章 毅，劉云峰，高璟英，丁亞琴

(山西醫(yī)科大學(xué) 1.藥理學(xué)教研室、 2.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西 太原 030001)

Efaroxan對(duì)胰島素分泌的調(diào)控機(jī)制研究

章 毅1，劉云峰2，高璟英1，丁亞琴1

(山西醫(yī)科大學(xué) 1.藥理學(xué)教研室、 2.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西 太原 030001)

目的 觀察Efaroxan的促胰島素分泌作用特點(diǎn)，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 應(yīng)用放免法測(cè)定不同條件下Efaroxan對(duì)大鼠胰島素分泌的影響。cAMP放射免疫試劑盒測(cè)定胰島細(xì)胞內(nèi)cAMP含量。結(jié)果 Efaroxan促進(jìn)胰島素分泌作用具有葡萄糖濃度依賴(lài)性，其特點(diǎn)是在高濃度葡萄糖條件下(8.3、11.1 mmol·L-1)增強(qiáng)胰島素分泌，而在低濃度葡萄糖條件下(0、2.8 mmol·L-1)則沒(méi)有作用。Efaroxan的拮抗劑KU14R可明顯抑制Efaroxan對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用，并明顯的抑制了forskolin和IBMX對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用。胰島cAMP含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，forskolin和IBMX明顯增加了胰島細(xì)胞cAMP含量，但是Efaroxan和KU14R對(duì)胰島cAMP含量沒(méi)有影響。結(jié)論 Efaroxan促進(jìn)胰島素分泌作用與激動(dòng)cAMP下游信號(hào)通路有關(guān)，KU14R通過(guò)阻斷cAMP下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制Efaroxan、forskolin和IBMX的促胰島素分泌作用。

Efaroxan；胰島素；環(huán)磷酸腺苷；KU14R；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；胰島功能

Efaroxan屬于咪唑啉類(lèi)藥物，具有促進(jìn)胰島素分泌的作用[1]。電生理和生物化學(xué)研究表明，Efaroxan可與胰島β細(xì)胞的ATP敏感性鉀(KATP)通道的Kir6.2亞單位結(jié)合，進(jìn)而對(duì)胰島素分泌的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[2-3]。因此認(rèn)為Efaroxan的促胰島素分泌機(jī)制類(lèi)似于臨床常用的磺脲類(lèi)抗糖尿病藥物。但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Efaroxan的促胰島素分泌作用具有葡萄糖濃度依賴(lài)特性，與磺脲類(lèi)藥物非葡萄糖濃度依賴(lài)的促胰島素分泌特點(diǎn)有明顯的不同[4]。因此Efaroxan對(duì)KATP通道的阻斷作用可能僅僅是其促胰島素分泌作用的機(jī)制之一，應(yīng)該還有其他更為重要的調(diào)控機(jī)制參與了Efaroxan對(duì)胰島功能的調(diào)控作用，但目前相關(guān)的作用機(jī)制并不清楚。本研究觀察了Efaroxan的促胰島素分泌特點(diǎn)，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料高糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Histopaque 1077、Efaroxan、膠原酶P，多聚賴(lài)氨酸及青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。KU14R購(gòu)自英國(guó)Tocris公司。大鼠胰島由180～250 g Wistar大鼠分離所得。大鼠胰島素放射免疫試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)公司。

1.2 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京博奧恒信)；超凈工作臺(tái)(北京世安科林凈化技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)；電子天平(上海精密儀器)；臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器)；體式顯微鏡(上海中恒儀器)。

1.3 方法

1.3.1 胰島分離及培養(yǎng) 分離大鼠膽總管，將膠原酶P經(jīng)膽總管注入胰腺內(nèi)，摘除含酶液的胰腺，將其置于離心管中37℃水浴消化，收集消化后的胰腺組織，Histopaque 1077梯度離心，顯微鏡下挑取胰島。置于DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)胰島。詳細(xì)步驟參見(jiàn)我們之前報(bào)道的方法[5]。

1.3.2 胰島素分泌實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配制含不同濃度葡萄糖的KRBH孵育液。胰島置于含KRBH的孵育管中，加入待測(cè)藥物，培養(yǎng)箱中孵育60 min，收集上清，放射免疫法測(cè)定胰島素含量。詳細(xì)步驟參見(jiàn)我們之前報(bào)道的方法[5]。

1.3.3 環(huán)磷酸腺苷(cAMP)測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配制含不同濃度葡萄糖的KRBH孵育液。胰島置于含KRBH的孵育管中，加入待測(cè)藥物，培養(yǎng)箱中孵育60 min，超聲波粉碎胰島，放射免疫法測(cè)定cAMP含量。詳細(xì)步驟參見(jiàn)我們之前報(bào)道的方法[5]。

2 結(jié)果

2.1 Efaroxan對(duì)胰島素分泌的影響在不同葡萄糖濃度(0、2.8、8.3、11.1 mmol·L-1)條件下，我們發(fā)現(xiàn)100 μmol·L-1的Efaroxan對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用有明顯的葡萄糖濃度依賴(lài)特性。與其平行對(duì)照組(control)相比，在較低葡萄糖濃度(0、2.8 mmol·L-1)時(shí)，Efaroxan對(duì)胰島素分泌并無(wú)明顯影響；而在較高葡萄糖濃度(8.3、11.1 mmol·L-1)時(shí)，Efaroxan則明顯的促進(jìn)了胰島素的分泌(P<0.01)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effects of Efaroxan on insulin secretion atdifferent glucose ±s,n=6)

**P<0.01vscontrol

2.2 Efaroxan拮抗劑(KU14R)對(duì)Efaroxan和forskolin引起的促胰島素分泌作用的影響本組實(shí)驗(yàn)均在8.3 mmol·L-1葡萄糖濃度條件下完成。同對(duì)照組相比，100 μmol·L-1的Efaroxan明顯的促進(jìn)了胰島素分泌(P<0.01);給予Efaroxan拮抗劑KU14R(100 μmol·L-1)，則明顯的抑制了Efaroxan的作用。應(yīng)用腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑forskolin(5 μmol·L-1)也明顯的促進(jìn)了胰島素分泌，同對(duì)照組比差異有顯著性(P<0.01)。值得注意的是，forskolin的這一作用也可以被KU14R明顯的抑制。Forskolin通過(guò)激動(dòng)腺苷酸環(huán)化酶可使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量增加(見(jiàn)tab 4)，因此本實(shí)驗(yàn)提示Efaroxan促胰島素分泌作用可能與cAMP有關(guān)，見(jiàn)Tab 2。

GroupInsulinrelease/ng·islet-1Control0.83±0.06Efaroxan1.52±0.15##Efaroxan+KU14R0.90±0.07**Forskolin1.75±0.13##Forskolin+KU14R0.96±0.17△△

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsEfaroxan;△△P<0.01vsforskolin

2.3 Efaroxan拮抗劑(KU14R)對(duì)IBMX引起的促胰島素分泌作用的影響在8.3 mmol·L-1葡萄糖濃度條件下，觀察KU14R自身對(duì)胰島素分泌的影響，結(jié)果表明KU14R對(duì)胰島素分泌并沒(méi)有明顯的作用(P>0.05vscontrol)。給予磷酸二酯酶抑制劑IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤,50 μmol·L-1)則明顯促進(jìn)了胰島素分泌(P<0.01vscontrol)。當(dāng)給予KU14R后，IBMX的促胰島素分泌作用則被明顯抑制(P<0.01)。IBMX通過(guò)抑制磷酸二酯酶減少cAMP的降解，從而使胰島β細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增高而發(fā)揮作用(見(jiàn)tab 4)，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明KU14R通過(guò)抑制cAMP信號(hào)通路發(fā)揮抑制胰島素分泌的作用，見(jiàn)Tab 3。

GroupInsulinrelease/ng·islet-1Control0.63±0.05KU14R0.71±0.06IBMX1.25±0.06**IBMX+KU14R0.72±0.04##

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsIBMX

2.4 不同藥物處理對(duì)胰島cAMP含量的影響應(yīng)用cAMP放射免疫測(cè)定試劑盒，我們檢測(cè)了在8.3 mmol·L-1葡萄糖條件下所用藥物對(duì)胰島cAMP含量的影響。結(jié)果表明，在未給予KU14R時(shí)，Efaroxan對(duì)cAMP含量無(wú)明顯影響，但forskolin和IBMX均使cAMP含量明顯升高(P<0.01vscontrol)。當(dāng)給予KU14R后，與其平行對(duì)照組相比，KU14R并沒(méi)有對(duì)cAMP含量產(chǎn)生明顯的影響。詳見(jiàn)Tab 4。

groupcAMP/fmol·islet-1-KU14R+KU14RControl3.81±0.803.9±0.50Efaroxan3.57±0.433.77±0.56Forskolin45.52±2.45**39.76±3.05IBMX23.83±3.06**21.79±3.63

**P<0.01vscontrol

3 討論

在本研究中，我們觀察到Efaroxan具有葡萄糖依賴(lài)性的促進(jìn)胰島素分泌作用，其特點(diǎn)是在高濃度葡萄糖條件下增強(qiáng)胰島素分泌，而在低濃度葡萄糖條件下則沒(méi)有作用，與此前的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[2]。應(yīng)用Efaroxan的拮抗劑KU14R[6, 7]，我們對(duì)Efaroxan的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，KU14R可明顯抑制Efaroxan對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，KU14R明顯的抑制了forskolin對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用。大量研究表明[5]，forskolin可通過(guò)激動(dòng)腺苷酸環(huán)化酶，升高胰島β細(xì)胞cAMP而發(fā)揮促進(jìn)胰島素分泌的作用。因此我們的結(jié)果提示，Efaroxan亦有可能是通過(guò)cAMP信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)胰島素分泌的調(diào)控作用。

進(jìn)一步的研究表明，KU14R自身對(duì)胰島素分泌沒(méi)有影響，但可以抑制IBMX對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用。IBMX是磷酸二酯酶抑制劑，可以抑制磷酸二酯酶對(duì)cAMP的降解作用[8]，從而提高細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量，進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，KU14R是通過(guò)阻斷藥物對(duì)cAMP信號(hào)通路的激活來(lái)發(fā)揮抑制胰島素分泌的作用，提示Efaroxan的促胰島素分泌作用與cAMP信號(hào)通路有關(guān)。

在胰島β細(xì)胞，cAMP的生物作用主要是通過(guò)其下游的蛋白激酶A(PKA)和Epac (exchange protein directly activated by cAMP) 效應(yīng)物來(lái)完成[9-11]。通過(guò)檢測(cè)胰島cAMP含量，我們發(fā)現(xiàn)forskolin和IBMX的確明顯增加了cAMP含量，但是Efaroxan和KU14R對(duì)胰島cAMP含量沒(méi)有影響，表明Efaroxan是通過(guò)激動(dòng)cAMP下游信號(hào)通路發(fā)揮作用的，而KU14R也是通過(guò)阻斷cAMP下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制Efaroxan、forskolin和IBMX的促胰島素分泌作用。

綜上所述，本研究證明了Efaroxan具有葡萄糖依賴(lài)性促進(jìn)胰島素分泌的作用，其作用機(jī)制與胰島β細(xì)胞cAMP下游信號(hào)通路有關(guān)。進(jìn)一步的研究需要證實(shí)Efaroxan與cAMP下游信號(hào)分子PKA和Epac的關(guān)系。本研究為深入理解Efaroxan的促胰島素分泌調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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Effects of efaroxan on insulin release from pancreatic β cells

ZHANG Yi1, LIU Yun-feng2, GAO Jing-ying1，Ding Ya-qin1

(1.DeptofPharmacology; 2.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Aim To study the insulinotropic effects of Efaroxan and the underlying mechanism in rat β cells. Methods Pancreatic islets were isolated by collegenase p digestion. Radioimmunoassay was used to measure insulin secretion and cAMP level in rat pancreatic islets. Results Efaroxan only potentiated insulin secretion at high glucose concentrations(8.3，11.1 mmol·L-1) but not at low glucose concentrations. KU14R,an antagonist of Efaroxan, remarkably inhibited Efaroxan-potentiated insulin secretion; and similarly, KU14R significantly inhibited forskolin-induced and IBMX-induced insulin secretion. cAMP measurement showed that forskolin and IBMX significantly increased cAMP levels, but Efaroxan and KU14R had no effects on cAMP content in pancreatic islets. Conclusion The mechanism of Efaroxan-potentiated insulin secretion is related to downstream of cAMP signaling pathway, KU14R antagonized the downstream of cAMP signaling leading to its inhibitory effects on Efaroxan,forskolin and IBMX-induced insulin secretion.

Efaroxan; insulin; cAMP; KU14R；signal transduction; islet function

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.025.html

2014-11-07,

2015-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81070662、81273564、81373464)；山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2012011039-8, 2013011047-3)；山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計(jì)劃(No 2011-24)；山西省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No 2012-046，2013-111)；山西省衛(wèi)生廳科研課題(No 201201062)；中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床醫(yī)學(xué)科研專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(No 13040440429)；人力資源和社會(huì)保障部擇優(yōu)啟動(dòng)項(xiàng)目(No 2013-277)

章 毅(1971-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:內(nèi)分泌藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 0351-4135132；E-mail：yizhang313@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.017

A

1001-1978(2015)04-0524-04

R-332；R322.57；R342.4；R347.8