張曉峰,李 婉,李文杰,時寶慶,王 旗

(鄭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系,河南鄭州 450001)

低聚果糖對干酪乳桿菌生長和代謝的影響

張曉峰,李 婉,李文杰,時寶慶,王 旗

(鄭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系,河南鄭州 450001)

為研究干酪乳桿菌體外利用低聚果糖的生長代謝過程,分別以0.5%、1.5%、3%低聚果糖替代0.5%葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源,取0、4、8、12、18、24h發(fā)酵液測pH、菌落數(shù)、代謝產物。結果表明:隨著培養(yǎng)時間的延長,培養(yǎng)基中pH降低；0.5%低聚果糖培養(yǎng)基中干酪乳桿菌數(shù)量在8h時達到最高值,增加低聚果糖濃度到1.5%,干酪乳桿菌的數(shù)量隨之增加；繼續(xù)增加低聚果糖濃度到3%,干酪乳桿菌數(shù)量沒有明顯差異(p>0.05)。干酪乳桿菌代謝低聚果糖在4h時乙酸產量達到最高值,且3%低聚果糖培養(yǎng)基中乙酸產量是0.5%、1.5%低聚果糖的2倍；乳酸產量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸積累,3%低聚果糖培養(yǎng)基中乳酸產量最多,干酪乳桿菌利用低聚果糖的主要代謝產物為乙酸和乳酸。

低聚果糖,干酪乳桿菌,代謝

低聚果糖(Fructooligosaccharide,FOS),又稱蔗果低聚糖,是指1～4個果糖基和蔗糖的D-果糖基以β-2,1糖苷鍵結合生成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖等的混合物[1]。FOS天然存在洋蔥、芹菜、大蒜、蘆筍、香蕉等植物中；FOS甜度低,產能低,防齲齒,被認為是可溶性膳食纖維；它不能被人體內特定水解α-糖苷鍵的消化酶所水解,從而直接進入結腸,被腸道微生物代謝,降低腸道pH,促進鐵和鈣等礦物質的吸收;低聚果糖還具有調節(jié)腸道菌群,增強免疫力,預防疾病的作用[2-5]。在體外研究腸道細菌利用低聚果糖發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)量增加[6]；研究乳雙歧桿菌和乳酸菌菌株體外發(fā)酵低聚糖的性能時,結果表明低聚果糖能夠促進乳酸菌增殖[7]。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),作為益生菌常被用于酸乳、干酪和奶油等乳制品的發(fā)酵劑和輔助發(fā)酵劑,干酪乳桿菌作為一種生物保護因子,具有防止酸奶中真菌生長和延長保質期的作用[8]。干酪乳桿菌進入人體后,能夠耐受口腔中的酶、胃液的低pH以及小腸中的膽汁酸,在腸道內大量存活。攝入干酪乳桿菌可調節(jié)人體腸道菌群平衡,增加腸道雙歧桿菌等益生菌數(shù)量和有機酸含量[9]；干酪乳桿菌具有低血清膽固醇的功效[10]；它可以通過改善血脂異常,免疫調節(jié)和氧化應激來降低糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生風險[11]；干酪乳桿菌還具有提高機體免疫力,抗腫瘤的作用[12]。研究表明低聚果糖能夠體外增殖乳酸菌并產生揮發(fā)性脂肪酸和乳酸,但是有關單一菌株利用低聚果糖的代謝情況并不明確[6-7,13]。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,CICC 23185)對其宿主營養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效,本實驗采用體外培養(yǎng)的方法對其利用低聚果糖的生長過程進行研究,并分析其代謝產短鏈脂肪酸和乳酸以進一步了解干酪乳桿菌的糖利用代謝狀況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,CICC 23185) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；低聚果糖:純度95% 上海勁馬生物科技有限公司；冰乙酸標準品、乳酸標準品 阿拉丁試劑；MRS肉湯 北京路橋化學試劑有限公司；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉 天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

SW-CJ型超凈工作臺 蘇州安泰；PNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏；HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋 HIRAYAMA;DELTA 320型pH計 梅特勒-托利多；XK97-A型菌落計數(shù)器 姜堰新康；GC-6890N型氣相色譜儀 Agilent。

1.3 實驗方法

1.3.1 干酪乳桿菌體外培養(yǎng) 菌種活化:稱取MRS肉湯5.24g,加熱溶解于100mL蒸餾水中,115℃高壓滅菌15min,冷卻至室溫,接種干酪乳桿菌凍存液1mL,37℃度培養(yǎng)9h,調整菌種活化液活菌數(shù)為107CFU/mL,備用。

基礎培養(yǎng)基成分(g/100mL):牛肉膏1g,蛋白胨1g,酵母粉0.5g,CaCO32g,吐溫80 0.1g,葡萄糖0.5g,鹽溶液5mL。鹽溶液組成成分(g/100mL):乙酸鈉10g,檸檬酸氫二銨4g,K2HPO44g,MgSO4·7H2O 0.4g,MnSO4·H2O 0.1g,調節(jié)pH至6.8。

三種低聚果糖培養(yǎng)基:分別用0.5、1.5、3.0g低聚果糖替代基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖,配制成0.5%、1.5%、3.0%果糖培養(yǎng)基。

單獨取每種培養(yǎng)基9mL于20mL西林瓶中,每瓶接種活化菌液1mL,調整pH至6.8,加蓋膠塞,用膠帶密封,37℃培養(yǎng)。在0、4、8、12、18、24h六個時間段各取出3瓶培養(yǎng)液,4℃冷藏,待測。

1.3.2 pH的測定 測四種培養(yǎng)基在0、4、8、12、18、24h六個時間段培養(yǎng)液pH,每樣3個重復。

1.3.3 干酪乳桿菌數(shù)量的測定 按國標GB4789.35-2010進行計數(shù),計算出每毫升培養(yǎng)液中的活菌數(shù)(CFU/mL),結果換算成以10為底的對數(shù)進行統(tǒng)計比較。

1.3.4 干酪乳桿菌主要代謝產物的測定 根據(jù)參考文獻[14]進行實驗。

1.3.4.1 干酪乳桿菌代謝短鏈脂肪酸的測定 短鏈脂肪酸的測定:取2mL培養(yǎng)液,置于5mL離心管,在4000r/min條件下離心10min；在1.5mL離心管加入1mL上清液、5微升0.75mol/L的HCl混勻,放置10min后,在13000r/min條件下離心5min；取上清液,經0.45μm濾膜過濾于1.5mL離心管中,密封,進行乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的氣相色譜分析。

短鏈脂肪酸的色譜條件:毛細管柱:Agilent DB-WAX(30m×250μm,液膜厚度0.25μm)；進樣量:1μL；載氣和流速:空氣:400mL/min,H2:40mL/min,N2:25mL/min；檢測器溫度:250℃；分流比:30∶1；柱前壓:15.5kPa；柱溫:以10℃/min由80℃至110℃,維持1min；再以5℃/min升至135℃,維持1min；最后以5℃/min升至145℃,維持1min。

1.3.4.2 干酪乳桿菌代謝乳酸的測定 乳酸的測定:取2mL培養(yǎng)液,置于10mL離心管,加體積分數(shù)為50%的硫酸溶液0.5mL,甲醇2.0mL,混勻,在58℃條件下水浴30min,冷卻至室溫。加水和三氯甲烷各1.0mL,振搖3min；在4000r/min條件下離心5min,棄去上層的水溶液,取下層的三氯甲烷層,經過0.45μm濾膜,過濾至1.5mL離心管,密封,進行氣相色譜分析。

乳酸的色譜條件:毛細管柱:Agilent DB-WAX(30m×250μm,液膜厚度0.25μm)；進樣量:1μL；載氣和流速:空氣:400mL/min；H2:40mL/min；N2:25mL/min；檢測器溫度:250℃；分流比:30∶1；柱前壓:15.5kPa；柱溫:140℃維持3min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示,采用軟件SPSS12.0進行t檢驗和方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對pH變化的影響

不同碳源培養(yǎng)基對干酪乳桿菌發(fā)酵液pH的影響見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)基pH的變化Fig.1 pH changes of different culture medium

圖1表示不同碳源培養(yǎng)基對干酪乳桿菌發(fā)酵液pH影響。由圖1可知,培養(yǎng)基初始pH為6.80,隨著培養(yǎng)時間的延長,0.5%低聚果糖培養(yǎng)基pH在8h內快速下降,其它三種培養(yǎng)基pH在12h內快速下降,之后進入平穩(wěn)期。結果表明,干酪乳桿菌可以利用培養(yǎng)基中低聚果糖產生酸性物質,使培養(yǎng)基pH迅速降低。12h以后培養(yǎng)基中pH:3.0%低聚果糖<1.5%低聚果糖<0.5%葡萄糖<0.5%低聚果糖,這表明干酪乳桿菌利用0.5%低聚果糖產酸量少于0.5%葡萄糖,但隨著低聚果糖濃度的增大,干酪乳桿菌在低聚果糖培養(yǎng)基中代謝活力增強,產酸增加,使培養(yǎng)基呈酸性環(huán)境。

2.2 不同培養(yǎng)基對干酪乳桿菌數(shù)量的影響

表1 不同培養(yǎng)基中干酪乳桿菌的數(shù)量Table 1 The number of lactobacillus casei in different culture ±SD,n=3)(lgCFU/mL)

注:G:葡萄糖,F:低聚果糖；a,b表示同一培養(yǎng)基不同時間段顯著水平；A,B表示同一時間段不同培養(yǎng)基顯著水平；標有不同字母者表示組間差異顯著(p<0.05),相同字母者表示組間差異不顯著(p>0.05),表2、表3同。

表2 不同培養(yǎng)基中乙酸含量Table 2 Acetic acid content in different culture ±SD,n=3)(mmol/L)

由表1可知,培養(yǎng)4h后,0.5% F培養(yǎng)基中,干酪乳桿菌數(shù)量顯著增加,8h后進入平穩(wěn)期；其它三種培養(yǎng)基中,干酪乳桿菌數(shù)量在前12h增加顯著,之后進入平穩(wěn)期。表明低聚果糖對干酪乳桿菌生長有促進作用,Endo等[15]的研究結果也顯示低聚果糖能夠使干酪乳桿菌增殖。

8h時,三種低聚果糖培養(yǎng)基中干酪乳桿菌數(shù)量均比0.5% G中的多,且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。這表明,干酪乳桿菌能夠快速利用低聚果糖增殖。

12h時,不同培養(yǎng)基干酪乳桿菌數(shù)量:0.5% F<0.5%G<1.5% F、3% F,而1.5% F和3% F之間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。這說明隨著培養(yǎng)時間的延長,干酪乳桿菌利用0.5% G增殖的能力優(yōu)于0.5% F,增加低聚果糖添加量,1.5% F中干酪乳桿菌的生長情況優(yōu)于0.5% G,但繼續(xù)增加培養(yǎng)基中低聚果糖的添加量到3%,干酪乳桿菌的生長情況與1.5% F沒有明顯差異。這表明,培養(yǎng)基中低聚果糖添加量對干酪乳桿菌的生長有一定的影響。

2.3 不同培養(yǎng)基對干酪乳桿菌代謝產物的影響

2.3.1 不同培養(yǎng)基對干酪乳桿菌代謝短鏈脂肪酸的影響 短鏈脂肪酸標準品和樣品氣相色譜圖見圖2和圖3。

圖2 短鏈脂肪酸氣相色譜圖(標準品)Fig.2 The gas chromatogram of the short chain fatty acid(Standars)

圖3 短鏈脂肪酸氣相色譜圖(樣品)Fig.3 The gas chromatogram of short chain fatty acid(samples)

干酪乳桿菌體外代謝低聚果糖的短鏈脂肪酸產物只檢測到乙酸,并未檢測到丙酸和丁酸,這與Fukuda等[16]研究中雙歧桿菌代謝糖類的短鏈脂肪酸產物只有乙酸的結果一致。乙酸是腸道乳酸菌等益生菌降解未被吸收的淀粉和非淀粉型多糖的產物,能夠維持腸道酸性環(huán)境,抑制有害菌的生長。乙酸進入末梢循環(huán)被外圍組織所代謝,能夠增加結腸血流量,增強回腸能動性,降低胃腸道功能紊亂的風險[17-18]。

由表2可知,4h時,三種低聚果糖培養(yǎng)基中乙酸含量顯著增加,達到最高值,且均高于0.5% G中乙酸含量；三種低聚果糖培養(yǎng)基中乙酸含量組間比較,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),且3% F中乙酸含量是其他兩種低聚果糖培養(yǎng)基中的2倍多。說明干酪乳桿菌能夠較快利用低聚果糖產生乙酸,且適量增加低聚果糖的濃度能夠使乙酸的產量增加。隨著培養(yǎng)時間的延長,三種低聚果糖培養(yǎng)基中乙酸含量逐漸減少,這與高穎等[19]研究唾液乳桿菌代謝低聚果糖中代謝產物乙酸的變化趨勢一致,這可能跟菌株的生長情況有關。

8h時,培養(yǎng)基中乙酸含量組間比較,1.5% F、0.5% F<0.5% G<3% F,且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05),0.5% F和1.5% F之間無差異(p>0.05)。12h時,培養(yǎng)基中乙酸含量組間比較,1.5% F<0.5% F<0.5% G、3% F,其中0.5% G和3% F之間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。12h之后低聚果糖培養(yǎng)基中乙酸含量趨于穩(wěn)定,這可能與培養(yǎng)基中干酪乳桿菌的數(shù)量變化有關。

表3 不同培養(yǎng)基中乳酸含量Table 3 Lactic acid content in different culture ±SD,n=3)(mmol/L)

2.3.2 不同培養(yǎng)基對干酪乳桿菌代謝乳酸的影響 由表3可知,與0h相比,12h內3% F培養(yǎng)基中乳酸含量顯著增加,8h內其他培養(yǎng)基中乳酸含量顯著增加。表明干酪乳桿菌能夠利用低聚果糖代謝產生乳酸,使培養(yǎng)基呈酸性環(huán)境。每個時間段,三種低聚果糖培養(yǎng)基中乳酸含量均比0.5% G中高,且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。4h時三種低聚果糖培養(yǎng)基中乳酸含量均是0.5%G中的2倍多。表明干酪乳桿菌代謝低聚果糖產生乳酸的能力比葡萄糖強。

圖4 乳酸氣相色譜圖(標準品)Fig.4 The gas chromatogram of lactic acid(Standars)

圖5 乳酸氣相色譜圖(樣品)Fig.5 The gas chromatogram of lactic acid(samples)

組間比較,8h時,1.5% F和3% F中乳酸含量是0.5% F中的1.7倍；12h時,1.5% F中乳酸含量是0.5% F中的近2倍,而3% F中乳酸含量是0.5% F中的近3倍。隨著培養(yǎng)時間的延長,低聚果糖培養(yǎng)基中乳酸的含量逐漸積累,Rycroft等[20]在研究中也得到相同的結果。隨著低聚果糖添加量的增大,培養(yǎng)基中乳酸含量增多。這表明低聚果糖添加量的大小對干酪乳桿菌乳酸產量有一定的影響。

3 結論

干酪乳桿菌能夠利用低聚果糖體外生長,主要代謝產物為乙酸和乳酸,使培養(yǎng)基pH降低；干酪乳桿菌代謝低聚果糖在4h時乙酸產量達到最高值,乳酸產量隨時間逐漸積累,增加低聚果糖濃度會增加代謝產物產量。

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Effect of fructooligosaccharides on the growthand metabolism ofLactobacilluscasei

ZHANG Xiao-feng,LI Wan,LI Wen-jie,SHI Bao-qing,WANG Qi

(Department of Nutrition and Food Hygiene,College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

The growth and metabolism of fructooligosaccharides(FOS)byLactobacilluscaseiinvitrowere discussed. The carbon source of 0.5% glucose was replaced by 0.5%,1.5%,3% proportion of FOS.The pH,the number of colonies and the metabolites of the fermented liquid were detected at 0,4,8,12,18,24h. The results showed that,the pH dropped with the time. The number ofLactobacilluscaseiin the 1.5% supplementation of FOS reached to the top at 8h. As the concentration increased to 1.5%,the number ofLactobacilluscaseiincreased,but increase the concentration to 3%,there were no significant difference(p>0.05). The production of acetic acid reached to the top at 4h,and the production in the 3%FOS was 2 times of 0.5% FOS,1.5% FOS. The production of Lactic acid gradually accumulated with the time while 3% FOS was the best,and the main metabolites ofLactobacilluscaseiwere acetic acid and lactic acid.

Fructooligosaccharide;Lactobacilluscasei;metabolism

2014-06-11

張曉峰(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)學。

TS236

A

1002-0306(2015)03-0363-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.070