蒙雄裕，徐 良，李華強(qiáng)，王 亮，鄭承劍*，秦路平*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，銀川 750004；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 200433；3.浙江天目山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局科研宣教科，杭州 311300；4.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室，上海 200234）

用RP-HPLC法測定天目地黃中梓醇和毛蕊花糖苷的含量

蒙雄裕1，2，徐 良3，李華強(qiáng)2，4，王 亮2，鄭承劍2*，秦路平2*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，銀川 750004；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 200433；3.浙江天目山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局科研宣教科，杭州 311300；4.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室，上海 200234）

目的：建立RP-HPLC法測定天目地黃中梓醇與毛蕊花糖苷的含量，分析兩種成分在天目地黃中的動態(tài)積累規(guī)律，為其資源開發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考依據(jù)。方法：采用甲醇回流提取法進(jìn)行提取，用RP-HPLC法測定不同發(fā)育階段新鮮藥材塊根與全草中梓醇和毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果：梓醇和毛蕊花糖苷在天目地黃塊根和全草中含量有顯著差異，其中梓醇主要分布于塊根，在5月份成長期含量最高（3.42%）；而毛蕊花糖苷主要分布在全草，于6月份開花結(jié)實(shí)期含量較高（0.47%）。結(jié)論：本研究初步探索了天目地黃中有效成分的動態(tài)積累規(guī)律，為該藥材資源的合理利用提供了科學(xué)依據(jù)。

天目地黃；梓醇；毛蕊花糖苷；含量測定；色譜法，高效液相

［Pharm Care Res，2015，15（4）：273-276］

天目地黃Rehmannia chingiiLi.為玄參科地黃屬多年生草本植物，收載于《中國植物志》。據(jù)民間用藥記載，其塊根狀莖和全草均可入藥。地黃屬Rehmannia共有6種，其中天目地黃與地黃化學(xué)成分相似［1，2］，主要為環(huán)烯醚萜類、紫羅蘭酮類、地黃腦苷類、糖類等成分，其中梓醇（catalpol）和毛蕊花糖苷（verbascoside）作為地黃的主要有效成分，已經(jīng)被《中華人民共和國藥典》2010年版列為地黃的指標(biāo)性成分，并對其含量做出明確規(guī)定［3，4］。研究表明，梓醇與毛蕊花糖苷具有神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)作用等多種藥理學(xué)作用［5，6］。

天目地黃是浙江省天目山所特有的藥用植物資源，在當(dāng)?shù)孛耖g廣泛使用。目前關(guān)于天目地黃的研究鮮有報道。為了保證用藥的安全與有效，本課題組與浙江天目山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局合作，通過采集不同生長階段，即幼苗期、成長期、開花結(jié)果期、枯萎期的天目地黃植株，采用RP-HPLC法對天目地黃塊根和全草中的梓醇和毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測定；同時選擇兩個道地產(chǎn)區(qū)（河南焦陽和安徽亳州）的地黃藥材與浙江天目地黃藥材進(jìn)行比較，為天目地黃藥材資源的開發(fā)利用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200系列高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（DAD）、Chemstation10.2工作站、Eclipse-XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）（美國Agilent公司）；BP211D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 梓醇對照品（含量＞99%，批號140508-200908）、毛蕊花糖苷對照品（含量＞99%，批號YM0505YA14）購自上海源葉生物有限公司。甲醇（色譜純，批號201405023）、乙腈（色譜純，批號201404015）購自上海斯炯化工科技有限公司；磷酸（優(yōu)級試劑，批號201403018）和冰醋酸（優(yōu)級試劑，批號201301018）購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.3 藥材 實(shí)驗所用10批（批號見表1）新鮮天目地黃藥材均由浙江天目山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局徐良采自浙江省天目山，兩批野生地黃購買于河南焦陽（批號140507011）和安徽亳州（批號140510012），經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室秦路平教授鑒定為玄參科地黃屬Rehmannia植物Rehmannia chingiiLi.和Rehmannia glutinosaLibosch.。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 （1）梓醇：采用反相高效液相色譜Eclipse-XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，0～2min，0.3%乙腈，流速0.6ml/min；2～8min，0.3%～0.8%乙腈，流速0.6ml/min；8～20min，1%乙腈，流速1ml/min。檢測波長為210nm，柱溫25℃，理論塔板數(shù)按梓醇峰計≥5000。對照品及樣品的HPLC譜圖見圖1。（2）毛蕊花糖苷：采用反相高效液相色譜Eclipse-XDB C18柱，流動相為乙腈-0.1%乙酸水溶液（16:84）等度洗脫。檢測波長為340nm，流速1.0ml/min，柱溫2 5℃，理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計≥5 0 0 0。對照品及樣品的HPLC譜圖見圖1。

圖1 梓醇和毛蕊花糖苷的RP-HPLC譜圖Figure 1 RP-HPLC photograms of catalpol and verbascoside

2.2 對照品儲備液的制備 分別精密稱取梓醇及毛蕊花糖苷對照品14.40、5.48mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品儲備液，梓醇濃度為1.440mg/ml，毛蕊花糖苷濃度為0.548mg/ml，置4℃冰箱保存待用。

2.3 供試品溶液的制備 取天目地黃塊根和全草洗凈，經(jīng)50℃減壓干燥20h后，磨成粗粉。稱取約0.4g，置具塞100ml錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流提取1.5h，放冷，靜置15min后再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻靜置，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

取地黃藥材（批號140507011、140510012）洗凈，擦干表面水分，去除須根后切成2～4mm細(xì)絲。制備方法同上。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取2.2項下對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成梓醇濃度為0.022 5、0.045 0、0.090 0、0.180、0.360、0.720、1.440mg/ml；毛蕊花糖苷0.008 56、0.017 1、0.034 3、0.068 5、0.137、0.274、0.548mg/ml的系列對照品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾；按2.1項下色譜條件，分別精密吸取上述對照品溶液10μl進(jìn)樣，以梓醇及毛蕊花糖苷的峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得梓醇回歸方程Y1＝3 260.1X1＋18.800，r＝0.999 9（n＝6）；毛蕊花糖苷回歸方程為Y2＝440.60X2-434.77，r＝0.999 5（n＝6）。結(jié)果表明，梓醇、毛蕊花糖苷分別在22.5～1440μg/ml、8.56～548μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗 精密吸取梓醇和毛蕊花糖苷對照品溶液各10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，求得梓醇和毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為2.09%和1.31%（n＝6），結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗 取批號為14050105的天目地黃供試品溶液，分別在配制后0、2、4、8、12、24、48h進(jìn)樣，結(jié)果天目地黃塊根和全草中梓醇峰面積的RSD分別為1.07%、0.510%（n＝7），毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.55%、1.87%（n＝7），結(jié)果表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗 取批號為14050105的天目地黃藥材，按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果天目地黃塊根和全草的梓醇峰面積RSD分別為1.47%、0.426%（n＝6），毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為1.07%、0.816%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗 （1）梓醇：分別精密稱取批號為14050105的天目地黃塊根和全草藥材細(xì)粉0.4g，6份，分別精密加入梓醇對照品4.675、3.200mg，按2.3項下方法制備，進(jìn)樣10μl，按照2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果加樣回收率分別為（98.96±1.53）%、（98.32± 1.72）%（n＝6），RSD分別為1.95%、1.26%（n＝6），結(jié)果表明本法具有良好的回收率。（2）毛蕊花糖苷：分別精密稱取批號為14050105的天目地黃塊根和全草藥材細(xì)粉0.4g，6份，分別精密加入毛蕊花糖苷對照品1.200、1.320mg，按2.3項下方法制備后進(jìn)行測定。結(jié)果加樣回收率分別為（101.4± 2.01）%、（100.1±1.89）%（n＝6），RSD分別為1.77%、0.21%（n＝6），結(jié)果表明本法回收率良好。

2.9 樣品含量測定 取同一產(chǎn)地不同采收季節(jié)的10批天目地黃和另兩個產(chǎn)地各一批（批號140507011、140510012）地黃藥材，按2.3項下方法制備供試品溶液，平行3份，分別精密吸取供試品溶液10μl，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣，測定梓醇及毛蕊花糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1和表2。

表1 天目地黃塊根和全草在不同生長階段梓醇和毛蕊花糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of catalpol and verbascoside in roots and whole plants of Rehmannia chingii Li.at different growth stages

表2 天目地黃與地黃中梓醇、毛蕊花糖苷含量的比較Table 2 Comparison of the contents of catalpol and verbascoside between Rehmannia chingii Li.and Rehmannia glutinosa Libosch.

3 討 論

天目地黃在浙江省天目山地區(qū)資源較為豐富，但由于其化學(xué)成分和藥理作用均未得到較系統(tǒng)的闡明，限制了該植物資源的進(jìn)一步開發(fā)利用。本研究以地黃屬植物中的主要活性成分梓醇和毛蕊花糖苷作為指標(biāo)性成分，采用RP-HPLC法測定兩者在天目地黃塊根和全草中的含量。通過采集不同生長階段新鮮植株塊根與全草進(jìn)行RP-HPLC分析，明確塊根和全草中梓醇和毛蕊花糖苷的動態(tài)積累規(guī)律。其中，天目地黃全草中梓醇的含量在整個生長周期中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，至開花結(jié)實(shí)期含量達(dá)到最高值。而塊根中梓醇隨著植株生長到成年期（5月份）含量達(dá)到最高。毛蕊花糖苷在全草與塊根中分布規(guī)律沒有明顯差別，植物開花結(jié)實(shí)期6月份達(dá)到最大，隨后含量逐漸降低。但總體而言，毛蕊花糖苷在全草中含量略高于塊根。

本研究曾參照《中華人民共和國藥典》2010年版地黃中梓醇和毛蕊花糖苷的含量測定方法［4］，但此方法在天目地黃中梓醇的含量測定方面效果并不太理想。作者在預(yù)實(shí)驗中分別以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水（0.1%磷酸）等不同溶液體系作為RP-HPLC流動相，在不同流速及不同分析時間中反復(fù)實(shí)驗優(yōu)選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫（見2.1項梓醇色譜條件），對梓醇和天目地黃中其他成分的分離效果較好，色譜峰分離度高，不拖尾。

［1］Zhang RuXue，Li MaoXing，Jia ZhengPing.Rehmannia glutinosa：review of botany，chemistry and pharmacology［J］.J Ethnopharmacol，2008，117（2）：199-214.

［2］Zheng ChengJian，Wu Yu，Zhu JianYong，et al. Chemical constituents of the aerial parts ofRehmannia chingii［J］. Chem Nat Comp，2014，50（3）：560-561.

［3］黃莉婷，孫少平，鄭 穎.生地黃中梓醇和毛蕊花糖苷的HPLC測定及提取工藝優(yōu)化［J］.中藥材，2012，35（8）：1318-1322.

Huang LiTing，Sun ShaoPing，Zheng Ying.Simultaneous determination and optimization of extraction process of catalpol and acteoside from Rehmanniae Radix［J］.J Chin Med Mat，2012，35（8）：1318-1322.In Chinese with English abstract.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：115-116.

State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 1［S］.Beijing：Chinese Medical and Science Press，2010：115-116.In Chinese.

［5］董 炤，陳長勛.梓醇藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2013，35（5）：1047-1051.

Dong Zhao，Chen ChangXun.Research progress in pharmacological effects of catalpol［J］.Chin Tradit Pat Med，2013，35（5）：1047-1051.In Chinese.

［6］劉衛(wèi)欣，盧兗偉，杜海濤，等.地黃及其活性成分藥理作用研究進(jìn)展［J］.國際藥學(xué)研究雜志，2009，36（4）：277-280.

Liu WeiXin，Lu YanWei，Du HaiTao，et al. Phamacological actions of Radix Rehmanniae and its active components：research advances［J］. J Int Pharm Res，2009，36（4）：277-280. In Chinese with English abstract.

Determination of the contents of catalpol and verbascoside in Rehmannia chingii Li.by RP-HPLC method

MENG XiongYu1，2，XU Liang3，LI HuaQiang2，4，WANG Liang2，ZHENG ChengJian2*，QIN LuPing2*
（1.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3.Department of Research and Education，Tianmu Mountain National Nature Reserve Administration of Zhejiang Province，Hangzhou 311300，China；4.Department of Botany，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Objective：To establish a RP-HPLC method for the quantification and dynamic accumulation analysis of catalpol and verbascoside inRehmannia chingiiLi. ，so as to provide scientific basis for the resource utilization and quality standard establishment.Methods：The whole plants and roots ofR.chingiiat different growth stages were extracted with methanol under reflux. Contents of catalpol and verbascoside were determined by RP-HPLC method.Results：The contents of catalpol and verbascoside varied considerably in whole plants and roots ofR.chingii. Catalpol was mainly distributed in the root and reached the peak in May with a content of 3. 42%，whereas verbascoside was mainly distributed in the whole plant and reached the peak at flowering and fruit bearing stage in June with a content of 0. 47%.Conclusion：This study has made a preliminary exploration into the regular pattern of dynamic accumulation of active components inR.chingii，and could provide experimental data for rational utilization of the medicinal resource ofR.chingii.

Rehmannia chingiiLi.；catalpol；verbascoside；content determination；chromatography，high performance liquid

R927.2 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0273-04

10.5428/pcar20150411

2015-04-07

］ 2015-07-20

全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目（13QNP098），上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才項目（XYQ2013100）

蒙雄裕（男），碩士生.E-mail：mengxiongyu2011@126.com；徐 良（男），工程師.E-mail：363356921@qq.com；兩人為共同第一作者

秦路平，E-mail：qinsmmu@126.com；鄭承劍，E-mail：zhengchengjian@smmu.edu.cn

［

［本文編輯］陽凌燕