巖石動力系統(tǒng)的研究過程中愈加受到關(guān)注，而如碳酸酐酶等相關(guān)代謝產(chǎn)物在微生物界的分布范圍與類型的探究也日趨成熟。

1.2 碳酸酐酶的種類與分布

碳酸酐酶是一種以Zn為活動中心，廣泛存在于生物界的一種金屬酶，可催化二氧化碳（碳酸酐）可逆的水合反應(yīng)，目前該酶在生物界中的種類、分布、功能與結(jié)構(gòu)受到眾多學(xué)者的關(guān)注［9］。

碳酸酐酶分為α、β、γ、δ和ε共5個家族，5個家族之間不存在顯著的序列同源性，顯示它們是趨同進(jìn)化的典型［10］。

其中，α類碳酸酐酶從5～6億年前一個共同的原始基因進(jìn)化而來，已發(fā)現(xiàn)的α-碳酸酐酶有單體亞基組成，也存在二聚體或三聚體亞基組成，其Zn2+配體由3個組氨酸殘基構(gòu)成。該類碳酸酐酶被證明存在于脊椎動物、高等植物的胞漿、藻類的胞漿、真菌以及一些細(xì)菌中［11］，但至今未在古生菌中發(fā)現(xiàn)α碳酸酐酶的存在。同時，所有動物來源的碳酸酐酶被證實都屬于α-家族［12］，α類碳酸酐酶幾乎參與到哺乳動物的所有組織的各種生命活動中，并存在至少14種不同的同工酶，其中就包括了對CO2水合反應(yīng)催化效率最高的研究熱點——碳酸酐酶Ⅱ［13］。據(jù)推測，β類碳酸酐酶與α類碳酸酐酶進(jìn)化年代接近但組成該類碳酸酐酶的亞基數(shù)目范圍從二聚體到八聚體，因此更具多樣性。且與α類碳酸酐酶對磺胺類抑制劑的高敏感度不同，β類酶對抑制劑的敏感度較低，主要存在于高等植物及藻類葉綠體中，并在植物的光合作用過程中起重要作用。γ類碳酸酐酶簡稱“Cam”，首次發(fā)現(xiàn)于古細(xì)菌Methanosarcina thermophila中，被認(rèn)為30億年至45億年前進(jìn)化而來，對抑制劑的高敏感度有利于其固定化的研究。該類碳酸酐酶主要存在于細(xì)菌和古生菌中，在高等植物與真菌中也有分布。δ類碳酸酐酶主要存在于海洋硅藻中，而ε類碳酸酐酶則主要存在于藍(lán)細(xì)菌，硅藻及一些化能自養(yǎng)型細(xì)菌中，兩類碳酸酐酶皆由二聚體構(gòu)成，是近年確定的類型，其相應(yīng)的各方面研究有待進(jìn)一步深入。

碳酸酐酶Ⅱ是其中最具代表性的含鋅金屬酶，其分子近似球形?；钚灾行闹饕ǎ?）一個由Zn2+和94，96，119號組氨酸殘基咪唑基側(cè)鏈上的3個N原子與親核基團-OH-中的O原子所形成包含四價金屬的多面體，該部分的蘇氨酸-199在反應(yīng)中起到接受與提供氫鍵的作用；2）靠近上述多面體處存在一結(jié)合有CO2的疏水袋，由Val-121，Leu-141，Val-143，Leu-198和Trp-209構(gòu)成，水合反應(yīng)的進(jìn)行或阻斷即由此部分決定。

當(dāng)碳酸酐酶Ⅱ結(jié)構(gòu)中的His94被突變?yōu)锳sp時，但其分子酸解離常數(shù)pK值由6.8上升到9.6，同時催化對-硝基乙酸苯酯水解的二級速率常數(shù)卻明顯下降，由此可以證明陰離子配位可導(dǎo)致碳酸酐酶催化活性變化。在基因定點突變技術(shù)的引入使得對碳酸酐酶活性位點改造成為可能，并在證明其結(jié)構(gòu)對催化功能影響的研究中起到重要作用。

2 微生物碳酸酐酶對碳循環(huán)的作用

在巖溶系統(tǒng)特有的雙層結(jié)構(gòu)中，微生物不僅分布于其地表層，更活躍于其地下層，土壤中的CO2濃度與微生物的酶化學(xué)反應(yīng)息息相關(guān)，土壤微生物是土層中碳酸酐酶的重要來源之一。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶不僅廣泛分布于真菌、細(xì)菌與古生菌中，在部分放線菌中也檢測到該酶的存在［14］。近年來，研究者對生物巖溶微形貌形成機理中動植物與藻類等生物的碳酸酐酶所起作用進(jìn)行了大量研究［15-17］，并逐漸將研究的焦點聚集于巖溶地區(qū)中大量存在的真菌、細(xì)菌等微生物的碳酸酐酶。

2.1微生物碳酸酐酶對碳循環(huán)的直接作用

碳酸鹽巖作為地球上最重要的碳庫，在其巖溶過程中CO2的水合反應(yīng)，即：CO2+H2O?H++，是重要的限速步驟。研究中發(fā)現(xiàn)，無碳酸酐酶催化時，上述可逆反應(yīng)要達(dá)到平衡需1m in；在有碳酸酐酶催化時，要達(dá)到平衡只需10-6s［18］。

其反應(yīng)催化機理如下［19］：

即：

1）與Zn2+相連的H2O在一定生理條件下去質(zhì)子化形成EZnOH-，生成的EZnOH-對疏水袋中的反應(yīng)底物CO2具有極強的親核性，二者可結(jié)合形成EZn，其中的會被溶劑中的H2O取代而生成EZnH2O與；2）EZnH2O通過碳酸酐酶中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運體將H+轉(zhuǎn)運至溶劑，同時還原成具催化活性的EZnOH-，該步驟是催化過程的限速步驟，通過酶分子活性區(qū)域的His-64完成。

該水合反應(yīng)產(chǎn)生的H+會影響CaCO3的電離平衡，對碳酸鹽巖的溶蝕產(chǎn)生驅(qū)動作用，即：

通過這一可逆反應(yīng)，碳酸酐酶不僅可以促進(jìn)碳酸鹽巖的風(fēng)化，還可以通過吸收大氣中的CO2來固定碳源，從而參與到巖溶動力系統(tǒng)的碳循環(huán)過程中，并起到不可忽視的驅(qū)動作用。由于結(jié)構(gòu)的不同，不同屬的碳酸酐酶對該反應(yīng)的催化速率不同，而對催化過程中的相關(guān)條件依賴性也不盡相同，有關(guān)詳細(xì)研究會在本文對碳酸酐酶應(yīng)用的研究部分進(jìn)行闡述。

以牛碳酸酐酶為材料的研究發(fā)現(xiàn)，生物中的碳酸酐酶是催化微生物風(fēng)化碳酸鹽巖的關(guān)鍵酶。李為等［20］在西南不同巖溶生態(tài)系統(tǒng)采集土壤樣品進(jìn)行實驗，在自然巖溶生態(tài)條件下檢測到不同區(qū)系表層土壤都有碳酸酐酶分布，并在細(xì)菌菌株中廣泛存在。微生物中的碳酸酐酶以胞內(nèi)碳酸酐酶與分泌到細(xì)胞外的胞外碳酸酐酶兩種形式存在，其中主要由胞外碳酸酐酶通過促進(jìn)巖溶作用對巖溶地區(qū)碳循環(huán)起到直接的驅(qū)動作用。經(jīng)比較，巖溶環(huán)境中放線菌的胞內(nèi)碳酸酐酶活性較高，而真菌的胞外碳酸酐酶活性較高，且真菌對碳酸鹽巖溶蝕效果相對放線菌更好。對真菌溶蝕機理進(jìn)一步探究后可得：影響溶蝕作用速率的程度從大到小依次為真菌菌絲＞真菌有機酸物質(zhì)＞真菌碳酸酐酶［21］。

作為地球表層分布最為廣泛的生命形式，微生物與礦物的相互作用不僅是其對巖石風(fēng)化的促進(jìn)作用，還包括其對礦物沉積的控制作用。微生物的礦化作用可分為誘導(dǎo)礦化作用和控制礦化作用，前者形成礦物類型受環(huán)境條件制約，多出現(xiàn)于原核生物和真菌中。在自然條件下的礦化作用十分緩慢，約需數(shù)百年之久，而CO2礦化作用的本質(zhì)是Ca2+與水中的CO2之間發(fā)生的反應(yīng)［22］，因此碳酸酐酶的參與可極大提高這一反應(yīng)速率。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌作用于包括溶蝕、絡(luò)合、轉(zhuǎn)換以及結(jié)晶成核的全部成礦過程中，并形成具有明顯專屬性的菌生礦物［23］。近代以來海洋生物專家對碳酸酐酶與海洋生物的鈣化沉積作用進(jìn)行了細(xì)致研究，經(jīng)SEM檢測證明碳酸酐酶因催化CaCO3的電力平衡而參與到珍珠層CaCO3晶體的形成過程中［24］。在其他對珊瑚等海洋生物鈣化作用的研究中，李強［25］也從氨基酸序列對比等不同角度證明了碳酸酐酶對礦化沉積作用的重要性，在一定程度上可以控制形成的CaCO3晶體構(gòu)造。在對藻類碳酸酐酶活性的分析中發(fā)現(xiàn)白水臺鈣華池內(nèi)的微藻胞外碳酸酐酶活性較高，間接證明碳酸酐酶通過催化CO2水合逆向反應(yīng)促進(jìn)碳酸鈣的沉積。有研究證明［26］，生物從周圍環(huán)境中選擇性吸收生長代謝所需營養(yǎng)元素，并對生物酶等在微生物形成功能性碳酸鹽結(jié)構(gòu)過程中所起調(diào)控作用進(jìn)行了分析。李輝等［27］在以膠質(zhì)芽孢桿菌誘導(dǎo)碳酸鈣顆粒形成的過程中發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌在利用本身較強的風(fēng)化能力溶蝕巖礦的同時，聯(lián)合分泌的胞外碳酸酐酶促進(jìn)碳酸鈣的沉積，沉積作用的速率與碳酸酐酶的活性呈正相關(guān)。對前期相關(guān)研究總結(jié)的基礎(chǔ)上，連賓等［19］提出微生物對碳酸鹽礦物的破壞作用具有選擇性，而對礦化沉積產(chǎn)生晶體的結(jié)構(gòu)形貌則具有顯著的調(diào)控作用。

觀察發(fā)現(xiàn)［28］，有CO2的溶解吸收參與的全球水循環(huán)可形成重要的CO2匯。而在與碳酸鹽巖之間的作用過程中，微生物碳酸酐酶對巖溶動力系統(tǒng)水體環(huán)境中的水體pH值、氧化-還原電位、無機碳組成與含量、陰陽離子含量與組成以及鈣化作用等產(chǎn)生影響，并由此影響水體環(huán)境中的CO2濃度、pH值、Eh、等指標(biāo)。由此可見，一方面碳酸鹽巖的風(fēng)化不僅直接關(guān)系到水體的供給量，影響水體中碳通量的平衡，且可以直接回收大氣圈中CO2；另一方面，水體生物礦化沉積又可向大氣圈釋放CO2，從而影響溫室氣體的變化。

2.2微生物碳酸酐酶對碳循環(huán)的間接作用

碳酸酐酶作為無機碳的濃縮機制廣泛存在于生物體內(nèi)，通過催化CO2與之間的相互轉(zhuǎn)換，大大提高其反應(yīng)速率［29］，從而為機體正常的生長代謝提供充足的CO2或，并參與完成機體內(nèi)CO2或輸送過程。對某些植物而言，碳酸酐酶是其固定CO2所不可或缺的，在對諸如玉米，大豆［30］等農(nóng)作物的研究中發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶參與植物的光合作用，并對植物體細(xì)胞內(nèi)外的碳素轉(zhuǎn)移和利用過程起到顯著調(diào)節(jié)作用。碳酸酐酶的存在，不僅對許多真核生物生長過程中的呼吸作用、光合作用、離子運輸、酸堿平衡、鈣化作用等生理活動是必不可少的，并且在原核生物的生理代謝中也起到重要作用。通過CO2濃縮機制，碳酸酐酶為藍(lán)藻提供無機碳原料，以助于藍(lán)藻在水分脅迫或CO2濃度過低等惡劣環(huán)境條件下正常生長，提高其對極端環(huán)境的適應(yīng)能力。

不僅如此，碳酸酐酶在古細(xì)菌與細(xì)菌界的普遍分布及多種碳酸酐酶出現(xiàn)于同一生物個體中的現(xiàn)象說明其對生物機體有多樣的作用，例如E.coli中的氰酸鹽誘導(dǎo)型碳酸酐酶可提高E.coli對氰酸鹽的抗毒性并將其轉(zhuǎn)化為生長所需氮源。除此之外，碳酸酐酶還可以通過將CO2轉(zhuǎn)換為推動機體內(nèi)脫羧反應(yīng)的進(jìn)行。

以上研究證明，碳酸酐酶在微生物中的作用無處不在，并可以通過幫助機體在惡劣或極端環(huán)境下維持正常的代謝與生長，促進(jìn)各類微生物在碳酸鹽巖表面廣泛分布與殖居，從而更利于其對巖石的風(fēng)化作用的發(fā)生，對巖溶系統(tǒng)的碳循環(huán)起到顯著的驅(qū)動作用。可用圖2表示微生物碳酸酐酶對巖溶動力系統(tǒng)碳循環(huán)的驅(qū)動作用。

圖2 微生物碳酸酐酶驅(qū)動碳循環(huán)模型（圖中CA表示碳酸酐酶）Fig 2 M icrobial carbonic anhydrase drive carbon cyclemodel

3 微生物碳酸酐酶的分離技術(shù)與特性

微生物碳酸酐酶的分布與活性受生態(tài)系統(tǒng)、巖溶地形、植被覆蓋等因素影響，并與其存在的巖溶系統(tǒng)特性高度相關(guān)［18］，同時諸如溫度、pH值、無機碳濃度等因素也對碳酸酐酶的活性產(chǎn)生影響。在對西南巖溶生態(tài)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)［30］，在20～30℃，中性偏堿性條件下，細(xì)菌的胞外碳酸酐酶活性較高。小新月菱形藻分泌的胞外碳酸酐酶在高濃度CO2環(huán)境中，催化活性受到抑制［15］。水環(huán)境中的光合細(xì)菌等可通過碳酸酐酶催化自體的各類代謝活動，進(jìn)而通過巖-氣-水作用影響全球碳循環(huán)。雖然碳酸酐酶對巖溶系統(tǒng)碳循環(huán)的驅(qū)動作用已得到證實，但要將微生物碳酸酐酶的這一作用應(yīng)用到自然條件相對惡劣的巖溶地區(qū)并起到預(yù)期效果，則應(yīng)當(dāng)對其分離純化、熱穩(wěn)定性以及固定化等方面進(jìn)行著重研究。

3.1碳酸酐酶的分離純化

加強碳酸酐酶驅(qū)動巖溶地區(qū)碳循環(huán)的作用，首先應(yīng)當(dāng)探究如何在應(yīng)用中使其高效表達(dá)，因此，對碳酸酐酶分離純化技術(shù)的要求也隨之提高。已有報道證明，在適宜條件下，以含有相應(yīng)碳酸酐酶抑制劑的洗脫劑可將碳酸酐酶洗脫，從而分離純化碳酸酐酶。因此，對碳酸酐酶分離純化技術(shù)的研究逐漸演化為碳酸酐酶抑制劑的探究。早在20世紀(jì)60年代，一種對位氨甲基磺胺藥物——磺胺米隆就被作為親和層析的非水溶性填充原料運用于碳酸酐酶的純化。20世紀(jì)80年代，碳酸酐酶抑制劑的研究得到進(jìn)一步發(fā)展，多種碳酸酐酶Ⅱ的抑制劑被發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)與抑制作用的關(guān)系及生物活性也被深入探究。相應(yīng)的純化方法與大致流程也被總結(jié)為：收集樣品-分層沉淀-透析除鹽-親和層析-得純化碳酸酐酶。同時，針對耐熱性較高的碳酸酐酶純化則通過離子交換層析來實現(xiàn)，而p-AMBS親和層析則是分離純化碳酸酐酶所必需的。

隨著研究的深入，芳基磺胺類藥物被作為碳酸酐酶最具代表性的抑制劑，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，其他諸如陰離子抑制劑（CN-、HS-、NCO-等）、苯酚也被證明對碳酸酐酶的活性具有抑制作用。計算機技術(shù)的發(fā)展使定量構(gòu)效關(guān)系這一方法被逐漸引入到碳酸酐酶的研究中［31］，在對碳酸酐酶抑制劑作用效果的分析上起到重要作用。近期研究［32］從分子動力學(xué)的角度對該抑制劑對碳酸酐酶活性的抑制作用以及兩者結(jié)合的過程進(jìn)行了詳盡的分析。在未來的研究中，發(fā)現(xiàn)選擇性強且組織特異性高的碳酸酐酶抑制劑以及探索更便捷準(zhǔn)確操作性強的分析方法應(yīng)成為主要內(nèi)容。

3.2碳酸酐酶的熱穩(wěn)定性

由于碳酸酐酶不屬于土壤酶，其熱穩(wěn)定性與酶活性在水熱條件劇烈變化的巖溶環(huán)境中受到極大限制。

Savile等研究證明［33］，自人體中提取的碳酸酐酶催化最適溫度是37℃，與人體的正常體溫相當(dāng)。而超嗜熱古生菌生長代謝最適宜的溫度高達(dá)98℃，在該種微生物機體中已發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶的存在［34］。在接下來的探究中發(fā)現(xiàn)，嗜熱微生物機體中存在的碳酸酐酶多具有良好的熱穩(wěn)定性。以CAM為例，55℃時，其催化速率常數(shù)高達(dá)105s-1并在70℃條件下存在15min后仍保留50%反應(yīng)活性，而從克勞氏芽孢桿菌中提取的α-碳酸酐酶，其熱穩(wěn)定性更大于CAM。存在于從嗜熱生物體Cam inibactermediatlanticus DSM 16658中的碳酸酐酶，經(jīng)驗證在溫度達(dá)到109℃時才失去活性，且在100℃的堿性環(huán)境中，15min后仍可保持40%活性并發(fā)揮催化作用。余龍江等［4］從中國西南巖溶地區(qū)篩選出的細(xì)菌GLCa102中提取出胞外碳酸酐酶，在最高60℃條件下處理30m in后仍能保持一定活性。

因此，如何使碳酸酐酶在高溫的堿性條件下具有更高穩(wěn)定性，并持續(xù)高效地發(fā)揮催化作用是一個值得深究的問題。近期的研究中，高偉芳［35］嘗試以吸附-交聯(lián)法、共價結(jié)合法與包埋-交聯(lián)法3種不同方法，分別以酸性氧化鋁、硅藻土、海藻酸鈉-聚乙烯醇為載體進(jìn)行碳酸酐酶固定化，分析固定化條件，并對固定化效果進(jìn)行對比分析。通過對傳統(tǒng)固定方法的耦合，形成新的固定法，從而提高碳酸酐酶的催化活性與穩(wěn)定性。

4 微生物碳酸酐酶在生態(tài)恢復(fù)領(lǐng)域的可能應(yīng)用前景

碳酸酐酶在醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、礦物學(xué)等方面的應(yīng)用已取得令人矚目的成績，而在生物固碳方面的研究也經(jīng)歷了游離態(tài)碳酸酐酶-固定化碳酸酐酶-酶膜生物反應(yīng)器這三大發(fā)展階段，進(jìn)入較為成熟的研究階段。這種仿生固碳方式可以提高捕集大氣中CO2的效率，減少溫室氣體的含量，對全球溫室效應(yīng)起到緩解作用。但如何降低該方法的成本以及減少應(yīng)用時的環(huán)境條件制約因子，使其更好的發(fā)揮效果，是后期研究的主要方向。

中國具有世界上最為典型的喀斯特景觀，喀斯特地區(qū)生境脆弱，成片巖石裸露，植被破壞嚴(yán)重且很難恢復(fù)。經(jīng)過多年探索研究，針對喀斯特地區(qū)環(huán)境惡化，“石漠化”嚴(yán)重，土地喪失生產(chǎn)力等現(xiàn)象開發(fā)出相應(yīng)的生態(tài)修復(fù)措施。而將碳酸酐酶催化CO2的水合反應(yīng)應(yīng)用到退化喀斯特地區(qū)驅(qū)動巖石的風(fēng)化作用，則為改善該地區(qū)生態(tài)環(huán)境提供了一個新思路：可將該酶的應(yīng)用與破壞山體恢復(fù)的覆綠噴播技術(shù)相結(jié)合，添加含有該酶的微生物到噴播基質(zhì)中，通過微生物分泌的碳酸酐酶作用，驅(qū)動碳酸鹽巖風(fēng)化成土，從而使基質(zhì)中的植物種在該環(huán)境下更易成活，并提高基質(zhì)對巖壁的黏著力，促進(jìn)基質(zhì)在巖壁上附著，對喀斯特地區(qū)生態(tài)環(huán)境起到較好的改良作用。

運用于喀斯特地區(qū)生境恢復(fù)的碳酸酐酶需適應(yīng)該地區(qū)的環(huán)境與氣候變化，因此由該地區(qū)較常見的微生物代謝生成將對巖溶地區(qū)具有良好的適應(yīng)性，更有利于生態(tài)修復(fù)技術(shù)作用的發(fā)揮?？梢援a(chǎn)生并含有碳酸酐酶的微生物種類繁多，其中膠質(zhì)芽孢桿菌是較為典型和廣泛應(yīng)用的一種。近期研究表明，膠質(zhì)芽孢桿菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生多種重要的酶類，是一株較典型的可分泌碳酸酐酶微生物。在不同培養(yǎng)條件下，膠質(zhì)芽孢桿菌分泌碳酸酐酶的能力發(fā)生變化。無N條件下培養(yǎng)，膠質(zhì)芽孢桿菌數(shù)量較少、莢膜肥厚，所產(chǎn)碳酸酐酶活力較低，有N條件下則培養(yǎng)液中碳酸酐酶活性較高［36］。作為一種優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)酶候選菌種，膠質(zhì)芽孢桿菌不僅可分泌大量碳酸酐酶促進(jìn)喀斯特地區(qū)巖石風(fēng)化，同時具有良好的溶P、固N功能，并且可分泌具有吸附與持水效果的多糖類物質(zhì)。結(jié)合前期研究嘗試調(diào)整膠質(zhì)芽孢桿菌的培養(yǎng)條件，可以提高碳酸酐酶產(chǎn)量，同時改善其分泌其他多糖類物質(zhì)的能力，從而將之充分應(yīng)用到恢復(fù)破壞生境的技術(shù)中。

5 結(jié)語與展望

近年來國內(nèi)外對碳酸酐酶對巖溶動力系統(tǒng)作用的研究中可以看出在巖溶地區(qū)廣泛分布的碳酸酐酶通過催化CO2水合作用，對該類地區(qū)的碳循環(huán)起到較大的驅(qū)動作用，進(jìn)而影響到全球碳循環(huán)進(jìn)程。不同微生物機體中碳酸酐酶的多樣性也導(dǎo)致其功能和作用條件的不同，在今后的研究中應(yīng)將重點放在探究調(diào)控碳酸酐酶催化活性的基因序列以及尋找對巖溶地區(qū)環(huán)境適應(yīng)性強的微生物碳酸酐酶種類，并在推廣應(yīng)用中探索更加便捷經(jīng)濟的碳酸酐酶固定化技術(shù)，保證該酶的催化功效得以穩(wěn)定高效地發(fā)揮，使該酶在生態(tài)環(huán)境恢復(fù)中的應(yīng)用得以推廣。

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M icrobial carbonic anhydraseaction and application on carbon cycling in Karst dynam ic system：a review

WUYan-wen，ZHANG Jin-chi
(Jiangsu Key Laboratory of SoilandWater Conservation and EcologicalRestoration,College of Forestry, Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

The karstdynam ics system is an open system w ith three unbalanced phases,which is dom inated by biosphere inmaterial circulation and energy flow,meanwhile,the circle between CO2,H2O and CaCO3play an significante role in promoting the global carbon cycle.Carbonic anhydrase is one kind of metal zinc enzymes,which exists w idely in m icroorganisms.This enzyme has driving effecton the carbon cycle in karst dynam ic system via catalytic hydration reaction of CO2.In this paper,we reviewed in the research of the structure and function ofm icrobial carbonic anhydrase,system elaborated the important role of the enzyme on driving the carbon cycle in karstdynam ic system,and combined w ith the developmentand application of relevantachievements in chem ical industry,thus come up w ith the new thought of its future application which combined with the destroyed mountain recovery technique research.

microbial carbonic anhydras；karstdynamicssystem；carbon cycle；destroyedmountain recovery

Q939.96;P967

A

2095－1736（2015）03－0078－06

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.078

2014-09-30；

2014-10-27

國家林業(yè)局948項目“破壞山體植被恢復(fù)長期維持技術(shù)引進(jìn)”（2008-4-40）

吳雁雯，主要從事水土保持和荒漠化防治，E-mail:wywhsl@sina.com；

張金池，教授，博導(dǎo)，從事研究方向為水土保持與林業(yè)生態(tài)工程，E-mail:zhang8811@njfu.edu.cn。