李秀霞,李 嬌,孫協(xié)軍,馮彥博,季曉琳,李 爽,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李秀霞,李 嬌,孫協(xié)軍,馮彥博,季曉琳,李 爽,勵(lì)建榮*

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

孔雀石綠(MG)是一種禁止用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的三苯甲烷類藥物。該藥物殺菌效果好但具有“三致”危害,殘留在水產(chǎn)品中會(huì)損害人體健康。本文綜述了水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物殘留的檢測(cè)方法的研究進(jìn)展,可以為新方法的建立或采用提供參考。

水產(chǎn)品,孔雀石綠,樣品前處理,檢測(cè)方法

孔雀石綠(Malachite green,MG；化學(xué)名稱:四甲基代二氨基三苯甲烷；分子式:C23H25ClN2)(分子結(jié)構(gòu)見圖1)屬三苯甲烷類染料,又稱堿性孔雀(石)綠、堿性綠、品綠、鹽基塊綠、苯胺綠等,是具有金屬光澤的綠色結(jié)晶狀固體[1],易溶于水和乙醇,水溶液呈藍(lán)綠色。在工業(yè)上,曾經(jīng)作為染料被用于制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品染色劑和細(xì)胞化學(xué)染色劑[2]；在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上,作為殺菌劑用于預(yù)防和治療各類水產(chǎn)生物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等,其中治療魚卵和魚體的水霉病的效果較好,魚類在打撈過程中,魚體易受傷而被真菌感染,孔雀石綠可有效控制真菌?？兹甘G化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,多以草酸鹽的形式存在,孔雀石綠進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后,通過生物轉(zhuǎn)化,被還原成脂溶性的無色孔雀石綠,并在組織中蓄積[3],具有高毒性、高殘留和致畸、致癌、致突變的危害[1]?？兹甘G在魚體內(nèi)可代謝為無色孔雀石綠(Leucomalachite green,LMG；分子式:C23H26N2)(分子結(jié)構(gòu)見圖1),無色孔雀石綠也叫隱性孔雀石綠,結(jié)構(gòu)式中連接三個(gè)苯基的碳是單鍵,性質(zhì)較孔雀石綠穩(wěn)定,但毒性更強(qiáng)。鑒于孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物-無色孔雀石綠的危害,美國以及歐盟許多國家都將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物[4],我國也于2002年5月將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物(農(nóng)業(yè)部公告193號(hào))[5],但由于孔雀石綠殺菌效果較好并且價(jià)格低廉,個(gè)別養(yǎng)殖戶仍在使用,造成水產(chǎn)品或養(yǎng)殖水體中仍舊被檢出有痕量的孔雀石綠殘留。

近年來,水產(chǎn)品中孔雀石綠被檢出的事件也時(shí)有發(fā)生,為有效保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全,對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠殘留的檢測(cè)方法的研究是必要的。本文從樣品前處理方法和孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠殘留的檢測(cè)方法兩方面進(jìn)行闡述,可以為新方法的建立或采用提供參考。

圖1 孔雀石綠和無色孔雀石綠的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of MG and LMG

1 前處理方法

水產(chǎn)品中MG以及LMG的前處理方法主要分兩步:第一步是使用乙腈及其他溶劑提取,第二步是用固相萃取柱(SPE)凈化[6]。

1.1 樣品制備和提取

目前,人工養(yǎng)殖魚類中可能被添加孔雀石綠[7],無色孔雀石綠在水產(chǎn)品組織中累積,它的去除很大程度上依賴于脂肪的含量的變化[8]。

我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20361-2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》[9]在樣品前處理過程中加入硼氫化鉀,將水產(chǎn)品中殘留的孔雀石綠全部還原成隱性孔雀石綠,再采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量檢測(cè)。此方法的檢出限及回收率均較好,但樣品前處理過程需要經(jīng)過溶劑反復(fù)萃取、離心、震蕩、固相萃取、干燥等多個(gè)步驟,過程繁瑣,導(dǎo)致孔雀石綠回收率不穩(wěn)定。

因此,國內(nèi)許多學(xué)者對(duì)于孔雀石綠的提取及凈化方法進(jìn)行了改進(jìn):吳桂玲[10]等在樣品前處理過程中省略了二氯甲烷萃取步驟,并采用氮?dú)獯蹈煞ㄌ娲诵D(zhuǎn)蒸發(fā)步驟,其中孔雀石綠的加標(biāo)回收率在88%～94%之間。楊賢慶[11]等對(duì)國標(biāo)GB/T20361-2006孔雀石綠提取方法進(jìn)行了簡化,提取過程中即加入乙酸銨溶液,控制pH4.5,同時(shí)加入對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺,然后再加入酸性氧化鋁。采用該方法對(duì)羅非魚、對(duì)蝦和鰻鱺三種水產(chǎn)品的測(cè)定結(jié)果顯示,回收率為80.7%～109.8%。

1.2 樣品凈化和富集

由于魚肉組織中富含蛋白質(zhì),脂肪等,提取基質(zhì)中雜質(zhì)干擾很多,需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理,多用二氯甲烷對(duì)其反復(fù)萃取,羅瑞峰[12]等人發(fā)現(xiàn)二氯甲烷萃取過程中容易出現(xiàn)分層不穩(wěn)定的問題,有時(shí)二氯甲烷層會(huì)出現(xiàn)分層不明顯或二氯甲烷層忽上忽下的情況。因此,對(duì)凈化方法進(jìn)行了改進(jìn),在分液漏斗中加入飽和氯化鈉溶液,由于鹽析作用,使弱極性的LMG更易轉(zhuǎn)入有機(jī)相而易分層,該方法的加標(biāo)回收率在78.3%～100.9%。

在樣品的富集方面,大多數(shù)學(xué)者選用中性或酸性氧化鋁固相萃取柱串聯(lián)丙磺酸陽離子固相萃取柱(PRS)。宮向紅[13]等人比較了混合型陽離子交換固相萃取小柱(MCX)、混合型弱陽離子交換反相固相萃取柱(WCX)以及混合型反相陽離子交換固相萃取小柱(MCAX)的回收率,發(fā)現(xiàn)WCX對(duì)MG及LMG的保留性太差,淋洗過程中有損失。而MCAX的保留性較好、容易洗脫、回收率在90%～95%。竇紅[14]選用柱色譜用的硅膠填充固相萃取柱,效果也良好,孔雀石綠及代謝物的檢出限分別為2g/kg和4g/kg,加標(biāo)回收率為70%～95%。

2 檢測(cè)方法

水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[15]、高效液相色譜質(zhì)譜法[16]、酶聯(lián)免疫吸附法[17]等,其中以高效液相色譜法最為常用。

2.1 高效液相色譜法

目前,高效液相色譜檢測(cè)法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-Vis)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-Fld)還有高效液相色譜-紫外熒光檢測(cè)法。無論紫外還是熒光檢測(cè),這兩種技術(shù)均滿足食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)以及歐共體(EC)規(guī)定的靈敏度要求[18]。

2.1.1 高效液相色譜紫外檢測(cè)法 孔雀石綠在水產(chǎn)品體內(nèi)可被代謝為無色孔雀石綠,所以魚體內(nèi)同時(shí)殘留孔雀石綠以及無色孔雀石綠。孔雀石綠肉眼可見,水溶液顯藍(lán)綠色,可被可見光分光光度計(jì)或者高效液相色譜的紫外光檢測(cè)器測(cè)定(檢測(cè)波長618nm)。

我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19857-2005[16]是利用柱后衍生法,在液相色譜柱和紫外-可見光檢測(cè)器之間接上填充二氧化鉛的衍生柱,目的是將無色孔雀石綠衍生成孔雀石綠。

Lee[19]等采用LC-Vis在波長618nm和588nm下同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的殘留,并且通過LC-ESI-MS/MS的方法進(jìn)行定性,證實(shí)了兩者就是所要檢測(cè)目標(biāo),其中MG和LMG的回收率分別為74.8%～83.8%和80.0%～88.4%。張彤晴[20]等采用二氯甲烷混合溶劑萃取、離心分離及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的方法提取凈化水中孔雀石綠(MG)和隱性孔雀石綠(LMG),HPLC-Vis檢測(cè),回收率在83%～93.5%之間。國外對(duì)于孔雀石綠的研究主要集中于其毒理藥理作用及清除方法,而檢測(cè)方法方面研究報(bào)道相對(duì)較少,Wu等[21]對(duì)鯰魚和鱒魚LMG和MG殘留進(jìn)行了分析,采用二氯甲烷液液萃取后,堿性氧化鋁柱和MCX柱凈化,HPLC-Vis檢測(cè),LMG采用PbO2柱后氧化衍生,此方法的鯰魚LMG和MG加標(biāo)回收率分別在75.4%和61.3%,鱒魚中LMG和MG回收率分別在82.6%和48.6%。Long[22]等采用一種新型的氧化柱對(duì)LMG采用柱后衍生,二氯甲烷液液萃取,中性氧化鋁凈化,得到MG、LMG的回收率分別為67.3%～73.9%和84.7%～92.1%。

2.1.2 高效液相色譜熒光檢測(cè)法 無色孔雀石綠肉眼不可見,水溶液顯無色,但是無色孔雀石綠具有熒光特性,因此可用熒光分光光度計(jì)或者高效液相色譜的熒光檢測(cè)器測(cè)定(激發(fā)波長265nm；發(fā)射波長360nm)。國標(biāo)GB/T20361-2006[23]是在樣品前處理過程中加入硼氫化鉀,將孔雀石綠還原成無色孔雀石綠,再通過熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。

王靜[24]等人在上述國標(biāo)的基礎(chǔ)上探討了硼氫化鉀濃度的選擇以及孔雀石綠的轉(zhuǎn)化率問題。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明:0.2mol/L硼氫化鉀溶液3mL可以保證孔雀石綠轉(zhuǎn)化為無色孔雀石綠的轉(zhuǎn)化率在99.1%～100.8%。萬譯文[25]等人用流動(dòng)相乙腈和乙酸銨緩沖液、乙腈反復(fù)提取,最后用二氯甲烷反萃取,采用PRS柱上接中性氧化鋁柱凈化,硼氫化鉀還原,反向柱色譜分離,使用高效液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)。方法操作簡單、靈敏度高,加標(biāo)回收率在75.1%～95.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.7%～7.1%,檢出限均為0.5μg/kg。周蓉[26]等人根據(jù)GB/T19857-2005(水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定)、SC/T3021-2004(水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測(cè)定,液相色譜法)和GB/T20361-2006(水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定,高效液相色譜熒光檢測(cè)法),利用高效液相色譜對(duì)孔雀石綠的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化:采用氰基柱分離、改變流動(dòng)相比例、減少流速和梯度洗脫等方式,使孔雀石綠的最低檢測(cè)達(dá)到5μg/mL；隱性孔雀石綠達(dá)到2μg/mL。

2.1.3 高效液相色譜紫外和熒光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)法 針對(duì)實(shí)際操作中可能會(huì)出現(xiàn)孔雀石綠不易完全被硼氫化鉀還原為無色孔雀石綠的情況,可以將紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器串聯(lián)起來使用,這樣無色孔雀石綠可以用熒光檢測(cè)器檢測(cè)；沒有被還原的孔雀石綠可以被紫外檢測(cè)器檢測(cè)出來,最后將兩者一起定量。

桂英愛[27]等人采用乙腈/二氯甲烷(1∶1,v/v)萃取和35～40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法提取及凈化水樣中孔雀石綠和隱性孔雀石綠,采用紫外和熒光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè),該方法的兩種物質(zhì)的加標(biāo)回收率分別為95.2%和92.3%,最低檢測(cè)限1.1ug/kg,檢測(cè)方法穩(wěn)定,簡便,靈敏度高,無需柱后氧化。

2.2 高效液相色譜質(zhì)譜法

歐共體(EC)在2002年的657號(hào)委員會(huì)決議指示,孔雀石綠、無色孔雀石綠、結(jié)晶紫和亮綠這四個(gè)鑒定點(diǎn)需要獲得可靠的物質(zhì)鑒定[28],因此,高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)品孔雀石綠殘留的分析中。該方法取替高效液相色譜的紫外或者熒光檢測(cè)器,使用離子阱質(zhì)譜或者三重四級(jí)桿質(zhì)譜作為檢測(cè)器,增強(qiáng)了對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定能力,同時(shí)也保留了高效液相色譜的檢出限低、靈敏度高等特點(diǎn)。然而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀昂貴的價(jià)格限制了該方法在一般實(shí)驗(yàn)室以及科研質(zhì)檢單位的普及。

國標(biāo)GB/T19857-2005[16]將待測(cè)樣品用乙腈—乙酸銨緩沖溶液提取,再用乙腈提取后,液液分配到二氯甲烷層,經(jīng)中性氧化鋁柱和PRS柱凈化后經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定,內(nèi)標(biāo)法定量。方法檢出限0.5μg/kg。Juliana[29]等人對(duì)QuEChERS技術(shù)[Quick(快速),Easy(簡易),Cheap(廉價(jià)),Effective(有效),Rugged(穩(wěn)定),Safe(安全)的萃取方法]進(jìn)行改良,用乙腈和pH3～pH5的水溶液進(jìn)行提取,SPE法進(jìn)行凈化,待測(cè)樣品最后運(yùn)用LC-MS/MS檢測(cè)。該方法最低檢測(cè)限2ng/g,準(zhǔn)確度95%～107%。兆善貞[30]等人提出了高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)中的孔雀石綠及其代謝物的方法。內(nèi)標(biāo)法定量,四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。檢出限為0.5μg/kg?；厥章试?3.3%～120%之間,還采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集模式結(jié)合增強(qiáng)離子掃描模式對(duì)化合物進(jìn)行定性分析,能夠在定量同時(shí)進(jìn)行定性確證。謝世紅[31]等用乙腈提取樣品后,用中性氧化鋁柱凈化,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。最低檢出限為0.5μg/kg,加標(biāo)回收率為80%～110%,符合國標(biāo)要求,該方法也可以同時(shí)測(cè)定氯霉素殘留。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫法是一種免疫學(xué)檢測(cè)方法,該方法具有特異性和敏感性。王權(quán)[32]等人采用抗無色孔雀石綠單克隆抗體建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的間接競(jìng)爭ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果表明,LMG-McAb最佳稀釋倍數(shù)為1∶80000,包被抗原最佳質(zhì)量濃度為0.80μg/mL；競(jìng)爭反應(yīng)時(shí)的LMG理想稀釋液為40%乙腈水溶液；最低檢測(cè)限為1.29ng/mL,鰻魚肉樣的平均加標(biāo)回收率為90%～110%；該方法與其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。利用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的特點(diǎn)是速度快,靈敏度高,適合篩選大批量樣品,但此種方法的缺點(diǎn)是只能測(cè)定孔雀石綠殘留的總量而且測(cè)定結(jié)果的假陽性幾率高。

2.4 其他檢測(cè)方法

對(duì)于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的其他檢測(cè)方法還有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、分光光度法[33]、薄層色譜法[34-35]等。Nebot[6]等采用超聲波輔助提取和二氯甲烷萃取的方法,應(yīng)用Aglient1100氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)幾種魚的孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析,各種被檢樣品中MG的加標(biāo)回收率都在70%以上,檢出限2μg/kg。分光光度法和薄層層析法比較適用于被檢測(cè)樣品中目標(biāo)化合物含量較高的情況,多被用于從本體中大量提取某種有效成分并對(duì)其分離、純化和鑒定等。而對(duì)于水產(chǎn)品中檢測(cè)微量甚至痕量的孔雀石綠,容易受到基質(zhì)中其他雜質(zhì)的影響而存在靈敏度低、定性結(jié)果常出現(xiàn)假陽性；定量結(jié)果誤差范圍大的缺點(diǎn)。

3 展望

目前,隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷壯大,消費(fèi)者對(duì)于水產(chǎn)品的需求越來越大,水產(chǎn)品安全問題不容被忽視。水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物殘留可能對(duì)消費(fèi)者的健康甚至我國水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易造成影響。所以孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物殘留的檢測(cè)方法的研究具有重要意義。高效液相色譜法能夠?qū)δ繕?biāo)檢測(cè)物進(jìn)行有效分離,具有靈敏度高,檢出限低等優(yōu)點(diǎn)；高效液相色譜質(zhì)譜法雖然具有強(qiáng)大的化合物結(jié)構(gòu)鑒定能力,但由于成本較高,不適合一般科研實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)化驗(yàn)室；酶聯(lián)免疫法有特異性和敏感性的優(yōu)點(diǎn),酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)速度快,適合大批量檢測(cè),但易受環(huán)境條件影響而出現(xiàn)假陽性結(jié)果,對(duì)檢測(cè)的定性判斷造成干擾；其他檢測(cè)方法像分光光度法以及薄層色譜法因其靈敏度低、檢測(cè)結(jié)果誤差范圍大,不適合于微量孔雀石綠的檢測(cè)。綜上所述,今后我國水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物殘留的檢測(cè)方法研究可以采用高效液相色譜法,建立簡單有效、自動(dòng)化程度高的前處理方法,減化樣品前處理中提取和凈化步驟,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、降低檢測(cè)方法的檢出限。

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Research progress in detection methods of malachite green andits metabolites residues in aquatic products

LI Xiu-xia,LI Jiao,SUN Xie-jun,FENG Yan-bo,JI Xiao-lin,LI Shuang,LI Jian-rong*

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Food Safety Key Lab ofLiaoning Province,Engineering and Technology Research Center of Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Malachite green(MG)belongs to Triphenylmethane,which has been banned in aquiculture. It is a broad-spectrum fungicide,but the residues of MG and its metabolites in aquatic products are very harmful to human health because of their carcinogenesis,mutagenesis and teratogenecity. In this article,the recent detecting methods development of MG and its metabolites residues in aquatic products were summarized,which provided the reference for the establishment and use of new method.

aquatic products;malachite green;sample pretreatment;detection methods

2014-05-14

李秀霞(1973-)，女，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工的研究。

*通訊作者:勵(lì)建榮(1964-)，男，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品和果蔬貯藏加工及質(zhì)量安全控制方面的研究。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD29B06)；遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(LNSAKF2011015)。

TS219

A

1002-0306(2015)03-0385-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.075