楊 銳，周 佳，李 方，張 春，卜書紅（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200092）

脂肪酸酰胺水解酶抑制劑URB597誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞MHCC97H凋亡的作用及其機(jī)制研究

楊 銳，周 佳，李 方，張 春，卜書紅*（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200092）

目的：觀察脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）抑制劑URB597誘導(dǎo)人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MHCC97H凋亡的作用，并探討其機(jī)制。方法：給予不同濃度（1、5、10μmol/L）URB597與MHCC97H孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）在細(xì)胞核中的水平，及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。采用caspase 3試劑盒檢測caspase 3的活性變化。結(jié)果：（1）不同濃度（1、5、10μmol/L）URB597作用細(xì)胞1、4、7d后，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，呈時間-劑量依賴性；（2）不同濃度URB597作用96h后細(xì)胞內(nèi)caspase 3活性明顯升高，且細(xì)胞核中AIF水平顯著增加；（3）10μmol/L URB597作用細(xì)胞96h后，與對照組相比，Bcl-2水平明顯下調(diào)，Bax水平明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax比值顯著下降。PI3K抑制劑LY294002亦可顯著降低Bcl-2/Bax比值，但與10μmol/L URB597作用相比，對Bcl-2/Bax比值的影響程度較低。結(jié)論：URB597可通過促進(jìn)人肝癌細(xì)胞凋亡抑制其增殖，該作用與其下調(diào)Bcl-2/Bax比值，影響線粒體通透性，誘導(dǎo)caspase依賴和非caspase依賴的細(xì)胞凋亡有關(guān)，且部分依賴于PI3K/Akt通路。

脂肪酸酰胺水解酶抑制劑；URB597；肝癌細(xì)胞MHCC97H；細(xì)胞凋亡；PI3K/Akt信號通路

［Pharm Care Res，2015，15（4）：261-264］

肝細(xì)胞癌（hepatocellular cancer，HCC，簡稱肝癌）具有發(fā)病率高、致死率高的特點，居我國惡性腫瘤死亡率第二位。手術(shù)切除仍是治療肝癌最有效的方法，但即使根治切除術(shù)后，其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍有60%～70%。因此，尋找有效的、新的術(shù)后藥物治療是肝癌治療亟待解決的重要問題。

內(nèi)源性大麻素——N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）屬于脂質(zhì)信號分子。大量研究發(fā)現(xiàn)，AEA對包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤具有抑制增殖、抑制黏附和侵襲、抑制腫瘤血管生成以及誘導(dǎo)凋亡等作用［1］。但由于AEA體內(nèi)可被位于細(xì)胞質(zhì)中的水解酶——脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）迅速代謝，外源性補(bǔ)充AEA作用效果微弱且短暫，不具有成藥性［2］。URB597（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）是AEA代謝酶的選擇性抑制劑，可上調(diào)AEA水平，對黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺癌均有顯著抑制作用［3-5］。前期研究發(fā)現(xiàn)，URB597可抑制人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MHCC97H的增殖［6］，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。本研究以MHCC97H細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過體外實驗，深入探討URB597誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM高糖培養(yǎng)基和0.125%胰酶（美國GibcoBRL公司）；URB597、一抗Bcl-2、Bax、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）及羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒和caspase 3活性檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MHCC97H細(xì)胞是具有高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），采用含10%胎牛血清（FBS），青霉素200IU/ml、鏈霉素200IU/ml的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密度至80%按1:3傳代。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 AnnexinⅤ-FITC/PI是定量檢測凋亡的快速、靈敏的方法。實驗結(jié)束后，用0.125%胰酶消化細(xì)胞，小心吹打細(xì)胞，211×g離心1min。棄去培養(yǎng)液，PBS 90μl重懸，收集1×105個細(xì)胞，同時加入AnnexinⅤ-FITC 5μl和PI 4μl（美國BD pharmingen公司），在閉光條件下孵育15min，再加100μl PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長分別為520、575nm。

1.4 Caspase 3活性檢測 藥物作用結(jié)束后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液備用，用胰酶37℃消化細(xì)胞45s，收集并離心，去除上清液，并用PBS洗滌一次，按比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。分別加入冰浴的pNA和Ac-DEVD-pNA（2mmol/L），混勻，避免產(chǎn)生氣泡，并設(shè)置空白對照組。37℃孵育2h后，在405nm測定吸光度（A），樣品的A405與空白對照的A405差值即為樣品中caspase 3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。將差值代入已做好的pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計算出caspase 3的活性。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法 藥物處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，加入適量蛋白裂解液，收集至預(yù)冷1.5ml離心管中；4℃1.34×104×g離心20min，取上清，二喹啉甲酸法（BCA法）檢測蛋白質(zhì)濃度，100℃蛋白質(zhì)變性5min。制備聚丙烯凝膠，60V電泳至分離膠，電壓轉(zhuǎn)至80V繼續(xù)電泳2h。冰浴轉(zhuǎn)膜：100V1～2h。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1h；加一抗Bcl-2雜交，PBST洗膜3次；加羊抗兔二抗雜交，PBST洗膜3次。蛋白質(zhì)印跡的核蛋白內(nèi)參選用Lamin A蛋白，胞漿蛋白內(nèi)參選用GAPDH。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯影，Las3000曝光機(jī)曝光。曝光后，利用Quantity One軟件（Bio-Rad公司）測算各蛋白質(zhì)印跡的灰度值，進(jìn)而計算蛋白質(zhì)表達(dá)量之間的比值。

2 結(jié) 果

2.1 URB597促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡的作用 1、5、10μmol/L URB597分別與MHCC97H細(xì)胞孵育1～7d后，采用AnnexinⅥ/PI染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，5、10μmol/L URB597作用4d，可誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡率升高，而1μmol/L URB597作用7d可誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡率升高，提示URB597促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡呈時間-劑量依賴性（見表1）。

表1 3種濃度URB597作用不同時間對MHCC97H細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 The effects of 3concentrations of URB597on the apoptosis of MHCC97Hcells at different time points

2.2 URB597對不同凋亡途徑的影響 Caspase 3是caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵分子［7］，AIF是非caspase依賴的凋亡途徑中的關(guān)鍵分子［8］。與對照組相比，5、10μmol/L URB597作用96h后，用藥組caspase 3活性顯著升高，細(xì)胞核內(nèi)AIF水平顯著增加，而1μmol/L URB597作用96h后caspase 3活性及核內(nèi)AIF水平均無明顯變化，提示5、10μmol/L URB597作用96h后可誘導(dǎo)caspase依賴及非caspase依賴的細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖2 3種濃度URB597作用96h后對不同凋亡通路的影響Figure 2 The effects of 3concentrations of URB597 on different apoptotic pathways after 96h

2.3 URB597對Bcl-2/Bax表達(dá)的影響 Bcl-2/Bax平衡可通過影響線粒體的功能，參與caspase家族的活化及AIF的釋放，影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，在細(xì)胞凋亡的病理過程中起重要作用。與對照組比較，作用96h后，10μmol/L URB597組凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加，其蛋白灰度值比對照組灰度值增加了1.7倍（P＜0.05，n＝3）；抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯減少，其蛋白灰度值下降至對照組的45%（P＜0.05，n＝3）（見圖3），提示URB597促進(jìn)細(xì)胞凋亡與其調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax平衡有關(guān)。此外，給予PI3K抑制劑LY294002，發(fā)現(xiàn)其亦可上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2水平，但其作用強(qiáng)度低于URB597。與對照組比較，作用96h后，5μmol/L LY294002組凋亡蛋白Bax表達(dá)增加1.3倍（P＜0.05，n＝3）；而Bcl-2的表達(dá)下降了50%（P＜0.05，n＝3）。

3 討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，URB597可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制其增殖，且具有明顯的時間及劑量依賴性，1μmol/L URB957作用7d及5、10μmol/L URB957作用4、7d，MHCC97H細(xì)胞凋亡率明顯升高。在對其促凋亡機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)5、10μmol/L URB597作用96h后，caspase 3活性顯著升高，細(xì)胞核中AIF水平明顯增加。Caspase 3和AIF分別是caspase依賴和非caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵分子，caspase 3活化后可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)剪切及降解；AIF進(jìn)入細(xì)胞核，可導(dǎo)致DNA大片段斷裂，均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。所以，URB597H可能誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞同時發(fā)生caspase依賴和非caspase依賴的細(xì)胞凋亡。

圖3 URB597及LY294002作用96h對Bcl-2和Bax表達(dá)水平的影響Figure 3 The effects of URB597and LY294002 on the expression levels of Bcl-2and Bax after 96h

Bcl-2家族屬于凋亡相關(guān)蛋白，通過其抗凋亡和促凋亡成員的協(xié)同作用，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡開關(guān)的作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Bax可以與線粒體結(jié)合，導(dǎo)致線粒體損傷，使caspase 3活化及AIF釋放?？沟蛲龇肿覤cl-2則可阻止Bax在線粒體上形成轉(zhuǎn)換孔，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2大量表達(dá)可以對抗Bax的促凋亡活性，而Bax的大量表達(dá)則可阻斷Bcl-2抗凋亡的活性［8］。Bcl-2家族蛋白表達(dá)可受多條信號通路調(diào)控，如PI3K通路等［10］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K通路在大多數(shù)腫瘤中均保持在高活化水平，且多種化療藥的抗腫瘤機(jī)制與阻斷該通路有關(guān)［10，11］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，10μmol/L URB597作用96h后Bax水平明顯升高，Bcl-2水平明顯下降，提示URB597可能通過影響B(tài)cl-2/Bax的平衡，導(dǎo)致線粒體損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)caspase 3活化及AIF釋放。此外，與對照組相比，PI3K抑制劑LY294002同樣導(dǎo)致了Bax水平升高，Bcl-2水平下降，打破了Bcl-2/Bax平衡，該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致；但與10μmol/L URB597相比，LY294002對Bax與Bcl-2水平的影響相對較弱，提示URB597對Bax與Bcl-2水平的影響并不完全依賴PI3K通路。前期研究顯示，URB597可以抑制PI3K/Akt通路，可能與其抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果提示，URB597影響B(tài)ax和Bcl-2表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，可能與其抑制PI3K/Akt通路有關(guān)，但并不完全依賴于該通路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，URB597可通過改變Bcl-2/Bax平衡，誘導(dǎo)線粒體損傷，使caspase 3活化，核內(nèi)AIF水平增加，最終啟動caspase依賴及非caspase依賴的細(xì)胞凋亡，且該作用可能與其抑制PI3K/Akt通路有關(guān)。

［1］王艷紅，周小蕓，張 哲，等.內(nèi)源性大麻素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞MHCC97H凋亡中Caspase-3的作用［J］.中華實驗外科雜志，2010，27（2）：153-155.

Wang YanHong，Zhou XiaoYun，Zhang Zhe，et al. Apoptosis induction of anandamide in a human hepatocellular carcinoma cell line with highly metastatic potential（MHCC97H）［J］. Chin J Exp Surg，2010，27（2）：153-155. In Chinese with English abstract.

［2］Willoughby K A，Moore S F，Martin B R，et al. The biodisposition and metabolism of anandamide in mice［J］. J Pharmacol Exp Ther，1997，282（1）：243-247.

［3］Hamtiaux L，Masquelier J，Muccioli G G，et al. The association ofN-palmitoylethanolamine with the FAAH inhibitor URB597impairs melanoma growth through a supra-additive action［J］. BMC Cancer，2012，12：92.

［4］Hamtiaux L，Hansoulle L，Dauguet N，et al. Increasing antiproliferative properties of endocannabinoids in N1E-115neuroblastoma cells through inhibition of their metabolism［J］. PloS One，2011，6（10）：e26823.

［5］Endsley M P，Thill R，Choudhry I，et al. Expression and function of fatty acid amide hydrolase in prostate cancer［J］. Int J Cancer，2008，123（6）：1318-1326.

［6］楊 銳，徐阿晶，劉 艷，等.脂肪酸酰胺水解酶抑制劑URB597對人肝癌細(xì)胞MHCC97H生長和侵襲的抑制作用及機(jī)制研究［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2014，14（3）：184-187.

Yang Rui，Xu AJing，Liu Yan，et al. Inhibitory effects of fatty acid amide hydrolase inhibitor URB597on the proliferation and invasion of human hepatoma cell MHCC97Hand its mechanism［J］. Pharm Care Res，2014，14（3）：184-187. In Chinese with English abstract.

［7］Franklin J L.Redox regulation of the intrinsic pathway in neuronal apoptosis［J］.Antioxid Redox Signal，2011，14（8）：1437-1448.

［8］Ryu Y L，Jung K H，Son M K，et al. Anticancer activity of HS-527，a novel inhibitor targeting PI3-kinase in human pancreatic cancer cells［J］. Cancer Lett，2014，353（1）：68-77.

［9］Rossé T，Olivier R，Monney L，et al. Bcl-2prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochromec［J］. Nature，1998，391（6666）：496-499.

［10］Malla R，Gopinath S，Alapati K，et al. Downregulation of uPAR and cathepsin B induces apoptosisviaregulation of Bcl-2and Bax and inhibition of the PI3K/Akt pathway in gliomas［J］. PloS One，2010，5（10）：e13731.

［11］Wang HaiYan，Duan Liang，Zou ZhengYu，et al. Activation of the PI3K/Akt/mTOR/p70S6Kpathway is involved in S100A4-induced viability and migration in colorectal cancer cells［J］. Int J Med Sci，2014，11（8）：841-849.

Effects of fatty acid amide hydrolase inhibitor URB597 on apoptosis of human hepatoma cell line MHCC97H and its underlying mechanism

YANG Rui，ZHOU Jia，LI Fang，ZHANG Chun，BU ShuHong*
（Department of Pharmacy，Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China）

Objective：To discuss the effects of fatty acid amide hydrolase inhibitor URB597on the apoptosis of human hepatoma cell line MHCC97Hin vitroand its underlying mechanism.Methods：Different concentrations of URB597（1，5and 10μmol/L respectively）were administered to incubate MHCC97H. Flow cytometry was used to analyze the effects of URB597 on apoptosis in MHCC97Hcells. Western-blot assay was applied to detect the levels of the apoptosis-inducing factors（AIF），Bcl-2and Bax with or without URB597. Caspase 3detection kit was used to determine the activity of caspase 3.Results：（1）Following treatment with URB597at different concentrations（1，5and 10μmol/L）for 1，4and 7days，the number of apoptotic cells was significantly increased with a time-dependent tendency. （2）After treatment with URB597at different concentrations for 4days，the activity of caspase 3and AIF levels in the nucleus were increased significantly. （3）Following treatment with URB597at a concentration of 10μmol/L for 4days，the expression level of Bcl-2was obviously down-regulated，while Bax level was obviously up-regulated，when compared with those of the control group，and the Bcl-2/Bax ratio was obviously reduced. PI3Kinhibitor LY294002could also significantly reduce the Bcl-2/Bax ratio. However，as compared with the 10μmol/L control level，its effect on the Bcl-2/Bax ratio was relatively lower.Conclusion：URB597could enhance the apoptosis of MHCC97Hcells by down-regulating the ratio of Bcl-2/Bax，further inducing caspase-dependent and caspase-independent cell apoptotic pathway，which was partial-dependent on PI3K/Akt signal pathway.

fatty acid amide hydrolase inhibitor；URB597；hepatoma cell line MHCC97H；cell apoptosis；PI3K/Akt signal pathway

R965，R979.1 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0261-04

10.5428/pcar20150408

2015-01-21

］ 2015-07-20

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院院基金（13YJ18）

楊 銳（女），博士，藥師.

E-mail：yangr.2007@163.com

卜書紅，E-mail：sophia5237@126.com

［

［本文編輯］吳銘權(quán)