閆文芬, 衡 洋，邵千航，陳乃宏，苑玉和

(天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，中國醫(yī)學科學院神經科學中心，中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050)

建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點的細胞篩選模型

閆文芬, 衡 洋，邵千航，陳乃宏，苑玉和

(天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，中國醫(yī)學科學院神經科學中心，中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050)

目的 建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點篩選抗帕金森病創(chuàng)新藥物的細胞模型。方法 通過PCR方法擴增目的基因，分子克隆技術構建原核表達載體。融合載體轉化至大腸桿菌誘導后表達重組α-突觸核蛋白，親和層析法純化目的蛋白并通過蛋白免疫印跡和質譜技術進行鑒定，MTT法檢測細胞存活率。結果 α-突觸核蛋白基因的cDNA片段與理論分子量大小一致，并成功克隆至載體pET30a； 測序正確的融合載體轉化至大腸桿菌E.Coli.BL21(DE3)。轉化子經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達α-突觸核蛋白，通過改變溫度、IPTG濃度及宿主菌的增殖狀態(tài)等條件，獲得高表達菌株；宿主菌的裂解液通過親和層析方法獲得純化的α-突觸核蛋白，純化蛋白通過與不同抗體免疫印跡結果證明為α-突觸核蛋白，質譜結果顯示其分子質量為15.3 ku，與理論分子質量15.5 ku基本一致。純化的α-突觸核蛋白刺激PC12細胞及原代神經元細胞后，細胞存活率明顯下降，存活率的降低程度與α-突觸核蛋白刺激濃度呈正相關性。結論 成功建立了以α-突觸核蛋白損傷為靶點的細胞篩選模型，可用于篩選具有抗帕金森病功能的創(chuàng)新化合物。

α-突觸核蛋白; 毒性作用；帕金森?。缓Y選模型；蛋白表達；藥物靶點

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的以運動功能障礙為主要特征的神經退行性疾病，臨床常以補充左旋多巴為主的治療，雖然能夠改善PD的臨床癥狀，但無法遏制其病理性改變。因此，研制能夠延緩病理進展的抗PD創(chuàng)新藥物對于提高人口健康水平具有重要意義。

PD缺乏有效治療藥物的主要原因是缺乏能夠貼切模擬PD臨床與病理變化的模型。因此，針對PD的病因及發(fā)病機制建立藥物篩選模型，對于抗PD創(chuàng)新藥物的研制具有重要意義。PD是多因素綜合作用導致的疾病，除了衰老因素外，環(huán)境因素和遺傳因素共同影響該病的發(fā)生與發(fā)展[1]，而且環(huán)境因素可通過影響遺傳因素加劇PD的病理過程及病理改變。因此針對PD相關的遺傳因素進行抗PD藥物研究更具理論和實際意義。導致PD發(fā)病的遺傳因素與多種基因的突變、異常表達等有關，其中α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)基因做為常染色體顯性基因，其基因多倍體、突變后都能夠導致家族性PD的發(fā)生[2]，但具體的機制仍不清楚。鑒于α-突觸核蛋白的異常改變能夠影響PD的發(fā)生與發(fā)展，因此有學者提出“以α-突觸核蛋白為靶點治療PD”的學說[3]，該學說已得到許多學者的認同，而且也發(fā)現某些具有神經保護功能的化合物能夠對抗α-突觸核蛋白的毒性作用[4]。因此以α-突觸核蛋白損傷為靶點篩選具有抗PD作用的化合物更具特異性。

最初的研究認為α-突觸核蛋白主要存在細胞內，近幾年的研究發(fā)現：α-突觸核蛋白可釋放到細胞外，而胞外的α-突觸核蛋白具有類似朊蛋白的功能，能夠在神經細胞之間傳遞信息[5]，促進神經元中路易小體的形成及神經元的死亡[6]。目前，有研究發(fā)現外源的α-突觸核蛋白刺激神經細胞后，能夠對神經細胞構成損傷[7]，提示可建立相應的模型進行化合物的篩選，但目前應用這種模型還很少，其主要原因是α-突觸核蛋白的來源和獲取受到限制。

當前市場上已有商品化的α-突觸核蛋白，但其價格昂貴，如果應用商品化的α-突觸核蛋白建立模型進行大規(guī)模藥物篩選將會造成很大的經濟負擔。本研究旨在通過建立α-突觸核蛋白原核表達體系，優(yōu)化表達和純化條件并完成其科學鑒定，利用純化的α-突觸核蛋白作用神經細胞，建立以α-突觸核蛋白損傷為靶點的細胞篩選模型，用于抗PD創(chuàng)新藥物的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑NdeI和XhoI限制性內切酶及Taq酶購自TaKaRa，TRIzal購自Invitrogen；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，咪唑，考馬斯亮藍R250，SDS，丙烯酰胺，N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺，Agrose購自Amersoco；His TrapTMFF 親和層析柱購自BD公司；α-突觸核蛋白標準品購自Sigma公司；所有細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Invitrogen公司；細胞培養(yǎng)耗材購自Corning， anti-α-synuclein購自Santa Cruz，anti-His購自Clontech，酵母粉、蛋白胨和瓊脂購自Oxoid， PVDF膜購自Millipore?；瘜W發(fā)光檢測試劑購自普利萊公司，其他試劑為國產或進口分析純試劑。

1.2 儀器ECL檢測系統(tǒng)型號-Molecular Device, Lmax， 離心機 Sigma 16KP，基質輔助激光解吸附/飛行時間質譜儀-4800 plus， 美國ABI，酶標儀-Spectra Max190美國 MD，超聲破碎儀-美國SONIC VCX 500。

1.3 細胞株和質粒PC12細胞購自醫(yī)科院基礎所細胞中心，載體pET30a來自Novagen。

1.4 目的基因獲得與載體的構建根據GenBank中的α-突觸核蛋白基因序列[gi:6806897]，設計特異性引物，以pEGFP-N1-syn質粒為模板[8]，PCR擴增目的基因，將擴增產物用NdeI和XhoI雙酶切，回收酶切后的片段，與經過同樣雙酶切的載體pET30a按3 ∶1摩爾比混合，在T4DNA連接酶作用下于16℃連接過夜。過夜連接產物轉化大腸桿菌Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞,涂布到含有質量濃度為50 g·L-1卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過夜，次日，從LB平板上隨機挑取菌落，接種于含有同樣濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h，提取質粒，然后用NdeI/XhoI進行雙酶切鑒定，酶切鑒定為陽性的質粒進行測序。

1.5 目的基因在原核系統(tǒng)的表達用測序正確的質粒以及空載體pET30a轉化大腸桿菌Trans BL21(DE3) pLysS化學感受態(tài)細胞，隨機挑取1個菌落，接種于含有質量濃度為50 g·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜，次日按照1 ∶100的比例將過夜培養(yǎng)物轉接到5 mL含同樣濃度卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當培養(yǎng)液OD600值達到0.2-0.8時，加入不同濃度IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，10 000×g離心15 min收集菌體，取適量菌體加入PBS重懸，超聲裂解，取上清作為樣品，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達情況。

1.6 蛋白的純化將誘導表達的菌體超聲破碎，離心收集上清，緩慢加到已用5倍柱體積去離子水及10倍柱體積Binding Buffer (20 mmol·L-1sodium phosphate，0.5 M NaCl, pH 7.4)平衡的His TrapTMFF 親和層析柱上，流速控制在0.5～1.0 mL，然后用15倍柱體積的Binding Buffer 沖洗柱子，洗去雜蛋白。再分別用濃度10、20、30、40、50、60、70、80、100、250、500 mmol·L-1咪唑洗脫液競爭性梯度洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。上述各個收集液取樣處理，SDS-PAGE電泳檢測蛋白的純化情況。將含目的蛋白而不含雜蛋白的洗脫液進行濃縮，并用PBS置換Buffer后，凍存于-80℃。

1.7 SDS-PAGE電泳后染色及Western blot檢測蛋白表達BCA試劑盒蛋白定量，樣品蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。然后經15%的SDS-PAGE分離，電泳結束后加入考馬斯亮藍R250染色液，固定染色1-2 h后脫色，觀察蛋白的表達。樣品蛋白經SDS-PAGE膠分離后轉移到PVDF膜，質量濃度為30 g·L-1的BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，進行檢測。

1.8 質譜法鑒定表達蛋白配置體積分數為0.3甲醇/0.7乙腈的溶液，用上述溶液配置體積分數為0.001的三氟乙酸，取上述三氟乙酸配置飽和芥子酸溶液為質譜用基質。去離子水配置目的蛋白，濃度為1 g·L-1，將目的蛋白和基質按照1 ∶1的體積比混勻，點樣，上機檢測。

1.9 細胞活力的檢測細胞按5×107·L-1濃度接種于96孔版中，每孔100 μL(5 000細胞/孔)，培養(yǎng)24 h，加入含有濃度為5、10、20、40 μmol·L-1α-突觸核蛋白的培養(yǎng)基處理，每組設6個復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT(質量濃度為50 mg·L-1，細胞孵育箱中培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，震蕩至晶體顆粒溶解，10 min后在酶標儀上測定570 nm的吸光度(A)值。MTT法檢測細胞存活率。細胞存活率/%=(實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.10原代神經元的培養(yǎng) 多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板過夜，PBS洗兩遍，將出生24 h的Sprague Dawley新生鼠，浸泡于體積分數為0.7乙醇浸泡10 s消毒，取出全腦，用手術剪將組織切成(1×1×1) mm3大小，以利于酶消化溶液的滲透，將組織塊轉移到50 mL離心管中，并加入適量的胰酶和DNA酶，置于37℃水浴中消化10 min，胎牛血清終止消化，用DMEM/F12培養(yǎng)基漂洗兩次，即加入DMEM/F12培養(yǎng)基，混勻，4℃ 200g×5 min離心，倒去上清，再加入10～15 mL DMEM/F12，混勻，4℃ 200g×5 min離心，倒去上清，加入適量Neurbasal-A培養(yǎng)基，吹勻，細胞懸液過200目篩，然后過300目篩，顯微鏡下觀察收集的細胞形態(tài)并進行計數和接種，加入質量濃度為5 mg·L-1的阿糖胞苷，培養(yǎng)5～6 d后開始實驗。

2 結果

2.1 pET-30a-syn融合載體的成功構建PCR擴增獲得的目的基因片段經凝膠電泳分離后，在500 bp附近有特異性條帶，與α-突觸核蛋白基因片段的理論分子量基本一致。連接后獲得的轉化子提取的質粒，經酶切得到分子量小于500 bp的特異條帶，與PCR產物大小一致(Fig 1)，表明目的基因已成功克隆至載體。酶切陽性的克隆測序顯示序列正確，可進行表達。

Fig 1 The gel picture of α-synuclein cDNA fragment digested by NdeI and XhoI endonucleases

M: Molecular weight marker DL2000; 1: cDNA fragment of α-synuclein; 2: pET30a; 3: pET30a-synuclein.

2.2 α-突觸核蛋白在原核體系中的表達及鑒定將空載體pET30a與重組載體的菌體裂解提取蛋白，經SDS-PAGE電泳分離后固定、染色及脫色，結果顯示與空載體組相比，在分子量約為20 ku時可見特異性蛋白條帶，大小與標準品基本一致，如Fig 2A所示。為了進一步驗證表達的蛋白是否為目的蛋白，利用pET30a的標簽抗體anti-his以及目的蛋白特異性抗體anti-α-synuclein，通過免疫印跡檢測發(fā)現，在20 ku左右有特異性的條帶，如Fig 2B,C。上述結果表明，位于20 ku附近的特異性條帶是目的蛋白α-突觸核蛋白。

Fig 2 Expression and identification of recombinant α-synuclein

A:The recombination protein of α-synuclein expressed in E.Coli. BL21 (DE3) was separated by SDS-PAGE electrophesis and stained by Coomassie brilliant blue; B: The recombination protein of α-synuclein was separated by SDS-PAGE and immblotted with anti-His antibody; C: The recombination protein of α-synuclein was separated by SDS-PAGE and immblotted with anti-synuclein antibody. (S: standard substance obtained from Sigma; M: sample of mock vecter pET30a; R: sample of recombinant vecter pET30a-synuclein.)

2.3 表達條件的優(yōu)化溫度、IPTG終濃度、宿主菌的增殖狀態(tài)(用OD600表示)及不同表達時間能夠影響外源蛋白在原核宿主菌的表達。根據不同的培養(yǎng)條件，觀察宿主菌中目的蛋白的表達情況。結果(Fig 3)發(fā)現：當溫度為30℃、培養(yǎng)菌液OD600值為0.2、IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1時、誘導時間為7 h、目的蛋白的表達量最多，因此將此優(yōu)化條件確定為α-突觸核蛋白的表達條件。

2.4 純化條件的優(yōu)化將誘導表達的菌體超聲裂解破碎，離心收集上清，加到已用磷酸鹽緩沖液平衡的HisTrapTMFF上，讓其自然通過柱子，然后用含不同濃度咪唑的磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫，收集各洗脫液進行SDS-PAGE檢測，如Fig 4 A，采用20及40 mmol·L-1咪唑分階段洗滌，250 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白；大量樣品經電泳分離后染色，并未發(fā)現更多的雜蛋白，如Fig 4 B，圖片經灰度掃描后顯示，目的蛋白純度約為86%。

2.5 質譜進一步鑒定重組蛋白為了進一步明確純化蛋白是否為α-突觸核蛋白，將純化蛋白進行質譜檢測，質譜檢測結果Fig 5 A顯示商品化標準品的分子量為16.408 ku，Fig 5B顯示目的蛋白分子量為15.34 ku，與理論分子質量15.52 ku基本一致，由此表明，該目的蛋白為α-突觸核蛋白。

Fig 3 Optimization of expression condition about recombinant α-synuclein

A: Expression of recombinant α-synuclein was induced by different concentrations of IPTG. M: Protein marker,1: Before induction, 2: 0, 3: 1×10-4mol·L-1IPTG; 4: 2×10-4mol·L-1IPTG[5: 3×10-4mol·L-1IPTG; 6: 4×10-4mol·L-1IPTG; 7: 5×10-4mol·L-1IPTG; 8: 6×10-4mol·L-1IPTG; 9: 7×10-4mol·L-1; 10: 8×10-4mol·L-1IPTG; 11: 9×10-4mol·L-1; 12: 10×10-4mol·L-1IPTG; B: Recombinant α-synuclein was expressed in E.Coli. BL21 (DE3) of different propagating state evaluated by their optical density (OD600). M: Protein marker; 1:before induction; 2: α-synuclein from Sigma 3:OD600=0.1; 4：OD600=0.2; 5：OD600=0.4; 6：OD600=0.6; 7：OD600=0.8; 8：OD600=1.0. C: Recombinant α-synuclein was expressed in E.Coli. BL21 (DE3) at differents temperature induced by 4×10-4mol·L-1IPTG. M:Protein marker; 1:before induction; 2：16 ℃；3: 20 ℃；4: 25 ℃；5: 28 ℃；6: 30 ℃；7: 37℃. D: Recombinant α-synuclein was induced by 4×10-4mol·L-1IPTG for different times. M: Protein marker; 1:berore induction; 2: 0 h; 3: 1 h; 4: 3 h; 5: 5 h; 6: 7 h; 7: 9 h; 8: 11 h; 9: 20 h.

Fig 4 Optimization of purification condition eluting the recombinant α-synuclein with different imidazole by His TrapTM FF column

A: The recombinant α-synuclein was eluted from different concentration of imidazole. M: Protein marker; 1: 0; 2: 10 mmol·L-13: 20 mmol·L-14: 30 mmol·L-15: 40 mmol·L-16: 50 mmol·L-17: 60 mmol·L-18: 70 mmol·L-19: 80 mmol·L-110: 100 mmol·L-111: 250 mmol·L-112: 500 mmol·L-1. B: The purified α-synuclein was separated by SDS-PAGE gel. M: Protein marker; 1：0.5 μg; 2: 1 μg；3: 2μg; 4: 4μg; 5: 6μg; 6: 8μg; 7: 10 μg; 8:12 μg; 9: 14 μg; 10: 16 μg; 11: 18 μg; 12: 20 μg; 13: 40μg. Arrowhead points to the protein strand of α-synuclein.

Fig 5 Mass spectrum of α-synuclein

A: α-synuclein from Sigma; B: The purified α-synuclein.

2.6 α-突觸核蛋白抑制細胞存活率α-突觸核蛋白可直接對神經元產生損傷，因此本研究將不同濃度的α-突觸核蛋白與PC12細胞或原代神經元共同孵育，通過MTT法檢測細胞活力。結果Fig 6A顯示，α-突觸核蛋白濃度為5 μmol·L-1時，PC12細胞存活率已經開始減弱，濃度為10、20、40 μmol·L-1時，隨著濃度的增加，α-突觸核蛋白對PC12的損傷也越來越明顯，呈一定的劑量依賴性。Fig 6B顯示，α-突觸核蛋白與原代神經元共孵育時，對原代神經元的損傷也具有劑量依賴性，并具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

α-突觸核蛋白是由140個氨基酸組成的小分子蛋白，目前生理功能仍不清楚。有研究表明，在生理狀態(tài)下，α-突觸核蛋白能夠參與神經遞質的釋放，并與囊泡的轉運有關。研究表明，α-突觸核蛋白無論是過表達、突變還是發(fā)生異常修飾，都能夠造成神經元的損傷或神經退行性改變[9]，但具體的作用機制仍需進一步研究。

近來研究發(fā)現，細胞外異常的α-突觸核蛋白能夠影響神經元的功能[6]或毒性作用[10]。研究發(fā)現細胞外的α-突觸核蛋白不僅能夠促進路易小體的形成[11]，同時也能夠誘導膠質細胞的激活，促進神經炎癥的發(fā)生[12]，從而進一步加劇神經元的損傷。胞外的α-突觸核蛋白能夠通過多種方式發(fā)揮毒性作用，如自身形成離子通道激活鉀離子通道；降低胞質膜中膽固醇的含量，改變脂筏中離子通道的分布，從而影響多巴胺的釋放[13]；其最終的其毒性機制都可能與促進細胞內氧化和硝基化應激有關[14]。

Fig 6 Toxic effect of recombinant α-synuclein

A: Effects of purified α-synuclein decreased the viability of PC12 cells. B: Effects of purified α-synuclein decreased the viability of primary cells. Results were repeated 3 times.**P<0.01vscontrol.

研究證明，胞外的α-突觸核蛋白與神經細胞的功能相互影響，在神經元功能紊亂時促進α-突觸核蛋白釋放到胞外[15]，因此胞外的α-突觸核蛋白可做為疾病進展的標志物，而研究細胞外α-突觸核蛋白的作用能夠為闡明PD的發(fā)病機制提供更多的理論線索。本研究將α-突觸核蛋白與神經細胞共孵育，模擬中樞神經系統(tǒng)細胞外的α-突觸核蛋白對神經元的作用模式，在某種程度上可模擬PD發(fā)病過程的某一環(huán)節(jié)，有利于研究胞外的α-突觸核蛋白對神經元的毒性機制?；诖私ⅵ?突觸核蛋白損傷神經元的細胞模型，可進行抗PD創(chuàng)新藥物的研究，對抗帕金森創(chuàng)新藥物的篩選以及作用機制的研究具有重要意義。

模型的建立，需要大量的α-突觸核蛋白。為了獲得大量的人源性α-突觸核蛋白，研究中首先通過分子克隆技術成功構建了α-突觸核蛋白原核表達載體，鑒定成功后進行誘導表達，并優(yōu)化表達和純化條件，可為后續(xù)標準操作程序的建立提供依據。獲得的蛋白結果通過電泳、蛋白免疫印跡和質譜技術，確認α-突觸核蛋白的正確表達并且純度超過86%，為模型的建立提供了物質保障。目前體外篩選抗PD化合物還主要是通過評價細胞存活率的方法進行篩選，通過將α-突觸核蛋白與類神經細胞PC12及原代神經元共孵育，結果發(fā)現，α-突觸核蛋白能夠直接導致上述細胞存活率明顯下降，由此可根據細胞存活率的改變篩選到具有抗α-突觸核蛋白損傷的活性化合物，這些活性化合物將對治療PD更具有特異性。

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Construction of cell model targeted on the damage by α-synuclein

YAN Wen-fen, HENG Yang, SHAO Qian-hang, CHEN Nai-hong, YUAN Yu-he

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionsofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,NeuroscienceCenter,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Aim To construct the cell model targeted on the damage by α-synuclein for screening anti-Parkinson’s Disease (PD) compounds. Methods The cDNA fragment of α-synuclein gene was obtained by PCR methods and inserted into the recombinant prokaryotic plasmid by molecular cloning technique. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli, and subsequently induced to express α-synuclein protein. The recombinant α-synuclein was purified and identified by affinity chromatography, immunoblotting and mass spectrometry. The cells damage by α-synuclein was evaluated through cell viability measured by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide. Results The obtained cDNA fragment of α-synuclein in accordance with its theoretic molecular weight was cloned into pET30a plasmid and verified by sequencing. The recombinant plasmid was transformed into bacteria E.Coli.BL21 (DE3) and induced to express α-synuclein by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression condition was optimized according to the culture temperature, the concentration of IPTG and the proliferation state of bacteria. The purified α-synuclein was proved to be a 15.3 ku molecule weight protein, and could be immunoblotted with anti-α-synuclein antibody. The purified α-synuclein could decrease the viability of PC12 cells and primary neurons significantly, and its effect was in a concentration-dependent manner. Conclusion We have succeeded in constructing the cell model targeted on the damage by α-synuclein.

α-synuclein; toxic damage; Parkinson’s Disease; screen model; protein expression; drug target

時間：2015-3-16 15:41 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.029.html

2014-11-03,

2015-02-15

國家自然科學基金資助項目(No 81274122，81102831, 81373997)；北京市自然科學基金(No 7131013)；教育部博士點基金(No 20121106130001)

閆文芬(1990-)，女，碩士生，研究方向：神經藥理學，Tel: 010-63165182, Fax：010-63165177, E-mail: yanwenfen@imm.ac.cn; 苑玉和(1971-)，女，博士，副研究員，研究方向：神經藥理學，通訊作者,Tel: 010-63165182, Fax：010-63165177, E-mail: yuanyuhe@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.029

A

1001-1978(2015)04-0586-05

R341；R329.25；R394.2；R745.702；R965.1；R977.6