趙明亮， 陳以勝， 李曉紅， 王景景， 涂 悅， 孫洪濤， 張賽， 陳 羽中,3△

(1. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)生物細(xì)胞治療科, 2. 腦創(chuàng)傷及神經(jīng)疾病研究所， 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室, 天津 300162；3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生部， 天津 300193)

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顱腦創(chuàng)傷后的化學(xué)微環(huán)境對溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響*

趙明亮1,2， 陳以勝2， 李曉紅2， 王景景2， 涂 悅2， 孫洪濤2， 張賽2， 陳 羽中2,3△

(1. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)生物細(xì)胞治療科, 2. 腦創(chuàng)傷及神經(jīng)疾病研究所， 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室, 天津 300162；3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生部， 天津 300193)

目的：模擬顱腦創(chuàng)傷(TBI)后的化學(xué)微環(huán)境，探討損傷組織提取液對溫度敏感型臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(tsUC)增殖和分化影響。方法：用液壓沖擊損傷儀建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，獲取損傷區(qū)域腦組織的勻漿液，用于模擬TBI后的化學(xué)微環(huán)境。分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC)，通過感染攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以建立tsUC系。在模擬腦組織彈性模量的聚丙烯酰胺水凝膠上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。實驗分為UC組(37℃，加入PBS)、tsUC組(33℃，加入PBS)、UC+提取液組(37℃)、tsUC+提取液組(33℃ 持續(xù)3 d，后轉(zhuǎn)至37℃)(n=4)。動態(tài)觀察各組細(xì)胞的生長情況和形態(tài)變化，24 h后檢測細(xì)胞的凋亡水平，3 d檢測細(xì)胞的增殖情況，7 d檢測其向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的水平。 結(jié)果：與UC+提取液組相比，tsUC+提取液組的凋亡細(xì)胞和增殖率分別顯著性減少和增加(P<0.01)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，tsUC+提取液組GFAP和NeuN陽性細(xì)胞均比UC+提取液組顯著性增加(P<0.01)。結(jié)論：在模擬腦損傷的化學(xué)微環(huán)境中，溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合亞低溫可顯著逆轉(zhuǎn)腦損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及向神經(jīng)細(xì)胞的分化，從體外角度證實了溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在亞低溫環(huán)境下對TBI后腦組織微環(huán)境的適應(yīng)性和耐受性。

顱腦創(chuàng)傷；化學(xué)微環(huán)境；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；亞低溫；腦組織提取物；

微環(huán)境的穩(wěn)定是保持細(xì)胞正常增殖、分化、代謝和功能活動的重要條件。移植干細(xì)胞在目標(biāo)部位存活且分化為功能細(xì)胞是干細(xì)胞發(fā)揮作用的前提和關(guān)鍵，而影響干細(xì)胞行為的決定性因素主要是局部的微環(huán)境。微環(huán)境包括化學(xué)微環(huán)境和物理微環(huán)境。創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)，簡稱顱腦創(chuàng)傷，其高致死率和致殘率，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。TBI后可引起大量炎癥因子和自由基的產(chǎn)生與釋放、鈣離子的內(nèi)流等化學(xué)微環(huán)境的改變。研究證實，33℃～35℃低溫(亞低溫)能顯著降低TBI的病死率和改善預(yù)后。雖然干細(xì)胞移植在TBI 治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，然而TBI后原發(fā)性和繼發(fā)性損傷所致的化學(xué)微環(huán)境，不利于移植干細(xì)胞的存活和分化，嚴(yán)重降低了干細(xì)胞的修復(fù)療效。

本室在前期的實驗中成功建立了溫度敏感型臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells，tsUC)系。該細(xì)胞系因表達(dá)溫度敏感性猿猴病毒40大T(temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen，ts-SV40LT)蛋白而在33℃(亞低溫)下的增殖活性最大，而在37℃～39℃正常腦溫下停止增殖而轉(zhuǎn)向分化。tsUC 的應(yīng)用既能擴(kuò)增干細(xì)胞數(shù)量以滿足臨床的需要，又具有橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，同時tsUC最大增殖活性的溫度與亞低溫治療的最適溫度相契合，因此可能是改善和適應(yīng)TBI后損傷微環(huán)境的理想干細(xì)胞。本實驗通過用TBI腦組織勻漿模擬TBI后的化學(xué)微環(huán)境和腦組織的彈性量，探討tsUC在該環(huán)境下的增殖和分化能力，以評估tsUC對TBI損傷微環(huán)境的適應(yīng)能力。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和試劑

新生兒臍帶(由武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，已通過倫理學(xué)審查)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP)，神經(jīng)元蛋白抗體(NeuN)，Brdu抗體，SV40LT抗體(Abcam， 美國)，熒光標(biāo)記二抗(Millipore，美國)，Brdu化合物(Sigma，美國)，單丙烯酰胺(Amresco，美國)，雙丙烯酰胺(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，I型膠原蛋白(Sigma，美國)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑(天津鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，中國)。

1.2 聚丙烯酰胺水凝膠的制備和檢測

聚丙烯酰胺水凝膠是一種無色透明的類似果凍狀的液態(tài)物質(zhì)。本實驗用其制備的樣品硬度近似腦組織。將單丙烯酰胺和雙丙烯酰胺按一定比例混合后用PBS緩沖液稀釋，并加入過硫酸銨和N,N,N',N'-四甲基二乙胺[2]，通過聚合作用制備彈性模量為0.5 kPa的聚丙烯酰胺水凝膠。然后將200 μl濃度為50 mmol/L的sulfo-SANPAH均勻鋪在水凝膠表面，超凈臺內(nèi)用紫外進(jìn)行光活化；最后將0.2 mg/ml的I型膠原蛋白均勻鋪在水凝膠表面4℃過夜，Hepes液漂洗之后，將載有聚丙烯酰胺水凝膠的蓋玻片置于六孔板中備用。使用前預(yù)先用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)浸泡2 h。

1.3 tsUC的建立與鑒定

將健康新生兒臍帶在超凈臺中用PBS沖洗干凈，用剪刀、鑷子剔去血管，取出華氏膠，所得組織充分剪碎至1 mm3大小，37℃條件下用膠原蛋白酶處理18 h，之后用1 g/L胰酶消化5 min，用細(xì)胞篩過濾后取濾液，即得到原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC)。待細(xì)胞生長達(dá)到60%融合時，用含4 μg/ml聚凝胺的攜ts-SV40Lt基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液對細(xì)胞進(jìn)行感染48 h，并根據(jù)前期研究方法對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定[3], 證實為tsUC細(xì)胞。將感染成功的tsUC置于33℃培養(yǎng)箱中，其余培養(yǎng)條件同UC。

1.4 TBI模型的建立和損傷組織勻漿液的提取

對12只280～300 g的SD大鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供)進(jìn)行液壓沖擊制作TBI模型。實驗前，將大鼠用5%的異氟烷進(jìn)行麻醉，而后將其俯臥位固定于立體定向頭架上，通過鼻腔持續(xù)吸入2%的異氟烷。頭部備皮、消毒完畢后，于中線處切開頭皮，剝離骨膜暴露右側(cè)頂骨。于冠狀縫后3.8 mm、中線旁開2.5 mm處用牙科磨鉆磨開直徑4.8 mm的骨窗。暴露出完整硬腦膜后，在骨窗處放置塑料打擊管，以牙科水泥固定，用液壓沖擊顱腦損傷儀(Custom Design Fabrication，美國)進(jìn)行沖擊損傷[4,5]，致重度TBI(2.4 atm)。損傷后立即給予小動物呼吸機維持通氣，待恢復(fù)正常自主呼吸后縫合頭皮切口。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，操作過程采用HP-V26溫度測定儀持續(xù)監(jiān)測大鼠的肛溫，使之維持在36℃～37℃水平。TBI第3天用5%的異氟烷將大鼠麻醉，經(jīng)PBS灌流之后斷頭取全腦，用濾紙吸干腦組織表面。切取右側(cè)損傷區(qū)包括周圍2 mm 以內(nèi)的腦組織置于冰袋上，迅速稱量濕重。將所有大鼠的腦組織剪碎、混合，并加入DMEM進(jìn)行勻漿(每150 mg腦組織加入1 ml DMEM)，4℃條件下以1 000 r/min的速度離心10 min后，用孔徑為0.2 μm的濾器對上清液過濾除菌，濾液保存于-80℃冰箱中備用[6]。

1.5 實驗干預(yù)及分組

將UC和tsUC置于彈性模量為0.5 kPa的聚丙烯酰胺水凝膠上，加入含有1%雙抗的DMEM及10% FBS的培養(yǎng)液，并按20%體積比添加大鼠腦組織提取液，24 h后更換正常的新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞及培養(yǎng)溫度的不同，將實驗分為4組：實驗分為UC組(37℃，加入PBS)、tsUC組(33℃，加入PBS)、UC+提取液組(37℃)、tsUC+提取液組(33℃持續(xù)3 d，后轉(zhuǎn)至37℃)，各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d ,細(xì)胞密度為2×104cells/ml。

1.6 觀察細(xì)胞的凋亡水平及形態(tài)變化

在倒置相差顯微鏡(Optic BD200-PH，美國)下觀察水凝膠上細(xì)胞的生長形態(tài)，24 h后取出玻片置于70%酒精中，4℃固定2 h，用10 μg/ml的RNase A對細(xì)胞進(jìn)行處理，繼之用50 μg/ml碘化丙啶(PI)染色。將玻片于倒置熒光顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)下觀察、攝像。

1.7 免疫熒光法觀察細(xì)胞的增殖情況

用10 μmol/L的BrdU標(biāo)記48 h后轉(zhuǎn)至新鮮正常培養(yǎng)基，標(biāo)記3 d后4%多聚甲醛固定30 min后，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測。加入羊抗大鼠BrdU一抗和熒光標(biāo)記的二抗，并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，比較各組細(xì)胞的增殖情況。

1.8 免疫熒光法檢測細(xì)胞向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的水平

細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件生長7 d后，取出各組玻片置于4%多聚甲醛液中固定30 min，之后對水凝膠上的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測。先后加入NeuN、GFAP一抗和熒光標(biāo)記的二抗，并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，比較各組細(xì)胞的神經(jīng)元陽性表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 tsUC的鑒定結(jié)果

向UC感染攜帶tsSV40LT的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以建立tsUC。免疫印跡結(jié)果顯示，UC無SV40LT蛋白的表達(dá)，而tsUC可表達(dá)SV40LT蛋白(圖1)，提示tsSV40LT病毒感染成功。

2.2 各組細(xì)胞的凋亡水平

相差顯微鏡下顯示，各組均有懸浮細(xì)胞，提示細(xì)胞死亡，tsUC+提取液組貼壁細(xì)胞多于其余兩組。24 h PI染色結(jié)果顯示，與UC組相比，其余三組均有PI表達(dá)陽性細(xì)胞，提示細(xì)胞凋亡(圖2，見彩圖頁Ⅱ)。tsUC+提取液組細(xì)胞的凋亡比例高于UC+提取液組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而UC組的細(xì)胞凋亡比例與tsUC組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義( 表1)。

Fig. 1 Identification results of tsUC SV40LT: Simian 40 Large T-antigen; UC: Umbilical cord mesenchymal stem cells; tsUC: Temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

2.3 各組細(xì)胞的增殖水平

采用BrdU標(biāo)記細(xì)胞，3 d后行BrdU免疫熒光染色。結(jié)果顯示，與UC組相比，UC+提取液組的BrdU陽性率顯著增加(P<0.01)；與UC+提取組相比，tsUC+提取液組的BrdU陽性率卻顯著降低(P<0.01, 表1)。

GroupApoptosisrateBrdU?positiverateUC3．8±0．446．0±5．98tsUC4．0±0．658．3±4．67UC+extraction72．3±8．9849．0±5．98??tsUC+extraction20．6±4．31##97．5±10．98##

UC：Human umbilical cord mesenchymal stem cells；tsUC：Temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

**P<0.01vsUC group;##P<0.01vsUC+ extraction group

2.4 光鏡下各組細(xì)胞的形態(tài)變化

相差顯微鏡下結(jié)果顯示，UC組和tsUC組細(xì)胞在貼壁后形狀各異，胞體攤開面積較大，鏡下觀察近乎透明，而且在觀察的7 d內(nèi)形態(tài)未發(fā)生明顯變化；而tsUC+MHT組細(xì)胞貼壁后胞體的攤開面積明顯較小，呈圓形或橢圓型，并出現(xiàn)長而纖細(xì)的突起(圖3，見彩圖頁Ⅱ)。

2.5 各組細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的水平

采用GFAP和NeuN免疫熒光染色分別標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。GFAP染色結(jié)果顯示，與UC組相比，UC+提取組的GFAP陽性率顯著減少(P<0.01)；與UC+提取組相比，tsUC+提取組的BrdU陽性率顯著增加(P<0.01，圖4，表1)。NeuN染色結(jié)果顯示，與UC組相比，UC+提取組的NeuN陽性率顯著減少(P<0.01)；與UC+提取組相比，tsUC+提取組的NeuN陽性率顯著增加(P<0.01，圖4，表2，圖4見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

Tab. 2 Cell differentiation rate of astrocytes and neurons in every group (%)

GroupAstrocytesNeuronUC22．34±2．698．99±1．05tsUC25．45±0．659．11±0．96UC+extraction6．84±0．88??3．58±0．41??tsUC+extraction19．58±2．06##8．10±0．98##

UC：Human umbilical cord mesenchymal stem cells；tsUC：Temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

**P<0.01vsUC group;##P<0.01vstsUC+extraction group

微環(huán)境是指干細(xì)胞所處的基質(zhì)中，對干細(xì)胞的命運(增殖/分化)起調(diào)控作用的三維空間和各種信號分子(生長因子及其受體、激素及介導(dǎo)分子)的總稱。TBI后腦組織缺血缺氧、大量炎性介質(zhì)的釋放、興奮性氨基酸的釋放、與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)的自由基損傷、鈣離子的內(nèi)流等，這些毒性物質(zhì)均會加重?fù)p傷部位神經(jīng)細(xì)胞的死亡或是不利于移植干細(xì)胞的存活。大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗表明，干細(xì)胞移植治療TBI 的效果不夠理想，其原因主要與干細(xì)胞的低存活率相關(guān)。移植干細(xì)胞在目標(biāo)部位存活是干細(xì)胞發(fā)揮作用的前提，而影響干細(xì)胞行為的決定性因素主要是局部的微環(huán)境。有研究表明，移植后1 周，90%的干細(xì)胞出現(xiàn)死亡。移植干細(xì)胞的大量死亡主要跟TBI 損傷局部缺血、缺氧、炎癥、水腫的微環(huán)境有關(guān)。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在特定情況下具有多向分化的潛能[7]，在原位移植治療TBI方面具有可觀前景[8]。但由于TBI所致微環(huán)境的改變對細(xì)胞生長和增殖影響極大，因此限制了其在臨床上的應(yīng)用。眾所周知，UC在37℃，5%CO2條件狀態(tài)下生長狀態(tài)最佳。在UC的基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染攜帶溫度tsSV40LT基因的病毒，成功建立了tsUC系。tsSV40LT 是SV40LT 的突變等位基因。SV40LT 可通過調(diào)控死亡階段1(M1)和死亡階段2(M2)而使細(xì)胞獲得永生。33℃環(huán)境tsUC增殖活性最大，為最理想的生長條件，且培養(yǎng)3 d可達(dá)到70%～80%的融合度，而在37℃卻明顯減弱或消失。在前期研究中也已證實tsUC細(xì)胞系因表達(dá)tsSV40LT 蛋白在33℃下可以獲得永生，但在37℃～39℃停止增殖而轉(zhuǎn)向分化[8]。tsUC既能擴(kuò)增干細(xì)胞數(shù)量以滿足臨床的需要，又能在正常腦溫下條件性控制干細(xì)胞增殖以避免成瘤性，可解決目前干細(xì)胞移植面臨的細(xì)胞數(shù)量少和致瘤潛能等關(guān)鍵問題，具有廣闊的應(yīng)用前景。

UC在類似于腦組織彈性模量(0.1～1.0 kPa)的基質(zhì)中具有分化為神經(jīng)元的能力[9]。因此本實驗制備彈性模量為0.5 kPa的聚丙烯酰胺水凝膠，用以模擬腦組織的生物力學(xué)環(huán)境。同時提取TBI后大鼠的腦組織提取液，按一定比例加入細(xì)胞的培養(yǎng)基中，用以模擬腦組織損傷后的化學(xué)微環(huán)境。這些對于觀察細(xì)胞的生長、分化情況都具有重要的意義，可從體外實驗角度探討在TBI后腦組織微環(huán)境作用下，亞低溫對tsUC生長和分化的影響。

過去20年里，國內(nèi)外許多實驗室已經(jīng)對亞低溫進(jìn)行了深入的研究，證實亞低溫能對腦損傷或脊髓損傷的動物模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，并能改善其功能及預(yù)后。早在20世紀(jì)50年代，國外就已經(jīng)有人將亞低溫技術(shù)應(yīng)用于心臟外科手術(shù)，取得顯著效果。因此腦卒中、腦損傷以及脊髓損傷等神經(jīng)科領(lǐng)域也逐漸開展低溫治療技術(shù)。亞低溫在TBI治療方面的機制有許多，主要包括降低腦代謝、抑制免疫或炎癥反應(yīng)、降低自由基等有害物質(zhì)的堆積，通過改善血腦屏障和血管通透性而達(dá)到減輕腦水腫和降低顱內(nèi)壓的目的[10]。由此可見，亞低溫能改善TBI后腦組織的物理和化學(xué)性質(zhì)，維持腦細(xì)胞所處力學(xué)微環(huán)境和化學(xué)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

根據(jù)國內(nèi)外研究和本室前期實驗結(jié)果，溫敏干細(xì)胞的增殖活性在33℃環(huán)境里最大，在37℃里明顯減弱或消失。同時，據(jù)本科臨床治療經(jīng)驗，亞低溫控制的最佳溫度為33℃左右。因此，臨床3～5 d的亞低溫治療可為溫敏干細(xì)胞提供最佳的溫度，以促進(jìn)移植干細(xì)胞的存活和增殖。

本實驗結(jié)果顯示，在模擬腦組織TBI的微環(huán)境中，UC組和tsUC組的細(xì)胞存活能力明顯降低，而且?guī)缀鯚o向神經(jīng)元分化的能力。而在亞低溫的干預(yù)作用下，tsUC的生長和分化能力均有了極大的改善，提示亞低溫可以提高tsUC對損傷環(huán)境的適應(yīng)性，同時也說明聯(lián)合亞低溫干預(yù)的tsUC能更好地適應(yīng)腦組織損傷環(huán)境，并保持向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，為亞低溫聯(lián)合溫敏干細(xì)胞移植治療TBI的研究提供依據(jù)。

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Effect of chemical microenvironment after traumatic brain injury on temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells

ZHAO Ming-liang1,2, CHEN Yi-sheng2, LI Xiao-hong2, WANG Jing-jing2, TU Yue2, SUN Hong-tao2, ZHANG Sai2, CHEN Chong2△

(1. Center of Nerve Bio-medicine Therapy, the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces,2. Institute of Brain Trauma and Neurological Disease, Neurotrauma Repair Key Laboratory of Tianjin, Tianjin 300162; 3. Graduate department of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)

Objective: To simulate the chemical microenvironment of injured brain tissue, and to explore the effect of this chemical microenvironment on temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells (tsUC). Methods: Rat models of traumatic brain injury (TBI) were made by fluid percussion injury, and then the brain tissue extracts of the injured regions were acquired. Human umbilical cord mesenchymal stem cells (UC) were isolated and cultured, and the tsUC were obtained through the infection of temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen (ts-SV40LT) retrovirus. After that, both the two kinds of cells were cultured on the polyacrylamide gels which mimicking the elastic modulus of brain. Four groups were included: UC cultured under normal temperature (UC group), UC cultured added brain tissue extract under normal temperature (UC plus extract group), tsUC cultured under mild hypothermia (tsUC group), and tsUC added brain tissue extract under mild hypothermia for 3 days, then normal temperature for 4 days (tsUC plus extract group). After 24 hours, the apoptosis level was checked. Cell growth and morphological changes in each group were given dynamic observation. Seven days later, cell immunofluorescences were implemented for examining neural differentiation level. Results: Compared with UC plus extract group, the apoptosis and proliferation in UC plus extract group were significantly reduced (P<0.01)and increased (P<0.01)respectively. Cell immunofluorescence showed that the both GFAP and Neuron positive cells were significantly enhanced in UC plus extract group than those in tsUC plus extract group. Conclusion: tsUC combining with mild hypothermia could significantly reverse injury induced cell apoptosis, improve cell proliferation and neural differentiation under chemical microenvironment after brain injury, which confirmed the adaptation and resistance of tsUC under mild hypothermia after TBI.【KEY WORDS】 traumatic brain injury; chemical microenvironment; human umbilical cord mesenchymal stem cells; temperature sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells; mild hypothermia; brain tissue extracts

國家自然科學(xué)基金項目(81471275，81341113， 81271392，81401067，81301050)

2015-02-04

2015-03-16

R3

A

1000-6834(2015)03-207-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.004

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