李 志，楊婷婷，李文哲，王 青，王 波，徐維家

（1.大連市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116044）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血Th17與Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的研究

李 志1，楊婷婷1，李文哲2，王 青1，王 波1，徐維家1

（1.大連市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116044）

目的檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者輔助性T細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）與其相關(guān)細(xì)胞因子在外周血中的表達(dá)。方法選擇38例SLE患者，根據(jù)病情嚴(yán)重程度SLEDAI評(píng)分進(jìn)行分組；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)38例SLE患者和對(duì)照組Th17和Treg細(xì)胞的數(shù)量；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血漿中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果SLE患者外周血中Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL－17、IL－23和IL－6顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且疾病活動(dòng)組的表達(dá)也顯著高于非活動(dòng)組（P＜0.05）；此外與對(duì)照組相比，SLE非活動(dòng)組Treg的表達(dá)降低（P＜0.05），并且疾病活動(dòng)組的表達(dá)也低于非活動(dòng)組（P＜0.05）；SLE活動(dòng)組細(xì)胞因子TGF－β的表達(dá)高于非活動(dòng)組和對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論SLE患者外周血中Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高，而Treg細(xì)胞的表達(dá)降低，兩者平衡被打破，提示Th17／Treg的失衡可能在SLE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；輔助性T細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；白細(xì)胞介素17；白細(xì)胞介素23；白細(xì)胞介素6；生長轉(zhuǎn)化因子－β

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0253）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，可累及多系統(tǒng)多器官。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自免反應(yīng)在SLE病程過程中起了重要的作用。在不同的細(xì)胞環(huán)境中CD4＋T細(xì)胞可分化為不同的T淋巴細(xì)胞亞群，其中輔助性T細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在SLE發(fā)病過程中尤為重要［1］。本研究通過檢測(cè)SLE患者外周血Th17、Treg兩種T細(xì)胞亞群與其相關(guān)因子IL－17和TGF－β等的表達(dá)水平，探討Th17與Treg細(xì)胞平衡及其在SLE發(fā)病中的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取患者組為大連市中心醫(yī)院2011年5月至2012年5月的門診和住院SLE患者共38例，其中男5例，女33例，年齡22－56歲，平均（36.2± 12.51）歲；SLE的診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年制定的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，平均病程（5.14± 4.56）。根據(jù)SLEDAI評(píng)分將患者分為活動(dòng)組（≥10分）22例和非活動(dòng)組（＜10分）16例。21名健康者作為對(duì)照組，平均年齡（40.35±10.21）歲。

1.2 主要試劑

CD3－FITC，CD4－PC5，CD4－FITC，CD25－PC5單抗、固定破膜劑IntraPrepTM購自美國Beckman公司；PE－IL－17，PE－Foxp3單抗及對(duì)照購自美國eBioscience公司；Foxp3Perm Buffer（10×）、Foxp3 Fix／Perm Buffer（4×）購自BioLegend公司；刺激劑PMA、離子霉素Ionomycin、莫能霉素monensin購自美國Sigma公司；IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 標(biāo)本采集和處理

受檢者清晨空腹靜脈采血兩份于肝素鈉抗凝管中：其中一份用于Treg細(xì)胞的檢測(cè)和密度梯度離心法Ficoll分離PBMCs后對(duì)Th17細(xì)胞的檢測(cè)；另一份離心保留血清用于ELISA試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的流式檢測(cè)

將分離出的外周血單核細(xì)胞及對(duì)照組加入CD3和CD4的酶標(biāo)抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，用于Th17細(xì)胞的標(biāo)記；將標(biāo)記后的PBMCs標(biāo)本用RPMI－1640培養(yǎng)液洗滌，并加入到特殊培養(yǎng)液中（含新生牛血清、刺激劑等），放入37°溫箱孵育18－20h。培養(yǎng)后的細(xì)胞及對(duì)照組進(jìn)行固定破膜之后加入酶標(biāo)IL－17抗體和對(duì)照抗體，避光孵育30min后PBS洗滌。

取外周全血200μl及對(duì)照組加入CD4和CD25的單抗，用于Treg細(xì)胞的標(biāo)記；將標(biāo)記好的全血樣本用PBS洗滌后，進(jìn)行固定破膜。最后加入酶標(biāo)FoxP3抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的標(biāo)記，對(duì)照管加入FoxP3對(duì)照抗體，孵育30min。最后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.4.2 ELISA檢測(cè)血清中IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的含量

對(duì)于IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的測(cè)定要嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）”表示，兩組間數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血中Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)

與對(duì)照組相比，SLE患者Th17細(xì)胞的比例顯著升高（P＜0.05），且疾病活動(dòng)組Th17細(xì)胞的表達(dá)也高于非活動(dòng)組（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，SLE非活動(dòng)組和活動(dòng)組Treg的表達(dá)降低（P＜0.05），且活動(dòng)組Treg的表達(dá)也明顯低于非活動(dòng)組（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組Th17及Treg細(xì)胞的表達(dá)

2.2 各組IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β水平的比較

SLE患者血清中IL－17、IL－23和IL－6的濃度較對(duì)照組顯著性升高（P＜0.05），且疾病活動(dòng)組較非活動(dòng)組也顯著升高（P＜0.05）；SLE活動(dòng)組TGF－β的濃度高于非活動(dòng)組和對(duì)照組（P＜0.05），而對(duì)照組與非活動(dòng)組TGF－β的表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組血清中IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β水平的比較

3 討論

初始T淋巴細(xì)胞在不同的刺激條件下可分化為不同的T細(xì)胞亞群，各亞群發(fā)揮著各自的功能維持著免疫的平衡與穩(wěn)定，既相互共生又相互抑制。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者自身免疫耐受被破壞，T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)在SLE發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［3］。

初始T細(xì)胞在IL－6和TGF－β的共同作用下分化發(fā)育成Th17細(xì)胞［4］，研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞與細(xì)胞因子IL－17、IL－6、IL－23等能夠參與自免疾病和炎癥反應(yīng)。本研究顯示SLE患者Th17細(xì)胞高于健康對(duì)照組，且Th17的升高與疾病活動(dòng)性相關(guān)，提示Th17與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IL－17通過誘導(dǎo)白介素－6，TNF－α等其他致炎因子的表達(dá)來介導(dǎo)炎癥細(xì)胞到局部的浸潤進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷。此外，白介素－17也參與了樹突狀細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的成熟分化及趨化過程。除了IL－17外，Th17細(xì)胞還能分泌IL－17F，IL－21，IL－22等。此外，IL－23主要由活化的抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生，不僅可以促進(jìn)記憶性T細(xì)胞分泌IL－17，而且還能穩(wěn)定擴(kuò)增Th17細(xì)胞表型［1］，是IL－17直接有力的調(diào)節(jié)因子，在促進(jìn)和維持Th17細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用［5］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SLE患者IL－17、IL－23和IL－6的表達(dá)均顯著升高，推測(cè)Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子可能參與了SLE的發(fā)病過程。

但是如果僅存在生長轉(zhuǎn)化因子－β時(shí)，初始T細(xì)胞將不會(huì)分化為Th17而是向調(diào)節(jié)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化并分泌TGF－β，并對(duì)免疫應(yīng)答發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。已經(jīng)證實(shí)SLE患者體內(nèi)存在Treg細(xì)胞的缺陷，這一缺陷干擾了SLE患者免疫調(diào)節(jié)功能，喪失了對(duì)正常組織的免疫耐受，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生［6］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。TGF－β可抑制巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的免疫功能，發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用，從而能夠維持免疫耐受的穩(wěn)定狀態(tài)［7］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF－β在SLE患者體內(nèi)表達(dá)減少，致使機(jī)體內(nèi)的淋巴細(xì)胞的分化異常，產(chǎn)生多種自身抗體，可能是SLE發(fā)病的誘因之一。

健康的組織中Th17和Treg細(xì)胞并存、在分化過程中相互調(diào)節(jié)，在穩(wěn)定狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)未被激活，TGF－β促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，Treg細(xì)胞以主動(dòng)方式調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，使免疫系統(tǒng)既能清除異物抗原，又不會(huì)引起機(jī)體損傷而維持機(jī)體穩(wěn)定。當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵時(shí)，內(nèi)源性TGF－β與IL－6促進(jìn)Th17的分化，而后隨著IL－6的水平降低，TGF－β又通過擴(kuò)增維持調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能［1］。在許多的自身免疫疾病中，過度分化的致病T細(xì)胞和功能受損的調(diào)節(jié)T細(xì)胞打破了正常的免疫平衡狀態(tài)，使免疫系統(tǒng)向著促炎的狀態(tài)發(fā)展從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。紅斑狼瘡患者體內(nèi)Th17細(xì)胞及IL－6和IL－17，IL－23等相關(guān)因子分泌明顯提高［8］，IL－17及B細(xì)胞激活因子共同作用促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生致病的自身抗體。同時(shí)因?yàn)門reg細(xì)胞減少和Th17細(xì)胞的高表達(dá)而導(dǎo)致的Th17／Treg比例失調(diào)可作為SLE疾病的活動(dòng)指數(shù)［9］。

可見Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化發(fā)育相互制約，這依賴于各種致炎和抗炎因子的相互作用，二者平衡被打破時(shí)可導(dǎo)致SLE的發(fā)病。因此通過抑制致炎的Th17細(xì)胞的功能和分化并促進(jìn)Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能來調(diào)節(jié)兩者的比例使其達(dá)到平衡狀態(tài)對(duì)疾病的恢復(fù)可能是有益的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能為SLE的發(fā)病機(jī)制研究及靶向治療提供依據(jù)。

［1］閆成蘭，張少然，陳俊偉.系統(tǒng)性紅斑狼瘡Th17／調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡［J］.中國藥物與臨床，2012，12（3）：349.

［2］Hochberg MC.Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，1997，40（9）：1725.

［3］徐維家，李 志，楊婷婷，等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Th17和Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子水平的變化及臨床意義［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，28（5）：396.

［4］Kimura A，Naka T，Kishimoto T.IL－6－dependent and independent pathways in the development of interleukin 17－producing T helper cells［J］.PNAS，2007，104（29）：12099.

［5］Wilson NJ，Boniface K，Chan JR，et al.Development，cytokine profile and function of human interleukin－17－producing helper T cells［J］.Nat Immunol，2007，8（9）：950.

［6］尤海燕，陳軍浩，巢秀琴.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)及臨床意義［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，23（1）：5.

［7］陳俊偉，張少然，閆成蘭，等.T輔助細(xì)胞亞型細(xì)胞相關(guān)因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用［J］.中國藥物與臨床，2012，12（4）：420.

［8］Doreau A，Belot A，Bastid J，et al.Interleukin 17acts in synergy with B cell－activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus［J］.Nat Immunol，2009，10（7）：778.

［9］Q.Xing，H.Su，J.Cui，et al.Elevated Th17cells are accompanied by FoxP3＋Treg cells decrease in patients with lupus nephritis［J］.Rheumatology International，2012，32（4）：949.

Studies on the population of Th17 and Treg cells and the expression of the correlated cytokines in SLE patients

LI Zhi1，

YANG Ting－ting1，LI Wen－zhe2，et al.（1.Department of Clinical Laboratory，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian 116033，China；2.School of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian Liaoning116044，China）

ObjectiveTo investigate the population of T helper 17cells and regulatory T cell in peripheral blood of system lupus erythematosus（SLE）patientsMethodsThirty－eigth patients with SLE were recruited，grouping according to SLE disease activity index score（SLEDAI）.The percentages of Th17and Treg cells were analysed by flow cytometric.Concentrations of Interleukin（IL）－17，IL－23，IL－6，transforming growth factor－βin plasma were used by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsThe percent of Th17and IL－17，IL－23and IL－6in SLE patients was significantly increased than that of normal controls（P＜0.05），and it was different between the high active and inactive group（P＜0.05）.The population of Treg cells in the patients group was significantly lower than normal controls（P＜0.05）；Concentrations of TGF－βin SLE active group were lower than inactive group and controls（P＜0.05）.ConclusionThe study suggests that Th17and Treg cells may play an important role in the pathogenesis of SLE.

System lupus erythematosus；T helper 17；Regulatory T cell；Interleukin（IL）－17；Interleukin（IL）－23；Interleukin（IL）－6；Transforming growth factor（TGF－β）

R593.24＋1

A

李志（1971－），男，碩士，主任技師，主要從事自身免疫及分子生物學(xué)研究。

2014－01－23）

1007－4287（2015）02－0253－03

大連市醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究項(xiàng)目