徐吉洋，張文萍，李少南，郎倩萍

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

萼花臂尾輪蟲毒性試驗(yàn)的方法學(xué)研究

徐吉洋，張文萍，李少南*，郎倩萍

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

為嘗試以群體取代個(gè)體作為輪蟲室內(nèi)毒性試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物的可行性，本項(xiàng)研究以萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)作為實(shí)驗(yàn)生物開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，建立生命表并確定接種密度對于種群生長率的影響，并且用3種農(nóng)藥(毒死蜱、丁草胺、三唑酮)開展了輪蟲毒性試驗(yàn)。生命表實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輪蟲的平均壽命和世代周期分別為(78.76±33.08) h和(51.56±20.55) h。接種密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著接種密度的提高，輪蟲種群增長率呈下降趨勢。基于接種密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，毒性試驗(yàn)以35個(gè)·(100 mL)-1作為受試種群的起始密度，試驗(yàn)周期定為144 h。毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，毒死蜱對輪蟲的96 h-EC50和120 h-EC50分別為0.6066 mg·L-1和0.7323 mg·L-1；丁草胺對輪蟲的96 h-EC50和120 h-EC50分別為1.851 mg·L-1和3.058 mg·L-1；三唑酮對輪蟲的96 h-EC50和120 h-EC50分別為12.84 mg·L-1和11.63 mg·L-1。本項(xiàng)研究的結(jié)果肯定了以群體取代個(gè)體作為輪蟲室內(nèi)毒性試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物的可行性。

毒死蜱；丁草胺；三唑酮；萼花臂尾輪蟲；毒性試驗(yàn)；接種密度；試驗(yàn)周期

輪蟲具有生殖速度快、生活周期短、對毒物敏感、全球分布而成為生態(tài)毒理學(xué)研究的受試動(dòng)物[1]。輪蟲是水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員，連接食物鏈中的初級生產(chǎn)者與高級消費(fèi)者，在物質(zhì)轉(zhuǎn)化與能量傳遞方面起著十分重要的作用[2]，因此也已經(jīng)成為水生毒理學(xué)研究中的受試動(dòng)物之一，目前國內(nèi)外有許多污染物對輪蟲毒性的研究[3]。

開展生態(tài)毒理學(xué)研究的一個(gè)關(guān)鍵問題就是尋找適宜、敏感度高的測試終點(diǎn)[4]。目前，大多數(shù)急性毒性試驗(yàn)所用的受試動(dòng)物都是臂尾輪蟲屬的種類。Snell等[5]分別利用紅臂尾輪蟲(B. rubens)和褶皺臂尾輪蟲(B. plicatilis)的休眠卵得到受試動(dòng)物，提出了標(biāo)準(zhǔn)化24 h-LC50實(shí)驗(yàn)方案。目前被美國公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)(APHA)和美國材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)采用的輪蟲標(biāo)準(zhǔn)毒性試驗(yàn)方法(24 h急性毒性試驗(yàn)和48 h無性繁殖試驗(yàn))只包括了輪蟲生命史的一部分。但是，就自然環(huán)境中的生物而言，可能是生命史的某階段暴露在毒物中，也可能是生命史都暴露在毒物中，因此，敏感的測試終點(diǎn)應(yīng)能夠代表整個(gè)生命史[4]。從輪蟲的毒性試驗(yàn)方法和應(yīng)用上來看，趙玉明等[6]進(jìn)行了在蒙古裸腹溞培養(yǎng)中用藥物殺滅褶皺臂尾輪蟲的研究，得出了5種常用化學(xué)藥物甲醛、次氯酸納、次氯酸鈣、孔雀石綠、碘對蒙古裸腹溞和褶皺臂尾輪蟲的24 h-LC50和48 h-LC50。趙含英等[7]研究了Cu2+對萼花臂尾輪蟲的毒性影響，得出了Cu2+對萼花臂尾輪蟲的24 h、48 h、96 h-LC50。謝欽銘等[8]研究了孔雀石綠、高錳酸鉀和甲醛對褶皺臂尾輪蟲的24 h急性毒性。呂林蘭等[9]采用2天種群增長和生命表，研究了不同濃度氟他胺對萼花臂尾輪蟲的毒性影響。從這些報(bào)道可以看出，測試終點(diǎn)集中在24 h和48 h，均以單個(gè)個(gè)體為實(shí)驗(yàn)對象。如果在24 h和48 h內(nèi)不頻繁的檢查結(jié)果，由于輪蟲生命周期短，生殖速度快，短時(shí)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)出下一代，如果參照OECD“化學(xué)品測試準(zhǔn)則202”[10]的毒性測定方法，會(huì)在一定程度上對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生很大的影響。因此，探索一個(gè)易于操作并能適當(dāng)延長試驗(yàn)周期的輪蟲毒性試驗(yàn)方法具有重要的生態(tài)毒理學(xué)意義。

目前，關(guān)于萼花臂尾輪蟲毒性試驗(yàn)方法的研究較少，大多數(shù)都是采用24 h或48 h急性試驗(yàn)的方法，Gallardo等[11]曾參照脊椎動(dòng)物方法研究激素對褶皺臂尾輪蟲種群變化影響。本文以萼花臂尾輪蟲喂受試生物，系統(tǒng)的提出了以種群增長完成輪蟲毒性試驗(yàn)的方法，為利用輪蟲評價(jià)農(nóng)藥毒性風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)生物來源與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用的萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus，以下簡稱輪蟲)來自浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間6個(gè)月以上。選用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)作為輪蟲的餌料。藻種來自浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長期，經(jīng)離心濃縮后至4 ℃冰箱中冷藏待用。采用L9培養(yǎng)液，24 h光照，光照強(qiáng)度為1 000～1 200 lx，培養(yǎng)溫度為25 ℃～30 ℃。

1.2 供試化學(xué)品

97%毒死蜱(chlorpyrifos)原藥、90%丁草胺(butachlor)、90%三唑酮(triadimefon)均由浙江新農(nóng)化工有限公司提供。用丙酮配成一定濃度的母液，使用前用稀釋水配成不同濃度的稀釋液。

1.3 輪蟲的預(yù)培養(yǎng)

采用用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔放入5只活潑健壯帶孤雌生殖卵的雌體，每4小時(shí)觀察一次，待幼體出生后選擇約2 h內(nèi)幼體作為生命表編制實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料。輪蟲培養(yǎng)液采用Gilbert[2]配方。實(shí)驗(yàn)前，用(美國環(huán)境保護(hù)局)EPA[3]為培養(yǎng)液，并調(diào)節(jié)pH值為7.5，靜置30 min左右后備用。預(yù)培養(yǎng)條件設(shè)置為：培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光周期晝長比為16 h∶8 h，光強(qiáng)度為1 000～2 000 lx。以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的經(jīng)離心濃縮的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)作為輪蟲的食物來源，密度約為6×107cells·mL-1。

1.4 生命表實(shí)驗(yàn)

生命表參數(shù)的定義和計(jì)算方法與席貽龍和黃祥飛的[14]基本相同。采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加3 mL EPA培養(yǎng)液，接種1只出生2 h左右的輪蟲，投喂30 μL小球藻，小球藻密度約為6×107cells·mL-1，每4小時(shí)檢查一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)、孵化出的幼體數(shù)及母體的存活數(shù)，并移去幼體，實(shí)驗(yàn)期間不更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)至全部個(gè)體死亡為止。實(shí)驗(yàn)共操作了291個(gè)輪蟲。

1.5 接種密度實(shí)驗(yàn)

1.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了19種接種密度，在預(yù)培養(yǎng)輪蟲中挑選活潑健壯的不帶卵的成體，采用100 mL燒杯。分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40，1.60，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00個(gè)·mL-1營養(yǎng)液，接種后每天投喂餌料為1 mL，投喂小球藻為用L9營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d左右離心后的小球藻，濃度約為6×107cells·mL-1。光照強(qiáng)度1 000～1 200 lx；控制溫度(25±2) ℃ 。

1.5.2 計(jì)數(shù)方法

每24 h計(jì)數(shù)一次，采用1 mL計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取樣時(shí)將燒杯輕輕攪拌，取1 mL輪蟲培養(yǎng)液，在體視鏡下計(jì)算輪蟲的總個(gè)數(shù)，計(jì)數(shù)3次取平均值。實(shí)驗(yàn)周期為240 h，實(shí)驗(yàn)期間不更換培養(yǎng)液。輪蟲數(shù)量的增長倍數(shù)和平均日增長率計(jì)算方法分別為：

增殖倍數(shù)=輪蟲總量/接種輪蟲數(shù)

平均日增長率R=(lnNt-lnNo)/t

No和Nt分別表示實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和結(jié)束時(shí)輪蟲種群密度，t表示實(shí)驗(yàn)時(shí)間[15]。為便于比較，本文在計(jì)算日平均增殖率時(shí)，Nt均采用輪蟲達(dá)到最高密度時(shí)的數(shù)值。

1.6 三種農(nóng)藥對輪蟲毒性試驗(yàn)的應(yīng)用

采用丙酮為助溶劑設(shè)置1個(gè)空白對照組和1個(gè)丙酮最大濃度(0.01 %)照組，以及5個(gè)濃度水平，分別每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。先用丙酮將原藥配成母液，再用稀釋水配成不同濃度的稀釋液。各濃度組稀釋液中丙酮的終濃度不超過0.1 mL·L-1。己有研究顯示該丙酮濃度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著影響[16]。設(shè)空白和溶劑(丙酮)兩組對照。溶劑對照中丙酮的終濃度與最高濃度組相同。毒死蜱濃度設(shè)為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·L-1；丁草胺的濃度設(shè)置為0、1、2、4、6、8 mg·L-1；三唑酮的濃度設(shè)置為0、4、6、8、10、14 mg·L-1。根據(jù)接種密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)燒杯中放35個(gè)活潑健壯不帶卵的成體。實(shí)驗(yàn)期間不更換實(shí)驗(yàn)溶液。投喂餌料與計(jì)數(shù)方法同接種密度實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 生命表實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

從表1中得出，輪蟲的平均壽命為(78.76±33.08) h，世代時(shí)間為(51.56±20.55) h，可見輪蟲在較短的時(shí)間內(nèi)就可以由幼體轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w，最快在一天左右就進(jìn)入到繁殖期，大多數(shù)的輪蟲在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)都處在生殖前期和生殖期，輪蟲會(huì)產(chǎn)出幼體，幼體會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為成體，如果受試輪蟲挑選不嚴(yán)密、檢查周期和試驗(yàn)周期不合理，在很大程度上會(huì)影響毒性試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 接種密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

通過表2得出接種密度為0.35個(gè)·mL-1在第144小時(shí)的增殖倍數(shù)為136.4，最高種群密度為47.75個(gè)·mL-1，在所有接種密度中最高，達(dá)到最高種群密度的時(shí)間也最短，僅需要144 h。接種密度在低于0.35個(gè)·mL-1時(shí)，隨著接種密度的增高，在一定時(shí)間里所能達(dá)到的最高種群密度越高；接種密度在0.40個(gè)·mL-1和1.60個(gè)·mL-1之間時(shí)，隨著接種密度的增高，在一定時(shí)間里所能達(dá)到的最高種群密度也越高，但是趨勢不明顯；接種密度在2.00個(gè)·mL-1和10.00個(gè)·mL-1之間時(shí)最高種群密度沒有明顯的波動(dòng)，隨著接種密度的增高，平均日增長率呈明顯的降低趨勢?？傊臃N密度為0.35個(gè)·mL-1在所有接種密度中具有很高的代表性，具有短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高種群密度的優(yōu)勢，所以選擇0.35個(gè)·mL-1作為毒性試驗(yàn)開展時(shí)所需要的接種密度。

選擇差異性較顯著的接種密度組作出圖1。接種密度為0.35個(gè)·mL-1在第4至第8天的種群密度明顯高于其他各組。在實(shí)驗(yàn)第5天，接種密度為0.35個(gè)·mL-1的種群密度為41個(gè)·mL-1，分別是接種密度為0.20個(gè)·mL-1、0.60個(gè)·mL-1、1.20個(gè)·mL-1和2.00個(gè)·mL-1的1.28倍、1.86倍、1.62倍和2.05倍。由此可見，接種密度為為0.35個(gè)·mL-1在所有各組中種群增長最快，在144 h時(shí)達(dá)到最高種群密度，所以選擇144 h作為毒性實(shí)驗(yàn)的周期具有合理性。

表1 萼花臂尾輪蟲的生命表Table 1 Brachionus calyciflorus’s life table

表2 不同接種密度下輪蟲可達(dá)最高種群密度與種群日平均增殖率Table 2 Maximum population density and population growth rate of Brachionus calyciflorus cultured from the different initial population densities

圖1 不同接種密度對輪蟲種群增長的影響Fig. 1 Effects of initial population densities on population growth of Brachionus calyciflorus

2.3 分析與討論

從輪蟲24 h急性毒性試驗(yàn)方法的應(yīng)用來看并不統(tǒng)一，或者沒有嚴(yán)格的按照標(biāo)準(zhǔn)方法操作。儲昭霞等[17]取齡長在0～2 h內(nèi)的輪蟲幼體若干個(gè)，將每10個(gè)個(gè)體放入容量為3 mL的小玻璃杯中，然后加入體積為2 mL(內(nèi)含密度為3.0×109cells·mL-1的斜生柵藻)的各濃度草甘膦溶液24 h后，檢查記錄每個(gè)玻璃杯中輪蟲個(gè)體的存活數(shù)。黃林等[18]從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機(jī)吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個(gè)置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，2 h后收集孵化出的輪蟲幼體。每10個(gè)輪蟲幼體放人容積為5 mL的特制小玻璃杯中，加人3 mL測試液。分別于24 h、48 h后觀察記錄每個(gè)小杯中輪蟲的死亡數(shù)目。陳艷等[19]取預(yù)培養(yǎng)48 h中活潑健壯帶孤雌生殖卵的雌體置入另外同樣條件的燒杯中培養(yǎng)，觀察卵的孵出情況，取2 h內(nèi)孵出的幼體作為毒性試驗(yàn)的材料，24 h后觀察記錄試驗(yàn)結(jié)果。張才學(xué)等[20]用浮游植物網(wǎng)過濾出幼小輪蟲，在每支試管各加入隨機(jī)抽取的30個(gè)不帶卵的幼小輪蟲。試驗(yàn)期間不充氣，約投以1×106cells·mL-1小球藻和少量酵母。于6 h，12 h，24 h分別檢查各時(shí)間段的輪蟲死亡個(gè)數(shù)。然而，對比前人的實(shí)驗(yàn)操作方法，本方法具有較多優(yōu)勢，本方法在輪蟲生命表的基礎(chǔ)上，以種群為研究對象，通過接種密度實(shí)驗(yàn)找到了較適宜的接種密度，克服了頻繁檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果的困難(采用24 h檢查一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，將測試周期可以延長到7 d，在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性，提高了方法的可行性和準(zhǔn)確性。

本文應(yīng)用的毒死蜱、三唑酮和丁草胺都是中國稻田里的常用農(nóng)藥，將輪蟲的毒性試驗(yàn)方法應(yīng)用于這3種農(nóng)藥具有很高的代表性。毒死蜱(chlorpyrifos)作為高毒有機(jī)磷類農(nóng)藥的替代品種，在我國有著廣闊的應(yīng)用空間。值得注意的是，隨著該農(nóng)藥的大力推廣，其親體及代謝產(chǎn)物有可能通過多種途徑進(jìn)入水體。例如美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)從1987年開始對毒死蜱的水體污染進(jìn)行檢測。1987—1996年間在水體中檢測到的毒死蜱濃度為0.04～0.40 μg·L-1，并且呈逐年上升趨勢[21]。至于該農(nóng)藥的生態(tài)毒性，以往對魚類有較多研究[22-24]，對水生生物的毒性研究還不夠充分。三唑酮(triadimefon)是一種高效、低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)的廣譜殺菌劑，對多種植物上的真菌病害如白粉病、銹病等有良好的防治效果[25]。三唑酮在農(nóng)田施用后能夠向土壤深處遷移和擴(kuò)散，從而污染土壤和地下水體，并對土壤生態(tài)環(huán)境造成破壞[26]。Vincelli[27]模擬了三唑酮施用于高爾夫球場后發(fā)現(xiàn)，濃度在0.3 mg·L-1時(shí)，三唑酮會(huì)大量出現(xiàn)在地表水中。目前，關(guān)于三唑類殺菌劑對水生生物的毒性研究不多，國內(nèi)的相關(guān)研究涉及更少。丁草胺(butachlor)是我國在水稻田使用最多的一種除草劑。己有的研究表明丁草胺不僅在上壤中具有明顯的持留性[28]。而且對水生生物有較高的毒性[29]。通過輪蟲毒性試驗(yàn)方法得到3種農(nóng)藥對輪蟲的毒性效應(yīng)，進(jìn)一步評價(jià)了這3種農(nóng)藥在稻田中應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)性。

2.4 輪蟲毒性試驗(yàn)的結(jié)果與分析

通過毒性試驗(yàn)結(jié)果可以得出，3種農(nóng)藥對輪蟲的毒性大小為毒死蜱>丁草胺>三唑酮。我國“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”[30]將農(nóng)藥對溞類的毒性劃分為3個(gè)等級：LC50≤1 mg·L-1為高毒，1 mg·L-110 mg·L-1為低毒。按照上述標(biāo)準(zhǔn)， 無論以理論濃度，還是以實(shí)測濃度計(jì)，以施藥后96 h和120 h來看，毒死蜱對于輪蟲為高毒；丁草胺對輪蟲為中等毒性；三唑酮為低毒。

表3 三種農(nóng)藥對輪蟲的毒性試驗(yàn)匯總Table 3 Summary of the three pesticides’ toxicity test to Brachionus calyciflorus

綜上，本文根據(jù)輪蟲的生命表實(shí)驗(yàn)，接種密度實(shí)驗(yàn)，選擇了包含輪蟲整個(gè)生命周期的試驗(yàn)周期。從種群增長的角度肯定了以群體取代個(gè)體作為輪蟲室內(nèi)毒性試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物的可行性。

通過把這種輪蟲毒性試驗(yàn)方法應(yīng)用到毒死蜱、三唑酮、丁草胺，與輪蟲傳統(tǒng)的24 h和48 h急性毒性方法相比，這種新的方法易于操作，不需要單獨(dú)操作一只輪蟲，而是從種群增長的角度完成毒性試驗(yàn)；便于測定，不需要每4 h或6 h測定一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而是24 h觀察記錄一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果；誤差相對較小，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)重復(fù)，取樣前將輪蟲輕輕攪拌均勻，每個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)3次求平均值；試驗(yàn)周期合理，包含了輪蟲的整個(gè)生命史。因此，將接種密度設(shè)置為35個(gè)·(100mL)-1，試驗(yàn)周期設(shè)置為120 h或144 h都較為合理，但這種輪蟲毒性試驗(yàn)方法的完善和推廣還有待于進(jìn)一步研究。

[1] Snell T W, Janssen C R. Rotifers in ecotoxicology: A review [J]. Hydrobiologia, 1995, 313/314: 231-247

[2] Wallace R L, Snell T W. Phylum Rotifera [M] //Thorp J H, Covich A P. Ecology and Classification of North American Freshwater Invertebrates. San Diego: Academic Press, 2001: 195-254

[3] Kotani T, Hagiwara A, Snell T, et al. Euryhaline Brachionus strains (Rotifera) from tropical habitats: Morphology and allozyme patterns [J]. Hydrobiologia, 2005, 181: 161-167

[4] 呂林蘭. 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對萼花臂尾輪蟲繁殖生物學(xué)的影響[D]. 南京: 南京師范大學(xué), 2010: 17-18

Lv L L. Reproductive biology of environmental endocrine disruptors on B. calyciflorus [D]. Nanjing: Nanjing Normal University, 2010: 17-18

[5] Snell T W, Persoone G. Acute toxicity bioassays using rotifers. II. A freshwater test with Brachionus rubens [J]. Aquatic Toxicology, 1989, 14: 81-92

[6] 趙玉明, 何志輝. 在蒙古裸腹溞培養(yǎng)中用藥物殺滅褶皺臂尾輪蟲的研究[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 17(1) : 32-36

Zhao Y M, He Z H. Studies on chemicals killing of Brachionus plicatilis in culture of Moina mongolicaby chemicals Ⅱ. The chronic toxicity of five chemicals to Moina mongolica [J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2002, 17(1): 32-36 (in Chinese)

[7] 趙含英, 楊家新, 陸正和, 等. Cu2+對萼花臂尾輪蟲的毒性影響[J]. 南京師大學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2002, 25(4): 81-85

Zhao H Y, Yang J X, Lu Z H, et al. The toxic effect of Cu2+on rotifer Brachionus calyciflorus [J]. Journal of Nanjing Normal University: Natural Science Edition, 2002, 25(4): 81-85 (in Chinese)

[8] 謝欽銘, 趙偉偉. 三種藥物對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào): 理科版, 2007, 31(1): 100-102

Xie Q M, Zhao W W. Acute toxicity of three medicines to rotifer Brachionus plicatilis [J]. Journal of Nanchang University: Natural Science, 2007, 31(1): 100-102 (in Chinese)

[9] 呂林蘭, 楊家新, 匡騰蛟, 等. 氟他胺對萼花臂尾輪蟲的毒性影響[J]. 淡水漁業(yè), 2012, 42(4): 63-65

Lv L L, Yang J X, Kuang T J, et al. Toxic effects of flutamide on Brachionus calyciflorus [J]. Freshwater Fisheries, 2012, 42(4): 63-65 (in Chinese)

[10] OECD. Guideline for Testing of Chemicals No.202 Daphnia sp.: Acute Immobilisation Test [S]. Paris: OECE, 2004

[11] Gallardo W G, Hagiwara A, Tomita Y, et al. Effect of some vertebrate and invertebrate hormones on the population growth, mictic female production, and body size of the marine rotifer Brachionus plicatilis Muller [J]. Hydrobiologia, 1997, 358(1/3): 113-120

[12] Gilbert J J. Mictic female production in rotifer Brachionus calyciflorus [J] Journal of Experimental Zoology, 1963, 153: 113-124

[13] US EPA. Methods for measuring the acute toxicity of effluents to freshwater and marine organisms. EPA/600/485/013. [R] Washington DC: US EPA, 1985

[14] 席貽龍, 黃祥飛. 食物種類和濃度對壺狀臂尾輪蟲實(shí)驗(yàn)種群動(dòng)態(tài)的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 1994, 23(3): 227-234

Xi Y L, Huang X F. Effect of food supply in both food quality and quantity on the population dynamics of Brachionus urceolaris [J] Acta Hydrobiologica Sinica, 1994, 23(3): 227-234 (in Chinese)

[15] Park H G, Lee K W, Cho S H, et al. High density culture of the freshwater rotifer, Brachionus calyciflorus [J]. Hydrobiologia, 2001, 446: 369-374

[16] Snell T W, DesRosiers N J D. Effect of progesterone on sexual reproduction of Brachionus manjavacas (Rotifera) [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008, 363(1/2): 104-109

[17] 儲昭霞, 席貽龍, 徐曉平. 除草劑草甘膦對萼花臂尾輪蟲生活史特征的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2005, 16(6): 1142-1145

Chu Z X, Xi Y L, Xu X P. Effects of glyphosate on life history characteristics of freshwater rotifer Brachionus calyciflorus [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2005, 16(6): 1142-1145 (in Chinese)

[18] 黃林, 劉昌利, 韋傳寶. 兩種擬除蟲菊酯類殺蟲劑對萼花臂尾輪蟲的急性毒性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(23): 14172-14174

Huang L, Liu Y L, Wei C B. Acutetoxicity of two pyrethroid pesticides to Brachionus calyciflorus [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(23): 14172-14174 (in Chinese)

[19] 陳艷, 王金秋, 王陽. 微囊藻毒素對褶皺臂尾輪蟲的毒性效應(yīng)和種群增長影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2002, 2(3):198-201

Chen Y, Wang J Q, Wang Y. Toxicity and population growth effects of microcystin on the rotifer Brachionus plicatilis [J]. China Environmental Science, 2002, 2(3): 198-201 (in Chinese)

[20] 張才學(xué), 鄭文凱, 林玉鳳. 4種重金屬離子及其混合液對壺狀臂尾輪蟲的急性毒性試驗(yàn)[J]. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2005(1): 57-59

Zhang C X, Zheng W K, Lin Y F. Acute toxic test of four heavy metal ions and their mixed solution on the Brachionus urceus [J]. Journal of Zhanjiang Ocean University, 2005(1): 57-59 (in Chinese)

[21] 田芹, 周志強(qiáng), 江樹人, 等. 毒死蜱在環(huán)境水體中降解的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 24(2): 289-293

Tian Q, Zhou Z Q, Jiang S R, et al. Degradation of chlorpyrifos in environmental water [J]. Journal of Agro-environment Science, 2005, 24(2): 289-293 (in Chinese)

[22] 余向陽, 趙于丁, 王冬蘭, 等. 毒死蜱和三唑磷對斑馬魚頭部AChE活性影響及在魚體內(nèi)的富集[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(6): 2452-2455

Yu X Y, Zhao Y D, Wang D L, et al. Impact on the activity of acetylcholinesterase (Ache) in head and bioconcentration in zebrafish (Brachydanio rerio)after chronic exposure to chlorpyrifos and triazophos [J]. Journal of Agro-environment Science, 2008, 27(6): 2452-2455 (in Chinese)

[23] Rao J V, Rani C H S, Kavitha P, et al. Toxicity of chlorpyrifos to the fish Oreoehromis mossatnbicus [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2003, 70(5): 985-992

[24] Varó I, Serrano R, Pitarch E, et al. Toxicity and bioconcentration of chlorpyrifos in aquatic organisms: Artemia parthenogenetica (Crustacea), Gambusia affinis, and Aphanius iberus (Pisces) [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2000, 65: 623-630

[25] 劉長令. 世界農(nóng)藥大全一殺菌劑卷[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社，2006: 237

[26] 薛南冬, 楊仁斌. 丙硫克百威在幾種土壤中的遷移和降解研究[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2003, 40(1): 130-135

Xue N D, Yang R B. Studies on the translocation and degradation of benfuracarb in different soils [J]. Acta Pedologica Sinica, 2003, 40(1): 130-135 (in Chinese)

[27] Vincelli P. Simulations of fungicide runoff following applications for turfgrass disease control [J]. Plant Disease, 2004, 88(4): 391-396

[28] Shu S Q. Generalily of Herbicides [M]. Beijing: Science Press, 1989: 163-166

[29] Li F Z, Zhi L F. Effects of noxious property on carps' seed, young fish fry and frog egg following butachlor treatments [J]. Pesticides, 1989, 28(2): 30- 36

[30] 國家環(huán)境保護(hù)局. 化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 1990(4): 4-9, 3

◆

Research on Toxicity Test Method forBrachionuscalyciflorus

Xu Jiyang, Zhang Wenping, Li Shaonan*, Lang Qianping

Institute of Pesticide and Environmental Toxicology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China

5 May 2014 accepted 12 August 2014

To investigate the possibility of taking the populations instead of the individuals as object of indoor toxicity tests of rotifer, Brachionus calyciflorus was employed in this study to perform experiments to establish life-table and to determine population growth rates corresponding to different densities of inoculation. In addition to that, rotifer toxicity tests were performed using three types of pesticides, i.e. chlorpyrifos, butachlor and triadimefon. The experiment for life-table establishment indicated that the average lifetime and generation cycle of the rotifer were (78.76±33.08) h and (51.56±20.55) h, respectively. The experiments on inoculation density indicated that with increase in density of inoculation, growth rate of the populations decreased. Due to the information from the experiments, the toxicity tests started in density of 35 ind·(100 mL)-1and the tests lasted 144 h. Result of the toxicity tests showed that 96 h-EC50and 120 h-EC50were 0.6066 mg·L-1and 0.7323 mg·L-1, respectively, for chlorpyrifos; they were 1.851 mg·L-1and 3.058 mg·L-1, respectively, for butachlor; and the values were 12.84 mg·L-1and 11.63 mg·L-1, respectively, for triadimefon. Result of the study affirmed the possibility of taking the populations instead of the individuals as object of indoor toxicity tests of rotifers.

chlorpyrifos; butachlor; triadimefon; Brachionus calyciflorus; toxicity tests; inoculation density; test period

浙江省自然科學(xué)基金(LY12B07008)

徐吉洋(1988-)，男，碩士，研究方向?yàn)樗锷鷳B(tài)毒理，E-mail: xujiyang2012@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: snli@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140505002

2014-05-05 錄用日期：2014-08-12

1673-5897(2015)2-346-07

X55; Q81

A

李少南(1963—)，農(nóng)學(xué)博士，副教授，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，重點(diǎn)研究農(nóng)藥對非目標(biāo)生物的影響及生態(tài)效應(yīng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。

徐吉洋, 張文萍, 李少南, 等. 萼花臂尾輪蟲毒性試驗(yàn)的方法學(xué)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 346-352

Xu J Y, Zhang W P, Li S N, et al. Research on toxicity test method for Brachionus calyciflorus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 346-352 (in Chinese)