劉麗哲， 張 敏， 劉宜先， 崔 鑫， 胡玉燕， 李文斌△

(1. 河北醫(yī)科大學病理生理學教研室， 2. 河北醫(yī)科大學生理學教研室， 石家莊 050017)

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膠質(zhì)細胞谷氨酸轉運體-1a反義寡核苷酸的設計及效果評價*

劉麗哲1， 張 敏1， 劉宜先2， 崔 鑫1， 胡玉燕1， 李文斌1△

(1. 河北醫(yī)科大學病理生理學教研室， 2. 河北醫(yī)科大學生理學教研室， 石家莊 050017)

目的：應用IDT公司的Antisense design software設計膠質(zhì)細胞谷氨酸轉運體-1a(GLT-1a)的反義寡核苷酸(AS-ODNs)，并對其進行效果評價。方法：首先根據(jù)GLT-1a mRNA羧基末端特異序列，設計GLT-1a AS-ODNs；在此基礎上，應用Western blot方法對設計的5條GLT-1a AS-ODNs抑制大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達的效果進行評價。結果：序列為5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’的GLT-1a AS-ODNs可特異性地抑制大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達，而對GLT-1b的表達無影響。該AS-ODNs對sham和頭孢曲松鈉(Cef)誘導的大鼠GLT-1a的表達上調(diào)的抑制效果類似，均>60%；對腦缺血預處理(CIP)誘導的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達的上調(diào)亦具有明顯的抑制作用，抑制效果>60%。結論：從設計的5條GLT-1a AS-ODNs中獲得了可特異性抑制GLT-la表達的反義寡核苷酸序列。

GLT-1a；反義寡核苷酸；頭孢曲松鈉；腦缺血預處理；海馬；大鼠

細胞外谷氨酸濃度的異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。膠質(zhì)細胞谷氨酸轉運體-1(glial glutamate transproter-1， GLT-1)在清除細胞外谷氨酸，使其維持低濃度方面發(fā)揮重要作用。因此對GLT-1的研究具有非常重要的理論和臨床意義。根據(jù)羧基端不同，可將GLT-1分為GLT-1a， GLT-1b， GLT-1c三種剪接變異體，其中在海馬GLT-1a占總GLT-1的90%左右[1]。隨著研究的深入，GLT-1a在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益受到重視，而研究GLT-1a在眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用機制一個重要策略是阻斷其表達和功能。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)GLT-1a的特異性阻斷劑。反義技術主要是利用Watson-Cricker 堿基配對原理，合成一段DNA或RNA片段，此片段與靶基因或mRNA具有互補序列，并能與特定的靶基因或mRNA形成雜交鏈，從而選擇性地沉默靶基因。1978年，Stephenson 和Zamenick 報道[2]，與Rous病毒核酸序列互補的13 mer反義寡聚脫氧核苷酸能夠抑制Rous病毒復制，首次提出了反義寡聚脫氧核糖核酸能夠抑制特定基因表達的概念。從80年代末至今，人們利用反義核酸技術，進行了一系列的體外和體內(nèi)抑制特定基因表達的實驗。如有學者利用凋亡相關基因的反義寡核苷酸，研究該基因對癌組織的凋亡作用[3,4]；也有學者設計疾病相關因子的反義寡核苷酸，從而研究該因子在疾病中的作用等等[5,6]。因此，本實驗針對GLT-1a mRNA羧基末端的特異序列進行GLT-1a AS-ODNs設計，利用Western blot技術對所設計的AS-ODNs進行篩選與效果評價，為研究GLT-1a在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供可靠的技術方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Alpha Imager凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Alpha Inotech公司)，江灣Ⅰ型腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)，EBA 12型高速低溫離心機(德國Hettich公司)，DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份公司)，酶標儀(奧地利TECAN)，水浴雙垂直電泳槽(北京醫(yī)療設備廠)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，307-6臺式牙鉆車(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

GLT1a AS-ODNs、Sense ODNs及Missense ODNs序列(本實驗室設計，上海生物工程技術服務有限公司生產(chǎn))；兔來源GLT-1a多克隆抗體和小鼠來源GLT-1b單克隆抗體(Thermo公司)；小鼠來源β-actin多克隆抗體IgG1(Santa Curz Biotechnology公司)；生物素標記山羊抗兔和生物素標記山羊抗小鼠IgG(KPL公司)；辣根酶標記的鏈霉卵白素(Zymed laboratories公司)；頭孢曲松鈉(廣州白云山制藥總廠)；DAB(北京中杉生物工程公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀和氯化鈣(北京化學試劑公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；腦室套管(深圳瑞沃德公司)；義齒基托樹脂(Ⅱ型)(上海醫(yī)療器械股份有限公司)；502膠(廣東愛必達膠粘劑有限公司)。

1.2 GLT-1a AS-ODNs的設計

根據(jù)大鼠GLT-1a mRNA羧基末端的特異序列(圖1)，應用IDT公司的Antisense design software設計了5條GLT-1a AS-ODNs，5條GLT-1a AS-ODNs 依次簡稱為P1、P2、P3、P4、P5，其序列及對應的靶點序列見表1。

Fig. 1 C terminus specific sequences of GLT-1a mRNA

Tab. 1 Sequences of GLT-1a AS-ODNs(P1-P5) and their sequences of target point in rats

1.3 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠75只，體重280～320 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。在實驗室飼養(yǎng)1～2 d后，右側腦室置管以建立側腦室給藥通道，恢復5 d后隨機分為15組(n=5)。共包括以下3部分，各部分分組如下：

1.3.1 GLT-1a AS-ODNs對頭孢曲松鈉(ceftriaxone, Cef)誘導的GLT-1a蛋白表達上調(diào)的影響 (1)Cef+溶劑組：腹腔注射Cef(200 mg/kg)，每日1次，共5次；于第1次注射Cef后36 h、72 h以及108 h右側腦室注射雙蒸水(DW)(GLT-1a AS-ODNs的溶劑)10 μl；(2)Cef+GLT-1a AS-ODNs組：進一步分為P1～P5 5個亞組，分別給予相對應的GLT-1a AS-ODNs雙蒸水溶液10 μl(18 nmol)，給予方法與(1)組雙蒸水的給予方法相同。其它處理同(1)組。通過Western blot檢測GLT-1a蛋白的表達數(shù)量。選擇抑制效果>60%的序列，進一步觀察其對GLT-1b蛋白表達的影響，以確定其抑制GLT-1a蛋白表達的特異性。

1.3.2 GLT-1a AS-ODNs對sham及Cef處理的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達抑制效果的比較

(1)Sham組：腹腔注射生理鹽水(NS，0.8 ml/kg)，每日1次，共6次，于每次腹腔注射后即刻側腦室注射DW 10 μl；(2)AS-ODNs組：以同樣方法于每次腹腔注射NS后即刻側腦室注射GLT-1a AS-ODNs的雙蒸水溶液10 μl(15 nmol)；(3)Cef+溶劑組：腹腔注射Cef(200 mg/kg)，每日1次，共6次，于每次注射Cef后即刻側腦室注射DW 10 μl；(4)Cef+GLT-1a AS-ONDs: 于每次腹腔注射Cef后即刻側腦室注射GLT-1a AS-ODNs 的雙蒸水溶液10 μl(15 nmol)，每日1次，共6次。以上各組均于末次腹腔注射后2 d取大鼠海馬CA1區(qū)，應用Western免疫印跡分析法檢測GLT-1a的表達。

1.3.3 GLT-1a AS-ODNs對腦缺血預處理 (cerebral ischemic preconditioning , CIP)誘導的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達的抑制作用 (1) Sham組：給大鼠進行全腦缺血的sham手術。(2) CIP組：給大鼠CIP處理3 min，之后恢復再灌流。 (3) AS-ODNs+CIP組：于CIP前2 d開始給大鼠側腦室注射GLT-1a AS-ODNs溶液(15 μl，25 nmol)，后每間隔24 h注射1次，連續(xù)注射4次，其余處理同CIP組。同時，設GLT-1a的Sense ODNs (5’-TGCAGTGTTGAGGAAG AAC C-3’)和Missense ODNs (5’-GGTTCTTCGTCTACACTGCA-3’)對照組，分別側腦室注射相對應的ODNs溶液。以上各組均于sham或CIP后2 d取海馬CA1區(qū)，應用Western免疫印跡分析法檢測大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a的表達。

1.4 大鼠右側腦室埋管

給大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，將其固定于腦立體定位儀(江灣I型C立體定位儀)上，首先切開頭頂部皮膚，以充分暴露手術視野，然后分離骨膜，參照腦立體定位圖譜，確定Bregmar點并標記，在此點右側旁開1.5 mm，向后0.8 mm處顱骨鉆孔，在此孔周圍避開骨縫選擇3個合適位置顱骨鉆孔，深度適宜且不鉆透，固定手表螺絲于3孔。將套管恢復至所鉆第1個孔處，從骨面向下進3.8 mm，Ⅱ型義齒基托樹脂固定注射套管以備側腦室給藥。動物回籠納入單籠飼養(yǎng)，自由食水。

1.5 側腦室注射

誘導大鼠鉆入自制鼠袋中，露出鼻孔及套管外帽，待動物安靜后，在大鼠清醒安靜狀態(tài)下將內(nèi)芯旋出，將以PE50管連接微量注射器的消毒的內(nèi)針插入，同時緩慢將藥物推入(10 min)，留針10 min。注射結束后蓋好套管帽，動物回單籠繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6 CIP

全腦缺血3 min作為CIP。采用四血管閉塞法制造大鼠全腦缺血模型[7,8]。首先凝閉雙側椎動脈，具體操作如下：10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，枕骨后背側頸部作縱切口約1.5 cm大小，后分離兩側頸旁肌以暴露第一頸椎橫突，找到翼狀孔后將預熱的電灼針插入翼狀孔中，將雙側椎動脈電熱凝閉，使其永久閉塞。術后常規(guī)飼養(yǎng)，恢復2 d后行CIP。在乙醚吸入麻醉下，分離雙側頸總動脈，待動物清醒后夾閉雙側頸總動脈持續(xù)3 min后恢復雙側頸總動脈血流再灌。之后，慶大霉素沖洗、縫合傷口。在實驗過程中，應用白熾燈照射以維持動物肛溫在37℃，到恢復活動為止。全腦缺血前后觀察大鼠翻正反射及瞳孔變化等以判斷是否成功誘導全腦缺血。Sham組僅分離、暴露雙側椎動脈和雙側頸總動脈，但不阻斷血流。

1.7 Western blot分析

各組大鼠在預定時間斷頭取腦，分離海馬CA1區(qū)，分析天平稱重后加入10倍體積的預冷裂解液，于冰浴下制成勻漿后靜置30 min，4℃12 000×g離心15 min，取上清分裝。提取蛋白后采用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。然后取蛋白樣品50 μg ，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白，電轉膜法轉移蛋白至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉后加入GLT-1a(兔抗大鼠，1∶1 000，lot no.: KH137955)、GLT-1b(小鼠抗大鼠，1∶1 000，lot no.: KL1273662)或β-Actin(小鼠抗大鼠，1∶1 500，lot no.:SC-4778)一抗，并于37℃孵育1 h，4℃靜置過夜，洗滌液 ( TBS， 0.05 % Tween 20) 洗滌3次，加入二抗(羊抗兔或羊抗小鼠，1∶2 000，Lot no.:090207或Lot no.:080219) 37℃孵育 1 h ，洗滌液 ( TBS，0.05 % Tween 20) 洗滌3次，加入三抗(辣根酶標記的鏈霉卵白素，1∶1 000，Lot no.: 650578A)37℃孵育1 h，DAB顯色。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 GLT-1a AS-ODNs對Cef誘導的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達的影響

Cef+溶劑組大鼠海馬CA1區(qū)可見較強的GLT-1a表達(圖2)和一定程度的GLT-1b的表達(圖3)，與Cef+溶劑組相比，Cef+AS-ODNs(P2)組GLT-1a的表達明顯降低，抑制效果>60%，而其它各組GLT-1a的表達均無明顯變化(圖2)；Cef+AS-ODNs(P2)組GLT-1b的蛋白表達無明顯變化(圖3)。以上結果表明，所設計的GLT-1a的5條AS-ODNs(P1～P5)中，P2能夠有效抑制大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白的表達，且其抑制效果具有特異性。因此，以下所有AS-ODNs均為該鏈。

2.2 GLT-1a AS-ODNs對sham及Cef誘導大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達抑制效果比較

Sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見GLT-1a的基礎表達。與sham組相比，AS-ODNs組GLT-1a蛋白表達明顯下降，其表達量約占sham組的21%。Cef+溶劑組大鼠海馬CA1區(qū)可見較高的GLT-1a的表達。與Cef+溶劑組相比，Cef+AS-ODNs組GLT-1a蛋白表達明顯下降，其表達量約占Cef+AS-ODNs組的29%(圖4)。以上結果表明，GLT-1a AS-ODNs即可抑制正常大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a的基礎表達，又可抑制Cef引起的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達的上調(diào)，且其抑制效果相似，均>60%。

2.3 GLT-1a AS-ODNs對CIP誘導的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達上調(diào)的抑制作用

Sham組可見大鼠海馬CA1區(qū)有一定量的GLT-1a基礎表達。與sham組相比，CIP后GLT-1a的表達明顯上調(diào)。側腦室注射GLT-1a AS-ODNs可抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表達上調(diào)及GLT-1a的基礎表達，表現(xiàn)為CIP+AS-ODNs組的GLT-1a蛋白表達與CIP組及sham組相比明顯下調(diào)，而側腦室注射GLT-1a Sense ODNs或Missense ODNs溶液則對CIP誘導的GLT-1a蛋白表達上調(diào)無明顯影響，表現(xiàn)為Sense ODNs對照組和Missense ODNs對照組的GLT-1a蛋白表達與CIP組相比無明顯變化 (圖5)。 以上結果表明，GLT-1a AS-ODNs可以有效地抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表達的上調(diào)。

3 討論

近年來對GLT-1及其剪接變異體的研究越來越深入。Dumont[9]等對肌萎縮性側索硬化癥(ALS)的患者和疾病的動物模型中GLT-1的活性及其剪接變異體GLT-1a和GLT-1b的表達進行了研究，結果顯示隨著疾病的進展，GLT-1的總體活性降低，GLT-1a在顳葉皮層表達顯著降低，而GLT-1b表達顯著增高；在腰髓，GLT-1a和GLT-1b表達均明顯升高。Amélie[10]等通過體外細胞培養(yǎng)的方法，研究TNF-α通過對肌萎縮側所硬化大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞的GLT-1a和GLT-1b表達及活性調(diào)節(jié)影響谷氨酸轉運。而Meabon[11]等學者對GLT-1的剪接變異體在胰腺的表達進行了研究，胰島的β及α細胞都表達GLT-1a和GLT-1b，而外分泌導管區(qū)域主要表達GLT-1b。且發(fā)現(xiàn)在胰島谷氨酰胺合成酶與GLT-1a和GLT-1b共表達，表明在胰腺GLT-1參與谷氨酰胺合成。以上眾多研究提示GLT-1a和GLT-1b在同一處理因素下有著不同的調(diào)節(jié)，它們的作用值得進一步研究。

反義寡核苷酸是一段短序列的單鏈DNA，體外化學合成后，在體內(nèi)按照堿基互補配對的原則，與其相對應的靶點序列互補，形成雜交鏈以干擾基因的復制、轉錄、剪切以及翻譯，最終阻斷某種蛋白的合成。近年來反義技術被廣泛應用于各種研究，例如有學者應用P38 MAPK的反義寡核苷酸，研究其在肢體缺血預處理誘導的腦缺血耐受中的作用[12]，還有學者應用RyR的反義寡核苷酸研究Ryanodine受體對氣道平滑肌細胞增值及細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響[13]。本實驗設計GLT-1a的反義寡核苷酸旨在為研究其在腦缺血預處理誘導的腦保護中的作用提供方便，而大鼠海馬CA1區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域，因此整個實驗選用此區(qū)。而應用反義寡核苷酸進行研究必須設置嚴格的對照以便明確其特異的抑制效應。本實驗在腦缺血預處理(CIP)動物模型的基礎上，設置CIP+AS-ODNs組的對照組CIP+Sense ODNs及CIP+ Missense ODNs，結果表明GLT-1a AS-ODNs能夠顯著抑制CIP誘導的GLT-1a蛋白的表達上調(diào)，而兩個對照組對CIP誘導的GLT-1a蛋白的表達上調(diào)無影響。從而證實了所設計的AS-ODNs對目的基因的特異性抑制作用。

2005年Rothstein[14]等研究發(fā)現(xiàn)Cef可以上調(diào)大鼠海馬組織GLT-1的表達，我室在2012[15]年就研究發(fā)現(xiàn)Cef對大鼠海馬組織GLT-1a蛋白表達具有明顯的上調(diào)作用，因此為了能夠增強對比，提高篩選效率，本研究中我們以腹腔注射Cef的動物模型為篩選平臺，使用Western blot免疫印跡方法，篩選能夠有效抑制GLT-1a蛋白表達的反義寡核苷酸鏈。結果發(fā)現(xiàn)在這5條鏈中，只有P2鏈能夠抑制目的基因的表達。說明通過計算機軟件可以幫助我們尋找反義寡核苷酸作用的靶點，但必須通過實驗來進一步證實其抑制作用。隨后比較了GLT-1a AS-ODNs對sham及Cef誘導大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達的抑制效果，結果發(fā)現(xiàn)GLT-1a AS-ODNs對這兩種大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1a蛋白表達均有明顯的抑制作用，且抑制效果相似都>60%，表明所用劑量的GLT-1a AS-ODNs沒有因為Cef上調(diào)了GLT-1a蛋白表達而影響其抑制效果。說明其抑制效果穩(wěn)定。最后本實驗將其應用與腦缺血預處理大鼠，又明確了其對CIP誘導的GLT-1a表達上調(diào)的特異性抑制作用，進一步證實了其對目的基因強有力的抑制作用，并為研究GLT-1a在CIP誘導的腦保護作用中的功能提供實驗依據(jù)。

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Designation and evaluation of antisense oligodeoxynucleotides targeted to glial glutamate transporter-1a

LIU Li-zhe1, ZHANG Min1, LIU Yi-xian2, CUI Xin1, HU Yu-yan1, LI Wen-bin1△

(1. Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, 2. Department of Physiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Objective: The present study was undertaken to design antisense oligodeoxynucleotides (AS-ODNs) of glial glutamate transporter-1a (GLT-1a) and to evaluate the effectiveness of the designed AS-ODNs on the expression of GLT-1a. Methods: Five sequences of GLT-1a AS-ODNs were designed according to the C terminus specific sequences of GLT-1a mRNA using antisense design software of IDT Company. Western blot analysis was used to evaluate the inhibition effects of the five GLT-1a AS-ODNs on the expression of GLT-1a. Results: The sequence of GLT-1a AS-ODNs with sequence of 5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’ could specifically inhibit the expression of GLT-1a in the hippocampal CA1 subfield of rats, while it had no effect on the expression of GLT-1b. This sequence showed similar inhibition on the expression of GLT-1a in sham and ceftriaxone (Cef) -treated rats. It could also significantly inhibit the cerebral ischemic preconditioning (CIP) -induced up-regulation in the expression of GLT-1a. The magnitude of the inhibition in sham, Cef- or CIP- treated rats was similar by more than 60%. Conclusion: From the designed five sequences of GLT-1a AS-ODNs, we obtained an effective sequence which can specifically inhibit the expression of GLT-1a.

GLT-1a; AS-ODNs; ceftriaxone; cerebral ischemic preconditioning; hippocampus; rat

國家自然科學基金資助項目(81271454)

2014-10-13

2015-02-12

R363

A

1000-6834(2015)03-238-06

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.012

△【通訊作者】Tel： 0311-86265607； E-mail： liwbsjz@163.com