席曉慧，王福文，王 燕，尹茂山，牟艷玲

(1.山東省醫(yī)學科學院藥物研究所,2.濟南大學、山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250062)

早期糖尿病大鼠心肌Wnt/β-catenin信號通路的變化

席曉慧1,2，王福文1，王 燕1，尹茂山1,2，牟艷玲1

(1.山東省醫(yī)學科學院藥物研究所,2.濟南大學、山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250062)

目的 檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白在早期糖尿病大鼠心肌中的表達變化，明確其在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 采用鏈脲佐菌素(60 μg·g-1)一次性腹腔注射建立1型糖尿病大鼠模型，喂養(yǎng)2周，HE染色法觀察心肌病理結(jié)構(gòu)變化，Western blot和免疫組化法檢測心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc和DKK1蛋白的表達變化。結(jié)果 顯微鏡下糖尿病組大鼠心肌可見局灶性心肌細胞變性、壞死。糖尿病組大鼠相對于正常對照組心肌Wnt2、β-catenin和c-Myc的表達明顯增加(P<0.01)，而DKK1的表達與正常對照組相比沒有明顯差異(P=0.885)。結(jié)論 Wnt/β-catenin信號通路的激活參與早期糖尿病心肌損傷，進一步研究其在糖尿病心肌中的變化可能為糖尿病心肌病找到新的治療靶點。

Wnt2；β-catenin；DKK1；c-Myc；糖尿??；心肌損傷；鏈脲佐菌素

隨著人們生活水平的提高以及肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，心血管并發(fā)癥是DM患者死亡的主要原因。Wnt/β-catenin信號通路作為一條保守的信號傳導通路廣泛存在于各生物體中，參與調(diào)控細胞增殖、遷移、分化等細胞發(fā)育過程。近年來研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與心肌細胞生長和分化[1]，在心血管疾病中起重要作用[2]。此外，Wnt/β-catenin信號通路的異?？赡芤鸫x綜合征[3]。本文通過檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白在2周 DM大鼠心肌中的表達，探討該信號通路在早期DM心肌中的表達變化，為糖尿病心肌病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立SPF級♂Wistar大鼠20只，體重180～220 g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2013-0001，使用許可證號：SYXK(魯)2014-0007。造模前禁食16 h，用新鮮配制的鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，按60 μg·g-1劑量隨機對10只大鼠一次性腹腔注射，另設正常對照組10只，注射等量溶劑。72 h后尾靜脈采血檢測空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG≥16.7 mmol·L-1，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和體重下降者為DM模型成功。

1.2 材料與試劑STZ(美國Sigma公司，批號：046K1206)；血糖試紙(強生中國醫(yī)療器材有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(SA1020，武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號：08C11B)；濃縮型DAB試劑盒、二抗辣根酶標記山羊抗兔/小鼠抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western一抗、二抗去除液、Western轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購自碧云天生物技術(shù)研究所；ProSieve Color ptrotein makers(美國Lonza Rockland公司)；PVDF膜(0.45 μm，美國SERVA公司)；增強型化學發(fā)光試劑(美國Millipore公司)；所用單克隆抗體為：Wnt2(3169-1，美國Epitomics公司，批號：YJ041913P)，DKK1(3435-1，美國Epitomics公司，批號：YJ110203CS)；β-catenin(9562S，美國Cell Signaling Technology公司，批號：11)；c-Myc(SC-40，美國Santa Cruz公司，批號：C0613)，β-actin(E0012，美國Ambobio公司，批號：012573)。

1.3 儀器Wallac1420型多標記計數(shù)儀(美國Perkinelmer公司)；RM2235型石蠟包埋機、EG1150型切片機(德國Leica公司)；J-25型高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；LAS4000型化學發(fā)光成像儀(日本Fujifilm公司)；Eclipse TE 2000-S型免疫熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4 標本收集大鼠麻醉，開胸，迅速取出心臟，用預冷生理鹽水洗凈，剔除血管、脂肪等非心肌組織，濾紙吸干水分后稱心臟重量和左心室(含室間隔)重量，并計算心臟(左心室)指數(shù)=心臟(左心室)重量(mg)/體重(g)。分離的左心室再分為兩部分：第一部分用福爾馬林固定，經(jīng)脫水、透明、包埋，制成心肌組織石蠟塊；第二部分置于EP管，于液氮中保存待用。

1.5 HE染色取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色10 min，流水稍洗，體積分數(shù)為0.01的鹽酸乙醇分化，流水沖洗數(shù)分鐘，伊紅染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)的改變。

1.6 Western blot每20 mg心肌組織中加入100～200 μl含1 mmol·L-1PMSF的裂解液，制備組織勻漿，4 ℃下14 000×g離心10 min，取勻漿上清，BCA法測定總蛋白濃度。每孔上樣30～50 μg總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后冰浴下恒流(300 mA)濕法轉(zhuǎn)膜2 h，質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，與相應一抗4 ℃共孵育過夜，抗體稀釋比例分別為Wnt2(1 ∶2 000)、β-catenin(1 ∶1 000)、c-Myc(1 ∶500)及DKK1(1 ∶1 000)。次日TBS-T洗液(PH 7.6)洗滌后，與辣根酶標記的二抗共孵育，用增強型化學發(fā)光試劑進行顯色，并利用AlphaEaseFC 4.0灰度分析軟件定量分析，以β-actin的灰度值標化蛋白表達。

1.7 免疫組化(IHC)取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS，PH 7.4)洗滌，浸入體積分數(shù)為0.03的過氧化氫封閉液中，室溫封閉30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。枸櫞酸緩沖液(0.01 mol·L-1，PH 6.0)高壓3 min以修復抗原，自然冷卻至室溫。PBS洗滌后滴加一抗，4 ℃濕盒過夜，抗體稀釋比例分別為Wnt2(1 ∶300)、β-catenin(1 ∶1 800)及c-Myc(1 ∶200)。次日切片恢復至室溫后，分別滴加二抗和辣根酶標記工作液，37 ℃溫箱分別孵育20 min。PBS洗滌后DAB顯色，蘇木精輕度復染，自來水水洗返藍，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察結(jié)果。每組隨機取10個視野，通過Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定平均積分光密度值(IOD)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠模型建立情況實驗期間，正常對照組大鼠一般狀態(tài)良好、健壯、皮毛有光澤，對外界反應靈敏。與正常對照組比較，DM組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛無光澤，腥臊酮臭味加重等。造模成功9只。

2.2 大鼠體重及心臟各指標的測定結(jié)果2周后，正常對照組大鼠體重增加，F(xiàn)BG正常，與正常對照組相比DM組大鼠體重、心臟及左心室重量均明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)BG明顯升高(P<0.01)，心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均高于對照組(P<0.05，Tab 1)。

Tab 1 General characteristic of the ±s,n=9)

BW：Body weight；HW：Heart weight；LVW：Left ventricular weight；FBG：Fasting blood glucose；*P<0.05，**P<0.01vscontrol

2.3 大鼠心肌組織病理觀察結(jié)果正常對照組大鼠心肌紋理清晰，心肌細胞排列整齊，細胞核均勻分布，無變性、壞死等病理結(jié)構(gòu)改變。DM組9只大鼠中有7只觀察到不同程度的病變，其心肌細胞胞質(zhì)豐富，細胞核形狀不規(guī)則，排列紊亂，局部可見心肌細胞變性、壞死(Fig 1)。

Fig 1 Changes of cardiac pathological structure(HE×400)

A:Control;B:2 wk DM

2.4 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白在大鼠心肌中的表達Western blot實驗結(jié)果(Fig 2)表明,2周DM大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc蛋白的表達相對于正常對照組明顯增加(P<0.01)，但DKK1的表達變化不明顯(P=0.885)。IHC結(jié)果(Fig 3)顯示正常組大鼠心肌中各蛋白表達均勻分布，DM組大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc的表達均明顯增加，其中β-catenin伴隨少量核表達，c-Myc在細胞質(zhì)和細胞核中表達均增加。

Fig 2 Myocardial expression levels of Wnt2, β-catenin, c-Myc

**P<0.01vscontrol

3 討論

DM時胰島素分泌減少，葡萄糖利用不足，脂肪組織脂解增加，從而導致游離脂肪酸的堆積，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)氧化應激、線粒體損傷，進而導致細胞凋亡、炎癥反應增加和心肌纖維化等病理改變，同時出現(xiàn)心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變[4-5]。本研究中，2周DM大鼠FBG明顯升高，體重明顯低于正常對照組，2周DM大鼠心肌出現(xiàn)局灶性心肌細胞變性、壞死，表明DM早期出現(xiàn)心肌損傷。但本實驗未觀察到明顯心肌肥大，其中大鼠心臟指數(shù)和左心室指數(shù)的增加可能與DM大鼠體重的降低有關(guān)。

Wnt/β-catenin信號通路是近年來在分子生物學、細胞生物學和腫瘤學中的研究熱點之一，其在心肌損傷中的作用也被廣泛關(guān)注。實驗性心肌梗死后Wnt2的表達增加[6]，β-catenin的抑制有益于成人左心室重塑[7]，撲蟯靈(pyrvinium)作為Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制劑能明顯改善心肌重塑[8]。這些研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與心肌損傷。此外，研究發(fā)現(xiàn)早期Wnt/β-catenin信號通路的異常會引起糖代謝的異常[9]，增加2型糖尿病的風險[10]，并參與高糖介導的腎上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程[11]。因此，我們推測Wnt/β-catenin信號通路可能在DM心肌損傷中起重要作用。

Fig 3 Myocardial expressions of Wnt2, β-catenin and c-Myc tested by immunohistochemistry (×400)

Black arrows pointing to the nucleus expression；n=10 random fields for each group,**P<0.01vscontrol

Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導過程中，Wnt蛋白與細胞膜上的跨膜受體結(jié)合，促使β-catenin降解復合體軸蛋白/結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白/糖原合成酶激酶3β(Axin/APC/GSK-3β)解聚而失活，抑制β-catenin的磷酸化及降解，促進β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef結(jié)合，激活下游靶基因啟動基因轉(zhuǎn)錄[2]。本研究中Western blot及IHC結(jié)果表明,2周DM大鼠心肌Wnt2的表達增加，促進β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移，從而增加下游靶基因c-Myc的表達，β-catenin及下游靶基因表達的增加可能引起早期DM大鼠心肌細胞的變性、壞死，并進一步引起心肌肥大、心肌纖維化等病變[7, 12]。但DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路的內(nèi)源性抑制劑，在2周DM大鼠心肌中尚沒有明顯變化，其在DM心肌發(fā)展過程中的表達還需要進一步研究。

糖尿病心肌病是糖尿病性心臟病的特異性病變，是糖尿病心血管嚴重并發(fā)癥的重要組成部分，明確其發(fā)生發(fā)展機制，進而阻滯其發(fā)展成為研究熱點。本實驗揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路的激活參與早期DM心肌損傷，我們將進一步研究其在DM心肌發(fā)展過程中的作用機制，以期為糖尿病心肌病的治療找到新的靶點。

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Alteration of Wnt/β-catenin signaling pathway in early diabetic rat myocardium

XI Xiao-hui, WANG Fu-wen, WANG Yan, YIN Mao-shan, MU Yan-ling

(1.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences, 2.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China)

Aim To investigate the alteration of Wnt/β-catenin signaling pathway in early diabetic rat myocardium and clarify its role in development of diabetic cardiomyopathy. Methods The diabetes mellitus (DM) model was prepared by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 60 μg·g-1). The alteration of Wnt/β-catenin signaling pathway was determined by Western blot and immunohistochemistry. HE staining was used to analyze the change of myocardial pathological structure. Results Cardiac histological analyses revealed that DM induced cardiomyocyte degeneration and necrosis. Myocardial Wnt2, β-catenin and c-Myc were enhanced in 2 wk DM compared with control group while DKK1 showed no significant alteration. Conclusion Wnt/β-catenin signaling pathway is activated in early diabetic myocardial injury. Further researches on its role in DM myocardium may find a new therapeutic target for diabetic cardiomyopathy.

Wnt2; β-catenin; DKK1; c-Myc; diabetes mellitus; myocardial injury; streptozotocin

時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.014.html

2014-11-20,

2014-12-30

國家自然科學基金資助項目(No 30701022)；山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金計劃項目(No BS2013SW008)

席曉慧(1990-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學，E-mail：xiaohuixi08@163.com； 牟艷玲(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：心腦血管藥理學，通訊作者，Tel:0531-82612443,E-mail：myling501@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.014

A

1001-1978(2015)03-0363-04

R-332；R322.11；R329.25；R587.1；R587.2