張勇，何琦，盧黎，楊紅

1. 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽550025 2. 貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴陽 550025

敵百蟲致小鼠外周血淋巴細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)作用研究

張勇1,*，何琦2，盧黎1，楊紅1

1. 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽550025 2. 貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴陽 550025

為探討敵百蟲致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)作用，以昆明小鼠為受試動物，敵百蟲按0、20、40、60 mg·kg-14個劑量水平，灌胃染毒小鼠2周。第5組以提取的正常小鼠外周血淋巴細胞經(jīng)50 μmol·L-1的H2O2處理為陽性對照組。采用經(jīng)改進的彗星試驗方法來檢測染毒后外周血淋巴細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)。結(jié)果表明，與空白組相比，各敵百蟲染毒組都能引起DNA損傷作用(P<0.01)并引起一定程度的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)，在較高濃度(40、60 mg·kg-1)時DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)尤為明顯，存在一定的潛在突變風(fēng)險。

敵百蟲；小鼠；遺傳毒性；DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)；DNA斷裂；彗星試驗

敵百蟲作為一種毒性低、殺蟲譜廣的有機磷農(nóng)藥和獸藥，被廣泛應(yīng)用于家畜寄生蟲、衛(wèi)生害蟲防治，但其具有強烈的胃毒作用和一定的觸殺作用，使用不當(dāng)，也會造成畜禽急慢性中毒，威脅畜禽以至人類健康[1-2]，已有資料報道了敵百蟲的毒性效應(yīng)[3-4]。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA-protein crosslinks, DPC)是DNA與蛋白質(zhì)形成的穩(wěn)定的共價化合物，正常細胞中存在一定量的DPC，這是DNA與核蛋白的正常聯(lián)系或代謝結(jié)果，對維持細胞的正常生理活動具有重要作用。當(dāng)有外來物理、化學(xué)因素作用時，會誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的DPC，破壞染色體結(jié)構(gòu)，影響基因表達[5]。與其他類型DNA損傷相比，DPC較難修復(fù)或易于發(fā)生易錯修復(fù)，在細胞周期中維持時間較長[6]。因此，WHO(世界衛(wèi)生組織)指出，DPC可作為機體潛在突變的分子標(biāo)記物[7]。有研究表明，彗星試驗可用于檢測DNA交聯(lián)[8]。本試驗以小鼠外周血淋巴細胞為研究對象，用不同劑量敵百蟲進行體內(nèi)染毒處理，通過改良單細胞凝膠電泳試驗檢測細胞DNA損傷和DPC情況，揭示敵百蟲對小鼠外周血淋巴細胞的毒性效應(yīng)，評價敵百蟲對生態(tài)環(huán)境和人體健康可能存在的危害和影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物

4周齡普通級昆明系小白鼠，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(合格證SCXK2013-0001)常規(guī)飼養(yǎng)，觀察1周后，健康者供試驗用。

1.2 試驗儀器與試驗試劑

高速冷凍離心機(Centrifage 5415R)，德國Eppendorf公司；恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；純水儀(Molatom 1810c)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；倒置熒光顯微操作系統(tǒng)(C-SHG1)，日本Nikon公司；電子分析天平(FC204)，上海天平儀器廠；水平板電泳槽及電泳儀(DYY-2C)，北京六一儀器廠。

質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為90%敵百蟲原藥購自山東大成農(nóng)藥股份有限公司；低熔點瓊脂糖、Tris-base、Na2EDTA、D-Hanks溶液、二甲基亞砜(DMSO)、20 mg·mL-1蛋白酶K溶液購自上海生工生物工程有限公司，分析純；TritonX-100、Goldview染色劑、Tris-HCL、噻唑藍購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，分析純；正常熔點瓊脂糖，購自BIOWEST公司；小鼠淋巴細胞分離液，購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；硼酸，購自北京化工廠，分析純；裂解液(2.5 mol·L-1NaCl、100 mmol·L-1Na2EDTA、10 mmol·L-1Tris，pH=10)，用前按體積百分比加入1% TritonX-100和10% DMSO；堿性電泳液(1 mmol·L-1Na2EDTA、300 mmol·L-1NaOH，pH=13)；中和液(0.4 mol·L-1Tris-HCL，pH=7.5)；TE緩沖液(10 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，pH=10)；5×TBE溶液(445 mmol·L-1Tris Base，10 mmol·L-1EDTA，445 mmol·L-1硼酸，加水至1 L)。

1.3 動物分組與處理

4周齡昆明系小白鼠50只隨機分成5組，每組10只，雌雄各半。用新鮮且pH≤5.5雙蒸水溶解敵百蟲，渦旋混勻，以灌胃方式對小鼠連續(xù)染毒2周。①空白組：A組和A1組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不用敵百蟲染毒。②低劑量染毒組：B組和B1組小鼠染毒劑量為每天20 mg·kg-1。③中等劑量染毒組：C組和C1組小鼠染毒劑量為每天40 mg·kg-1。④高劑量染毒組：D組和D1組小鼠染毒劑量為每天60 mg·kg-1。⑤H2O2處理組：E組和E1組提取常規(guī)飼養(yǎng)小鼠外周血淋巴細胞經(jīng)50 μmol·L-1的H2O2于37 ℃處理15 min。A組、B組、C組、D組和E組為對照組；A1組、B1組、C1組、D1組和E1組為試驗組。

1.4 檢測原理

化合物通過作用于細胞DNA造成鏈斷裂，形成帶負電荷的DNA碎片，在電場作用下形成彗星圖像，碎片越小遷移越遠；若發(fā)生交聯(lián)效應(yīng)，可使某些蛋白質(zhì)與DNA碎片附著在一起，使DNA分子量增加，在電場中泳動的距離相應(yīng)縮短。通過加入蛋白酶K以去除與DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)，使DNA遷移率上升。通過對比未添加蛋白酶K組與添加蛋白酶K組的彗星試驗結(jié)果，即可判斷該藥物是否具有交聯(lián)作用。

1.5 外周血淋巴細胞懸液制備

用眼眶靜脈采血法采集0.5 mL小鼠血液于肝素鈉抗凝管中，按照Ficoll密度梯度法，取0.5 mL全血加于0.5 mL淋巴細胞分離液上，待其形成明顯界面，380 g離心20 min，吸出中間白色淋巴細胞層于1.5 mL離心管，并加D-Hanks至1.5 mL，500 g離心20 min，重復(fù)洗滌細胞2次。用D-Hanks重懸細胞，再將細胞濃度調(diào)至2×106個·mL-1左右后置于4 ℃冰箱待用，用苔盼藍染色，各組細胞存活率接近90%。每一染毒濃度制備2組細胞，其中對照組用于分析敵百蟲引起的細胞DNA斷裂損傷，試驗組分析敵百蟲引起DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。

1.6 彗星試驗

將100 μL正常熔點瓊脂糖(0.75 g/100 mL 1×TBE)均勻鋪在載玻片上，蓋上蓋玻片，4 ℃凝固10 min后輕輕移去蓋玻片，此為第一層膠。然后將20 μL分離所得淋巴細胞懸液與100 μL低熔點瓊脂糖(1 g/100 mL 1×TBE)充分混合，鋪于第一層膠上，4 ℃凝固10 min。置入預(yù)冷1 h的裂解液中4 ℃下避光裂解1.5 h。電泳前將裂解好的玻片放入新配制的堿性電泳液中4 ℃下避光解旋20 min，然后將玻片放于水平電泳槽中，20 V、200 mA、4 ℃電泳20 min。電泳結(jié)束后，將玻片置于4 ℃預(yù)冷的中和液中和15 min，最后用Goldview (按體積比1∶1000 與1×TBE稀釋液混合)染色，上述過程均在暗處黃色燈光下操作，以避免引起額外的DNA損傷。

1.7 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)檢測

裂解后，試驗組用冰冷的TE緩沖液沖洗載玻片5 min，在0.5 mg·mL-1的蛋白酶K溶液中，37 ℃恒溫過夜，其余步驟同彗星試驗。將試驗組所得彗星圖像與未添加蛋白酶K的對照組彗星圖像進行比較。

1.8 彗星試驗圖像采集和數(shù)據(jù)分析

用日本Nikon C-SHG1倒置熒光顯微鏡觀察Goldview染色凝膠，放大倍數(shù)為10×20倍，拍攝細胞圖像，用CASP軟件對所得各組彗星圖像進行分析，每個處理組隨機分析30個細胞的彗尾長度、彗尾DNA含量和Olive尾距數(shù)據(jù)。最后，用SPSS 13.0對所得數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

由圖1可見，A組及A1組細胞DNA致密，邊緣光滑，無明顯拖尾，表明DNA無明顯損傷。敵百蟲對照組(B組、C組和D組)和試驗組(B1組、C1組和D1組)經(jīng)單細胞凝膠電泳后形成彗星圖形，頭部DNA集中，亮度較強，尾部由DNA碎片組成，表明細胞DNA受損。

由表1可見，對照組彗星試驗結(jié)果表明，與A組相比，敵百蟲染毒組可引起小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷(P<0.01)。敵百蟲染毒組中彗尾DNA含量、彗尾長度和Olive尾距隨著染毒劑量增加而變大。但在C組和D組中，彗尾DNA含量、彗尾長度和Olive尾距增加趨勢減緩，DNA碎片遷移率和產(chǎn)生DNA碎片數(shù)量增加不明顯，可能產(chǎn)生了可將DNA碎片附著在一起的化合物，影響了DNA遷移率。

表1 敵百蟲對照組小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷Table 1 DNA damage of mice peripheral blood lymphocytes in the control groups induced by trichlorfon

注：A，0 mg·kg-1敵百蟲組；B，20 mg·kg-1敵百蟲組；C，40 mg·kg-1敵百蟲組；D，60 mg·kg-1敵百蟲組；E，H2O2組； a,b,c,d,e表示同列中不同字母組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.01)。

Note: A, 0 mg·kg-1trichlorfon group; B, 20 mg·kg-1trichlorfon group; C, 40 mg·kg-1trichlorfon group; D, 60 mg·kg-1trichlorfon group; E, 50 μmol·L-1H2O2group; a,b,c,d,e means with different letters across in the same column are significantly different (P<0.01).

圖1 不同濃度敵百蟲對小鼠外周血淋巴細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)作用彗星圖像(10x20倍)注：A，0 mg·kg-1敵百蟲組；B，20 mg·kg-1敵百蟲組；C，40 mg·kg-1敵百蟲組；D，60 mg·kg-1敵百蟲組；E，H2O2組； A1，B1，C1，D1，E1(A、B、C、D、E分別用0.5 mg·mL-1的蛋白酶K溶液浸泡處理)。Fig. 1 Images of DNA-protein crosslinks (DPC) examined by comet assay in mice peripheral blood lymphocytes treated by different doses of trichlorfon (10x20 times)Note: A, 0 mg·kg-1 trichlorfon group; B, 20 mg·kg-1 trichlorfon group; C, 40 mg·kg-1 trichlorfon group; D, 60 mg·kg-1 trichlorfon group; E, 50 μmol·L-1 H2O2 group. A1, B1, C1, D1, E1 (A, B, C, D, E were treated respectively with 0.5 mg·mL-1 protease K).

表2 敵百蟲試驗組小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷Table 2 DNA damage of mice peripheral blood lymphocytes in the experimental groups induced by trichlorfon

注：A，0 mg·kg-1敵百蟲組；B，20 mg·kg-1敵百蟲組；C，40 mg·kg-1敵百蟲組；D，60 mg·kg-1敵百蟲組；E，H2O2組； a,b,c,d,e表示同列中不同字母組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.01)。

Note: A, 0 mg·kg-1trichlorfon group; B, 20 mg·kg-1trichlorfon group; C, 40 mg·kg-1trichlorfon group; D, 60 mg·kg-1trichlorfon group; E, 50 μmol·L-1H2O2group; a,b,c,d,e means with different letters across in the same column are significantly different (P<0.01).

由表2可見，經(jīng)蛋白酶K處理后的試驗組中彗尾DNA含量、彗尾長度和Olive尾距均隨著濃度增加而顯著性增加(P<0.01)，表明經(jīng)蛋白酶K處理后，由于與淋巴細胞DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)被蛋白酶K所消化，分子量變小，遷移率增加。

圖2 通過彗尾長度觀察敵百蟲致小鼠外周血淋巴 細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。Fig. 2 DPC of mice peripheral blood lymphocytes in tail length induced by trichlorfonNote:**P<0.01, *P<0.05, compared to the control group.

由圖2可見，經(jīng)過蛋白酶K處理后，空白組和H2O2處理組DNA彗尾長度與對照組相比無明顯變化；而各敵百蟲試驗組與對照組相比，細胞的DNA彗尾長度都有一定程度增加，尤其是在較高濃度水平時(40、60 mg·kg-1)，彗尾長度明顯增加。如圖3和圖4所示，彗尾DNA含量和Olive尾距2項數(shù)據(jù)也得出一致結(jié)果，提示在高濃度敵百蟲染毒情況下發(fā)生DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)從而抑制了DNA遷移率。

圖3 通過彗尾DNA百分含量觀察敵百蟲致小鼠外周 血淋巴細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。Fig. 3 DPC of mice peripheral blood lymphocytes in percentage of tail DNA induced by trichlorfon Note: **P<0.01, *P<0.05, compared to the control group.

圖4 通過Olive尾距觀察敵百蟲致小鼠外周血淋巴 細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)注：與對照組比較，** P<0.01，*P<0.05。Fig. 4 DPC of mice peripheral blood lymphocytes in tail Olive moment induced by trichlorfonNote: **P<0.01, *P<0.05, compared to the control group.

3 討論(Discussion)

DPC是DNA與核蛋白的正常聯(lián)系或其代謝的結(jié)果[9]，生物體內(nèi)會存在一定量的DPC，這對于維持細胞的正?；顒泳哂兄匾饔谩．?dāng)有外來因素作用時，會誘導(dǎo)出現(xiàn)過量的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，由于DPC的形成會對DNA構(gòu)象和功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此，與其他DNA損傷類型相比，DPC較難修復(fù)，易導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。大量研究表明敵百蟲具有潛在的遺傳毒性[10-13]。在體內(nèi)和體外研究中發(fā)現(xiàn)，敵百蟲可引起機體谷氨酸甘肽(GSH)含量下降[14]，抑制谷氨酸甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性[15]。敵百蟲可能通過釋放大量自由基損害生物體抗氧化系統(tǒng)或作為抗氧化酶的抑制劑，使羥自由基和氧自由基清除能力下降，間接導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物的增加[16]。

目前，進行DPC測定時，多數(shù)使用氯化鉀-十二烷基硫酸鈉(KCL-SDS)沉淀法，而KCl-SDS沉淀法僅局限于確定DPC作用本試驗可在相同試驗條件下，通過彗星試驗同時觀察到DNA斷裂損傷作用和DPC作用。根據(jù)張遵真等[17-18]的研究，彗星試驗檢測DPC時選用H2O2作為標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑比其他斷裂劑更方便和有效。

本試驗通過彗星試驗檢測證明連續(xù)灌服低劑量敵百蟲可引起小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷(P<0.01)。同時，本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，通過設(shè)置空白組和標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑H2O2處理組作參照，并加入一定量蛋白酶K處理使試驗組細胞在電泳時產(chǎn)生更大的遷移，來判斷是否發(fā)生蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)?？瞻捉M和H2O2處理組經(jīng)蛋白酶K處理后，與未添加蛋白酶K處理的試驗組所得彗星試驗結(jié)果相比無明顯區(qū)別；而各敵百蟲試驗組細胞的彗尾DNA含量、彗尾長度和Olive尾距與對照組相比，都有一定程度的增加，尤其是在較高濃度(40、60 mg·kg-1)水平時，增加明顯，表明在高濃度敵百蟲染毒下小鼠外周血淋巴細胞出現(xiàn)了DPC效應(yīng)。DPC可引起遺傳表達及染色體結(jié)構(gòu)異常，這可能是敵百蟲介導(dǎo)的遺傳毒性的重要機制。通過檢測DPC作用，對探討敵百蟲遺傳毒性的分子機制有著重要作用。且本試驗方法簡便快速，不需放射性標(biāo)記，不需要昂貴儀器、設(shè)備，有利于推廣應(yīng)用。

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◆

Study on DNA-Protein Crosslinks Induced by Trichlorfon in Peripheral Blood Lymphocyte of Mice

Zhang Yong1,*, He Qi2, Lu Li1, Yang Hong1

1. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region of Ministry of Education and Guizhou Province, College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China 2. Huaxi Agriculture Bureau of Guiyang, Guiyang 550025, China

26 November 2013 accepted 19 April 2014

In order to study DNA-protein crosslinks(DPC) of trichlorfon on peripheral blood lymphocyte in mice, mice were orally administrated with trichlorfon daily for 14 days at the concentrations of 0, 20, 40, 60 mg·kg-1respectively. The fifth group as positive control group was established by extracting the peripheral blood in mice treated with 50 μmol·L-1hydrogen peroxide. The DPC effects of trichlorfon were measured by comet assay. The results indicated that every group can cause the DNA damaged (P<0.01) and lead to DPC effects compared with the blank group. Moreover, DPC is highly obvious when at high concentrations (40, 60 mg·kg-1), which suggested there was a risk of potential mutation.

trichlorfon; mice; DNA damage; DNA-protein crosslinks; genotoxicity; comet assay

貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目“綠色富硒豬肉全程質(zhì)量控制配套技術(shù)研究示范項目”[黔科合NY(2007)字(3007)號]；貴州省自然科學(xué)基金“分子印跡技術(shù)應(yīng)用于豬肉中阿維菌素類藥物殘留的檢測研究”[黔科合J字(2008)2128]；貴州大學(xué)青年科技基金項目“肉品中農(nóng)藥等有毒有害物質(zhì)的快速檢測及其遺傳毒性研究”[貴大自青基合字(2007)074]

張勇(1975-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為動物育種及健康養(yǎng)殖, E-mail：as.yzhang@gzu.edu.cn；

10.7524/AJE.1673-5897.20131126003

2013-11-26 錄用日期：2014-04-19

1673-5897(2015)2-210-06

X171.5

A

張勇, 何琦, 盧黎, 等. 敵百蟲致小鼠外周血淋巴細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)作用研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(2): 210-215

Zhang Y, He Q, Lu L, et al. Study on DNA-protein crosslinks induced by trichlorfon in peripheral blood lymphocyte of mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 210-215 (in Chinese)