朱世璟，袁 媛,2，尹華陽，惠愛玲，周 安，潘 見

(1.合肥工業(yè)大學天然藥物研究所，安徽 合肥 230009；2.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034; 3.安徽中醫(yī)藥大學，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230038)

銀杏內酯B前體藥物的腦靶向性研究

朱世璟1，袁 媛1,2，尹華陽1，惠愛玲1，周 安3，潘 見1

(1.合肥工業(yè)大學天然藥物研究所，安徽 合肥 230009；2.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034; 3.安徽中醫(yī)藥大學，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230038)

目的 考察銀杏內酯B前體藥物(PGB)的腦靶向性，并探究其靶向機制。方法 采用LC-MS/MS考察大鼠尾靜脈注射PGB后的腦部藥動學規(guī)律并評價其腦靶向性；采用伊文斯藍法觀察PGB對不完全性腦缺血小鼠腦毛細血管通透性的影響；HPLC法測定PGB在正辛醇-水體系的分配系數(shù)(logP)；MVD分子對接軟件計算PGB與P-糖蛋白(P-gp)的體外結合力；定磷法檢測PGB對人P-gp膜ATP酶活性的影響。結果 以治療有效性和靶向指數(shù)評價PGB的腦靶向效率達6.87和4.14；PGB預防給藥可有效降低不完全性腦缺血小鼠的腦毛細血管通透性(P<0.05)；PGB的 logP為1.03，高于GB的0.61；分子對接計算表明PGB與P-gp結合力大于GB，其MolDockScore分別為-143.36、-116.40 KJ·mol-1；ATP酶活性分析提示PGB、GB均能提高P-gp ATP酶活性，其Km值分別為237.75、841.24 μmol·L-1, PGB與P-gp親和力高于GB。結論 PGB具有腦靶向性，其靶向性提高一方面得益于其脂溶性提高，PGB在腦部滲透量增加；另一方面可能為PGB明顯提高P-gp ATP 酶活性，從而抑制P-gp對GB的外排作用。

銀杏內酯B；前體藥物；腦靶向；腦缺血；脂水分配系數(shù)；P-糖蛋白；ATP酶活性

銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, GBE)是臨床治療腦血管疾病的一線藥物，療效得到國內外醫(yī)學界充分肯定。銀杏內酯B(ginkgolide B, GB)是GBE中重要的活性成分之一，GB是血小板活化因子(platelet activation factor, PAF)受體最有效的拮抗劑[1]，它可減輕腦缺血/再灌注介導的腦組織脂質過氧化反應，提高自由基清除系統(tǒng)酶的活性，對腦損傷有明顯保護作用[2-3]。

然而，GB的藥代研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其在腦部濃度非常低[4-5]，如：尾靜脈注射GB (10 mg·kg-1) 20 min后腦部濃度僅為0.24 μg·g-1[4]。這里除了腦細胞對GB的清除效應外，其血腦屏障(blood brain barrier, BBB)對藥物的屏障作用及BBB上P-糖蛋白(p-glycoprotein, P-gp)對藥物的外排作用亦不容忽視[6]。因此，本實驗室以提高GB腦靶向性、增強藥效為目的，設計合成了一系列GB腦靶向前藥[7-8]，如酯類前藥PGB(Fig 1)，它是在GB的10位羥基位置引入另一分子T而得到。T具有鈣離子拮抗作用，同時對P-gp也具有一定的抑制作用。前期研究結果證實：PGB保留GB的抗血小板聚集活性[9]，同時增加了拮抗鈣離子通道蛋白的作用[7]。

PGB是作用于腦部而發(fā)揮藥效的藥物，所以對其腦靶向性評價及對腦缺血的保護作用研究尤為重要。為此，本文采用LC-MS/MS法，考察大鼠尾靜脈注射PGB后的腦部藥動學規(guī)律并評價其腦靶向性；采用頸動脈結扎致小鼠不完全性腦缺血模型，通過伊文斯藍法考察PGB對缺血小鼠腦毛細血管通透性的影響。在證實PGB具有腦靶向作用的基礎上，深入探究其靶向機制將為其它藥物的腦靶向前藥設計提供科學指導。

理論上來說，BBB通透性增加及P-gp外排功能減弱均有利于增加PGB的腦部濃度，從而提高其腦靶向效率。為此，我們采用搖瓶法，結合HPLC測定PGB在正辛醇-水體系的脂水分配系數(shù)(logP)，以此推測PGB的BBB通透性。P-gp結合力(親和力)大小直接影響P-gp外排功能的強弱，在此，我們分別采用Molegro Virtual Docker (MVD)分子對接軟件計算PGB、GB與P-gp的結合力大??；并以ATPase活性分析法測定PGB、GB對人P-gp膜ATP酶活性的影響，以考察它們與P-gp的親和力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 PGB為本實驗室合成，其結構經IR、NMR、MS確證，純度>99%；GB為合肥拓峰生物工程有限公司提供，純度≥ 98%；鹽酸維拉帕米為武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司提供，純度99%；HPLC級甲醇購自美國Tedai公司；伊文斯藍購自BIOSHARP公司；人P-gp膜購自美國BD公司；Tris、MES、DL-二硫蘇糖醇(DTT)購自薩恩(上海)化學技術有限公司；甲酰胺、正釩酸鈉、Mg-ATP、消泡劑A、SDS購自美國Sigma公司；其它試劑購自國藥集團，均為分析純。

1.1.2 儀器 API 3200型三重四級桿串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧離子化源及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件，美國Applied Biosystem公司；高效液相色譜系統(tǒng)，配有515高壓泵、2420蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)、2487紫外光譜檢測器(UVD)、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司；Spectra Max M2e 多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；標準PB-10酸度計，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；臺式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；96孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning公司。

1.1.3 實驗動物 SD大鼠，♀♂兼用，體質量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(皖)2005-001；SPF級昆明種小鼠，♂，體質量(20±2)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(皖)2011-002。動物自由進食，飲水，標準顆粒飼料，室溫(18～22)℃，實驗前常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 PGB腦靶向性評價

1.2.1.1 動物分組及給藥 SD大鼠隨機分為PGB組(12.83 mg·kg-1)或GB組(10 mg·kg-1)，尾靜脈注射給藥，于給藥后0.08、0.17、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h時經大鼠眼底靜脈叢采血，置于預先肝素化的試管中，4℃離心 (4 000 r·min-1，10 min)，精密吸取上層血漿，于-20℃保存，待測。取血后立即取出腦組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重后加入4倍量生理鹽水(kg·L-1)制成腦勻漿，于-20℃保存，待測。

1.2.1.2 生物樣品處理 精密吸取血漿或腦勻漿190 μl，加入GA溶液(4 mg·L-1，內標)5.0 μL，混勻后加入乙酸乙酯1.0 mL，渦旋振蕩3 min，4℃離心 (12 000 r·min-1，10 min)，取上層有機相，40℃水浴氮氣流下吹干，殘渣用400 μL流動相復溶，離心10 min，取上清液。其中血漿樣品的上清液稀釋10倍，腦勻漿樣品不稀釋，取10 μL進行LC-MS/MS分析。

1.2.1.3 測定條件[10]色譜條件：色譜柱：Waters Symmetry shield RP18 (3.9 mm×150 mm ID，5 μm)；流動相：甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨溶液(85 ∶15，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫40℃；進樣量10 μL。

質譜條件：電噴霧ESI離子源；負離子模式；多反應監(jiān)測(MRM)掃描方式；電噴霧電壓(IS)-4500 V；離子源溫度(TEM)500℃；定量分析的離子對：PGB，[M-H]-，m/z 543.3/137.2；GB，[M-H]-，m/z 423.6→367.1和GA，[M-H]-，m/z 407.2→350.8。

1.2.1.4 腦靶向性評價[11]采用中國藥理學會編制的3P97藥代動力學分析軟件，計算靜脈注射藥物后血漿及腦組織中的藥代動力學參數(shù)，并以治療有效性(therapeutic availability, TA)和靶向指數(shù)(drug targeting index, DTI)定量評價PGB的腦靶向特性。

式中：AUC表示藥物從零時間至所有原形藥物全部消除這一段時間的藥-時曲線下面積。

AUCbrain(PGB)、AUCbrain(GB)分別表示注射PGB和原藥GB后的腦內GB的AUC。

AUCblood(PGB)、AUCblood(GB)分別表示注射PGB和原藥GB后的血漿內GB的AUC。

1.2.2 PGB對不完全性腦缺血模型小鼠腦毛細管通透性的影響 SPF級小鼠按體質量均衡隨機分為假手術組、模型組、GB組(5 mg·kg-1)、PGB高、中、低劑量(10、5、2.5 mg·kg-1)組。除假手術組、模型組外，其余各組均腹腔注射給藥，給藥容積為5 mL·kg-1，假手術組、模型組給予等容積的溶媒，每3 d稱量體質量1次，根據(jù)體質量變化調整給藥容量，連續(xù)腹腔注射7 d。

d 8各組小鼠用5.25%水合氯醛溶液麻醉，手術分離兩側頸總動脈，用動脈夾持續(xù)夾閉雙側頸總動脈20 min，打開雙側動脈夾，縫合頸部皮膚。休息2 h后由尾靜脈注射2.5% 伊文斯藍溶液 (10 mL·kg-1)。注射1 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，開顱取腦，將腦組織浸于生理鹽水中清洗，濾紙吸干，準確稱重，將腦組織浸泡于腦質量10倍體積(kg·L-1)的甲酰胺中， 45℃培養(yǎng)箱溫育72 h，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，于620 nm處，酶標儀測光密度(OD)值。

1.2.3 PGB脂水分配系數(shù)測定[12]

1.2.3.1 測定條件 色譜柱：Symmetry shied C18柱(250×4.6 mm, 5 μm)；測定GB時的其它色譜條件：流動相：甲醇-水-四氫呋喃(30 ∶60 ∶10，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測器，氮氣25 psi，增益值100，漂移管60℃，蒸發(fā)器級別60%。

測定PGB時的其它色譜條件：流動相：甲醇-水(55 ∶45，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25℃；紫外檢測波長275 nm。進樣量均為10 μL。

1.2.3.2 樣品配制 精密配制濃度為1.0及 0.1 g·L-1的PGB、GB正辛醇(二次蒸餾水飽和)溶液，避光保存，備用。

1.2.3.3 平衡時間確定 分別取0.1、1.0 g·L-1PGB正辛醇溶液10 mL于錐形瓶中，加入10 mL二次蒸餾水(正辛醇飽和)混合振蕩。分別振蕩1、2、3、4、5、6 h后，分離水相和有機相，檢測水相中PGB濃度。當濃度不再增加時，即為平衡時間。同法確定GB正辛醇溶液的平衡時間。

1.2.3.4 脂水分配系數(shù)測定 分別取0.1 g·L-1PGB或GB正辛醇溶液10 mL與10 mL二次蒸餾水(1 ∶1)混合，25℃下振蕩3 h (根據(jù)1.2.3.3結果確定)；另取1.0 g·L-1PGB或GB正辛醇溶液10 mL與50 mL二次蒸餾水(1 ∶5)混合，25℃下振蕩5 h(根據(jù)1.2.3.3結果確定)。上述各溶液振蕩后分離有機相和水相，分別測定兩相中PGB、GB濃度。

正辛醇/水分配系數(shù)以log P表示，其計算公式為：

式中：Co表示化合物在正辛醇中的濃度，Cw表示化合物在水相中的濃度。

1.2.4 PGB與P-gp結合力的分子對接計算[13]采用MVD軟件模擬配體分子與受體蛋白的結合力或親和力。這里的受體蛋白為P-gp，它的晶體結構[14]來源于蛋白質數(shù)據(jù)庫(protein data bank, PDB)的鼠P-gp PDB code：3G5U)；配體分子選擇PGB、GB、T 和維拉帕米(verapamil, Ver)。T分子是PGB結構(Fig 1)中具有P-gp抑制作用的活性分子；Ver是一種常用的P-gp抑制劑，可激活P-gp的ATP酶活性。在分子對接過程中，采用準確性較高的MolDock打分算法，MolDock Score 絕對值越大，配體分子與P-gp結合力越大。結合力越大，越易被P-gp外排，從而可以使同時存在的其它分子的外排受到抑制。

Fig 1 Chemical structures of GB and PGB

1.2.5 PGB對人P-gp 膜ATP酶活性的影響[15-16]

1.2.5.1 溶液配制 反應基質液：稱取EGTA 75.8 mg、KCl 187.3 mg、DTT 31.2 mg、NaN332.5 mg溶于100 mL Tris-MES 緩沖液(PH 6.8)得到反應基質液。

標準Pi溶液：稱取NaH2PO430.0 mg溶于10 mL反應基質液得到3 g·L-1的NaH2PO4儲備液。用反應基質液稀釋至0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05 g·L-1，即為標準Pi溶液。

藥物溶液：(1) PGB或GB溶液：分別稱取8.2 mg PGB 或6.4 mg GB，用反應基質液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的PGB或GB母液，并稀釋至750、300、150、30 μmol·L-1；(2) Ver溶液：稱取7.4 mg鹽酸維拉帕米，用反應基質液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的Ver母液，并稀釋至750、300、150、30 μmol·L-1。

P-gp膜溶液：取人P-gp膜母液 (5 g·L-1)于37℃水浴快速解凍，用反應基質液稀釋至1 g·L-1，置于冰上待用。

正釩酸鈉工作液：稱取正釩酸鈉27.5 mg溶于5 mL反應基質液，取其中的100 μL溶液用反應基質液稀釋至10 mL，得到300 μmol·L-1的正釩酸鈉工作液。

Mg-ATP液：稱取Mg-ATP 31.2 mg，溶于5 mL反應基質液，得到12 mmol·L-1的Mg-ATP溶液。

反應終止液和顯色液：稱取SDS 1.01g溶于10 mL蒸餾水，加入20 μL消泡劑A，配成SDS質量分數(shù)為10%含0.2%消泡劑A的反應終止液；稱取鉬酸銨432.6 mg、醋酸鋅27.5 mg，用蒸餾水溶解并定容至10 mL得到顯色劑A。稱取抗壞血酸4 g，溶于36 mL蒸餾水，配成質量分數(shù)為10%抗壞血酸溶液，此為顯色劑B。使用時兩種溶液以1 ∶4 (V/V)混合作為顯色劑。

1.2.5.2 試驗分組 非P-gp ATP酶活性組(正釩酸鈉+P-gp膜)；陽性對照組(Ver系列濃度+P-gp膜)；試驗組(GB或PGB系列濃度+P-gp膜)。

1.2.5.3 反應孵育條件 反應在96孔板中進行。P-gp膜溶液和試驗藥物溶液各20 μL，在37℃培養(yǎng)箱中預熱5 min，隨后加入20 μL 37℃預熱5 min的Mg-ATP溶液，開始反應。另將含有正釩酸鈉的反應液作為對照，以排除P-gp制作過程中非P-gp ATP酶活性和非酶作用的ATP水解的影響。該反應液(60 μL)在37℃孵育相應時間，之后每孔加入30 μL反應終止液，再加入200 μL顯色劑(含40 μL顯色劑A和160 μL顯色劑B)，37℃孵育20 min，多功能酶標儀在620 nm處測吸光度。

1.2.5.4 Pi標準曲線 將配制好的0～0.3 g·L-1標準Pi溶液接種于96孔板上，每孔60 μL，每個濃度平行5孔，37℃孵育30 min后，加入30 μL反應終止液，其余按1.2.5.3項下處理。

1.2.5.5 時間-ATP酶活性實驗 根據(jù)試驗分組，分別在96孔板中加入正釩酸鈉工作液、300 μmol·L-1Ver溶液、300 μmol·L-1GB溶液或PGB溶液各20 μL，每組平行3孔。隨后每孔加入稀釋后的P-gp膜溶液20 μL，37℃培養(yǎng)箱中預熱5 min，最后加入37℃預熱的Mg-ATP溶液20 μL，混勻后37 ℃分別孵育0、15、30、45、60 min。其余按1.2.5.3處理。根據(jù)Pi標準曲線求算反應釋放的無機磷量，繪制ATP酶活-時間曲線。

1.2.5.6 濃度-ATP酶活性實驗 根據(jù)試驗分組，分別在96孔板中分別加入正釩酸鈉工作液、Ver、GB、PGB系列工作液(1500、750、300、150、30 μmol·L-1)各20 μL，每一濃度平行3孔。隨后每孔加入稀釋后的P-gp膜溶液20 μL，在37℃培養(yǎng)箱中預熱5 min，再加入37℃預熱的Mg-ATP溶液20 μL，混勻后37℃孵育60 min(根據(jù)1.2.5.5結果確定)，之后按1.2.5.3處理。根據(jù)Pi標準曲線求算反應釋放的無機磷量，繪制ATP酶活-藥物濃度曲線。

1.2.5.7 數(shù)據(jù)處理 將所測得的ATP酶活性數(shù)據(jù)代入米氏方程

其中，V和Vmax分別為藥物激活的ATP酶活性及其最大值，Km為米氏常數(shù)，即ATP酶活為最大值一半時的底物濃度；C代表底物濃度。

2 結果

2.1 PGB腦靶向性評價大鼠尾靜脈注射PGB，給藥5 min后在腦勻漿中即檢測到PGB以及PGB降解的GB。與直接注射GB(以GB0表示)相比，注射PGB后在腦勻漿檢測到的GB(以GB(PGB)表示)濃度均有較大幅度提高。注射PGB或GB后，在血漿和腦勻漿檢測到的藥物濃度數(shù)據(jù)以及它們的藥動學參數(shù)列于Tab 1和2。由“1.2.1.4”下的公式計算TA為6.87，DTI為4.14，這表明將GB改造成PGB后，PGB可以迅速通過BBB，且腦靶向性大大提高。同時，我們也觀察到PGB降解GB的腦內半衰期(T1/2)延長，清除率(CL)下降，PGB呈現(xiàn)出一種長效緩釋特性，這對于腦血管疾病的長期用藥是非常有利的。

Tab 1 Concentrations of drugs in rat plasma and brain tissue afterintravenous administration of PGB and GB ±s，n=6)

2.2 PGB對不完全性腦缺血模型小鼠腦毛細管通透性的影響小鼠腹腔注射連續(xù)給藥7d后，模型組與假手術組相比，伊文斯藍通過小鼠腦毛細血管的量明顯增加，這說明不完全性腦缺血小鼠模型復制成功(P<0.05)，如Tab 3所示。GB給藥組的伊文斯藍透過量與模型組相比有所減少，但其差異無統(tǒng)計學意義；而PGB低、中、高劑量組的伊文斯藍透過量均低于模型組，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中PGB高劑量組的降低程度最為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果表明，PGB對不完全性腦缺血小鼠的保護作用強于GB，這可能也得益于PGB的腦靶向性提高。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of drugs in rat plasma and brain tissue

Tab 3 Cerebral capillary permeabilityin cerebral ischemia ±s)

*P<0.05vsvehicle.

2.3 PGB脂水分配系數(shù)測定PGB的脂水分配系數(shù)測定結果見Tab 4。由表可知，將GB制成前藥PGB后其親脂性增強(logP=1.03)，更易穿透BBB到達腦部。

Tab 4 Lipo-hydro partition coefficient of PGB

2.4 PGB與P-gp結合力的分子對接計算各配體與P-gp的分子對接計算結果見Tab 5。由MolDock Score計分數(shù)據(jù)預測配體分子與P-gp的結合力，其結合力大小排序為：PGB >GB ≥Ver>T。PGB與P-gp結合力大于GB，即當腦內同時存在PGB和降解的GB時，PGB由于結合力大優(yōu)先被外排出腦，從而減弱了P-gp對GB的外排作用，最終使GB的腦內濃度升高。

Tab 5 Docking results of drugs with P-gp

2.5 PGB對P-gp 膜ATP酶活性的影響

2.5.1 Pi濃度測定標準曲線 在0～0.2 g·L-1的濃度范圍內，無機磷吸光度(A)與NaH2PO4濃度線性良好(Fig 2)，且覆蓋了整個待測樣本的濃度范圍。

Fig 2 Standard curve of inorganic phosphate concentration

2.5.2 時間-ATP酶活性 結果顯示，PGB、GB、Ver誘導的P-gp ATP酶活性存在時間依賴性。隨著時間延長，各種藥物依賴的ATP水解釋放的無機磷量均增多，且無機磷釋放量與時間之間呈現(xiàn)較好的線性關系(Fig 3)。為達到最大靈敏度，選擇60 min作為藥物與P-gp膜作用時間，此時的吸光度均在Pi濃度測定標準曲線的線性范圍之內。

Fig 3 Time-dependency of substrate-induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs

2.5.3 濃度-ATP酶活性 結果顯示，PGB、GB、Ver均能濃度依賴性地提高P-gp ATP酶活性(Fig 4)。Ver誘導的P-gp ATP酶活性明顯高于PGB和GB。在30 μmol·L-1時，GB誘導的P-gp ATP酶活性略高于PGB；而當濃度增至150 μmol·L-1及以上時，PGB誘導的P-gpATP酶活性明顯高于GB。

3種藥物濃度達到300 μmol·L-1時，藥物誘導的P-gp ATP酶活性趨于平穩(wěn)。

根據(jù)米氏方程，以1/V對1/C作圖計算動力學參數(shù)Vmax、Km結果見Tab 6。 PGB的Km值小于GB，提示PGB與P-gp具有更高的親和力，這與分子對接的結合力預測結果(PGB > GB)較為吻合。若用Vmax/Km表示藥物與P-gp親和力，其順序亦是Ver (1.48)>PGB (0.22)>GB (0.06)。

Fig 4 Concentration-dependency of substrate-induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs

Tab 6 Estimated kinetic parameters for substrate-induced P-gp ATPase activity by three drugs

DrugsVmax/μmol·g-1·min-1Km/μmol·L-1Vmax/Km/min-1×10-3PGB52.08237.750.22GB53.76841.240.06Ver52.6435.481.48

3 討論

PGB是一種兼具PAF受體拮抗和鈣離子拮抗作用的新型GB前體藥物，本研究證實了PGB具有較優(yōu)的腦靶向性，其以治療有效性(TA)和靶向指數(shù)(DTI)評價的腦靶向效率達6.87和4.14。

藥物有無腦靶向性關鍵有兩點：一是藥物能跨越BBB大量入腦，二是入腦藥物不被外排出腦?？缒ぽ斎胍蕾囉谒幬飳BB的通透性，BBB通透性通常取決于藥物本身的相對分子量、脂溶性以及特定的載體或受體轉運系統(tǒng)等。BBB上存在的P-gp外排泵，能將許多脂溶性好、易透過BBB的藥物外排出腦組織，所以減少輸出需降低P-gp的外排泵效能。

正辛醇-水體系的分配系數(shù)是預測藥物透膜轉運能力的重要指標。本研究通過搖瓶法結合HPLC測得PGB的logP數(shù)值(1.03)高于GB (0.61)，這說明將GB改造為PGB后脂溶性增強，更易于跨越BBB到達腦部，使腦內可供降解為GB的PGB量上升。這一推測在尾靜脈注射PGB后GB腦內濃度檢測(Tab 1)中得到了較好地證實。

P-gp 對藥物外排作用具有競爭性和ATP依賴性，本實驗中，我們采用了分子對接軟件預測PGB、GB與P-gp的結合力，以此分析它們被P-gp外排的優(yōu)先性；研究PGB、GB對人P-gpATP 酶活性的影響，以此分析它們對P-gp外排功能的抑制作用。分子對接計算結果提示，PGB與P-gp的結合力高于GB； PGB、GB對人P-gp膜 ATP酶活的測定結果表明：二者均能提高P-gp ATP酶活，阻斷P-gp介導的其它藥物外排，但PGB比GB具有更高的親和力，即PGB對P-gp的外排抑制作用更強，上述結果表明，當腦內同時存在PGB及PGB降解的GB時，PGB由于親和力強易被外排出腦，從而有效減弱或阻斷P-gp對GB的外排，最終使GB的腦內濃度升高，在一定程度上增強了GB的腦靶向性。

綜上所述，PGB的腦靶向作用主要得益于較高的脂溶性和對P-gp的強抑制作用。以上研究結果提示：增大藥物的脂溶性(logP)及藥物與P-gp 親和力可在一定程度上實現(xiàn)腦靶向給藥，這對于腦靶向前藥設計提供一種新的設計策略，即可以借助計算化學的logP 計算和分子對接的P-gp親和力預測來設計篩選腦靶向前藥。

[1] Str?mgaard K, Nakanishi K. Chemistry and biology of terpene trilactones from ginkgo biloba [J].AngewChemIntEd, 2004, 43:1640-58.

[2] 黃賤英，孫建寧，梅世昌，黃紀明．銀杏內酯B對缺血/再灌腦損傷大鼠的保護作用[J]．中國藥理學通報，2008, 24(2):269-72.

[2] Huang J Y, Sun J N, Mei S C, Huang J M. Protective effects of ginkgolide B on cerebral ischemia reperfusion injury in rats [J].ChinPharmacolBull, 2008, 24 (2): 269-72.

[3] Lv P, Fang W R, Geng X H, et al. Therapeutic neuroprotective effects of ginkgolide B on cortex and basal ganglia in a rat model of transient focal ischemia [J].EurJPharmSci, 2011, 44 (3): 235-40.

[4] 王 磊，李 寧，韓德恩，等.環(huán)孢素A對銀杏內酯B大鼠體內藥動學的影響[J].藥學學報，2009, 44 (6): 632-9.

[4] Wang L, Li N, Han D E, et al. Effec of cyclosporine A on the pharmacokinetics of ginkgolide B in rats [J].ActaPharmSin, 2009, 44 (6): 632-9.

[5] Suehiro M, Simpson N R, Underwood M D, et al.Invivobiodistribution of ginkgolide B, a constituent of Ginkgo biloba, visualized by MicroPET [J].PlantaMed, 2005, 71(7): 622-7.

[6] 王玉璘，王少俠，郭 紅，胡利民.血腦屏障中P-糖蛋白的調節(jié)機制 [J].中國藥理學通報，2011，27(9)：1196-200.

[6] Wang Y L, Wang S X, Guo H, Hu L M. Regulatory mechanisms of P-glycoprotein at the blood-brain barrier [J].ChinPharmacolBull, 2011, 27(9): 1196-200.

[7] 袁 媛. 銀杏內酯B孿藥腦靶向性和藥效機制研究 [D].合肥工業(yè)大學, 2012.

[7] Yuan Y. Mechanisms research of brain targeting and pharmacodynamic of ginkgolide B twin drug [D]. Hefei University and Technology, 2012.

[8] 吳澤宇. 銀杏內酯B前藥設計、合成及腦靶向性研究 [D].合肥工業(yè)大學, 2012.

[8] Wu Z Y. Design, synthesis and brain targeting research of prodrug of ginkgolide B [D]. Hefei University and Technology, 2012.

[9] 潘 見,袁 媛,惠愛玲，等．銀杏內酯B前體藥物的抗血小板聚集活性研究[J]．中國藥理學通報,2012,28 (10):1435-8．

[9] Pan J, Yuan Y, Hui A L, et al. Antiplatelet aggregative activity of prodrug of Ginkgolide B [J].ChinPharmacolBull, 2012, 28 (10):1435-8.

[10] Yuan Y, Pan J,Wu Z Y, et al. Validated LC-MS-MS method for the determination of prodrug of ginkgolide B in rat plasma and brain: application to pharmacokinetic study [J].JChromatogrSci, 2013, 51(3): 266-72.

[11] 張志榮. 靶向藥物的藥動學/藥效學模型.[M]//張志榮等，編著. 靶向治療分子基礎與靶向藥物設計. 北京: 科學出版社, 2005, 449-51.

[11] Zhang Z R.Drugtargetingpharmacokinetic/pharmacodynamicmodel. [M]//Zhang Z R, et al. Ed. Molecular basis of targeted therapy and drug targeting design. Beijing: Science Press, 2005, 449-51.

[12] 潘 見，吳澤宇，惠愛玲，陶 敏．銀杏內酯B及其前藥脂水分配系數(shù)的測定[J]．時珍國醫(yī)國藥， 2011，22(10): 2397-400.

[12] Pan J, Wu Z Y, Hui A L, Tao M. Determination of partition coefficients of ginkgolide B and its prodrug [J].LishizhenMedMatMedRes, 2011, 22(10): 2397-400.

[13] Hui A L, Chen Y, Zhu S J, et al. Design and synthesis of tacrine-phenothiazine hybrids as multitarget drugs for Alzheimer′s disease [J].MedChemRes, 2014, 23 (7): 3546-57.

[14] Aller S G, Yu J, Ward A, et al. Structure of P-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding [J].Science, 2009, 373:1718-22.

[15] Wang J S, Zhu H J, Gibson B B, et al. Sertraline and its metabolite desmethylsertraline, but not Bupropion or its three major metabolites, have high affinity for P-glycoprotein [J].BiolPharmBull, 2008, 31 (2): 231-4.

[16] 臧彩紅，張 艷，江金花，等. 鹽酸千金藤堿逆轉肝癌多藥耐藥性與P-gp ATP 酶活性的關系研究[J]. 中國藥理學通報，2011，27(7):1002-6.

[16] Zang C H, Zhang Y, Jiang J H, et al. Effect of cepharanthine hydrochloride on overcoming multidrug resistance and P-gp ATPase activity in mice model of hepatocellular carcinoma [J].ChinPharmacolBull, 2011, 27(7): 1002-6.

On Brain targeting research of ginkgolide B prodrug

ZHU Shi-jing1, YUAN Yuan1,2, YIN Hua-yang1, HUI Ai-ling1, ZHOU An3, PAN Jian1

(1.InstituteofNaturalMedicine,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009，China; 2.ShenyangNormalUniversityCollegeofGrainScienceandTechnology,Shenyang110034,China; 3.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofChineseMedicine,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the brain targeting of ginkgolide B prodrug (PGB) and its mechanism. Methods The liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was applied to investigate the pharmacokinetics of PGB in rat brain tissue after intravenous injection of PGB. Also the brain targeting was evaluated on the basis of the pharmacokinetic parameter of PGB. The incomplete cerebral ischemia model was induced in mouse, the effect of PGB on cerebral capillary permeability was observed by Evans blue method. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the partition coefficients (logP) of PGB in octanol-water system. PGB and P-glycoprotein (P-gp) was docked by using Molegro Virtual Docker (MVD) software to predict its binding abilities with P-gp. The interaction of PGB with ATPase activity of human P-gp membrane was estimated by measuring inorganic phosphate liberation. Results The brain targeting of PGB was evaluated by treatment effective (TA) and drug targeting index (DTI), the calculated value were 6.87 and 4.14 respectively. Preventive medication of PGB could significantly decrease cerebral capillary permeability (P<0.05). The lipo-hydropartition coefficient of PGB was higher than that of GB, their logP data were 1.03 and 0.61 respectively. PGB displayed the stronger binding affinity with P-gp than GB according to the molecular docking calculations, their MolDock Score toward P-gp were -143.36 and -116.40KJ·mol-1respectively. ATP-hydrolisis showed that PGB increased ATPase activity with aKmof approximately 237.75 μmol·L-1, however GB with aKmof approximately 841.24 μmol·L-1. PGB might interact with P-gp with a higher affinity and exhibit more effect than GB. Conclusion PGB is characterized by its brain targeting. Higher liposolubility of PGB results in good blood-brain permeability, which is advantageous to its brain targeting. Besides, PGB can effectively inhibit the efflux effect of P-gp to GB because of its increased P-gp ATPase activity.

ginkgolide B; prodrug; brain targeting; cerebral ischemia; lipo-hydropartition coefficient; P-glycoprotein; ATPase activity

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.002.html

2014-11-22,

2015-01-11

國家自然科學基金資助項目(No 21302037)；安徽省科技計劃項目(No 11010401025)

朱世璟(1989-)，女，碩士生，研究方向：天然藥物開發(fā)，Tel：0551-62901862，E-mail：970964309@qq.com； 惠愛玲(1980-)，女，博士，副研究員，研究方向：天然藥物開發(fā)，Tel：0551-62901862，E-mail：haling@mail.ustc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.021

A

1001-1978(2015)04-0542-08

R-332；R284.1；R322.81；R743.31；R977.3；R977.6