馮曉青 劉華良 阮麗萍 王 芹 王 露 汪 怡 杭學(xué)宇

(1.淮安市疾病預(yù)防控制中心， 淮安 223001；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009)

儀器應(yīng)用

HPLC法測(cè)定黃魚(yú)中酸性橙Ⅱ染料

馮曉青1劉華良2阮麗萍2王 芹1王 露1汪 怡1杭學(xué)宇1

(1.淮安市疾病預(yù)防控制中心， 淮安 223001；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009)

建立了操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高的HPLC測(cè)定黃魚(yú)中酸性橙Ⅱ的方法。樣品經(jīng)均質(zhì)，取2 g粉碎樣品，乙醇震蕩提取5 min，提取液經(jīng)聚酰胺固相萃取柱分離凈化，采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)分離，以甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫，流速為1 mL/min，設(shè)定柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，二極管陣列檢測(cè)器在λ=485 nm處檢測(cè)酸性橙Ⅱ(λ=485 nm)。酸性橙Ⅱ在0.1 μg/mL～20 μg/mL的范圍內(nèi)，呈良好的線(xiàn)性響應(yīng)，線(xiàn)性方程為y=34.94x-2.697，r=0.9998。酸性橙Ⅱ檢出限為0.08 μg/mL。樣品添加濃度為0.5 mg/kg～15 mg/kg時(shí)，方法回收率為96%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～7.3%。該法用于黃魚(yú)中的酸性橙Ⅱ的含量測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，定量準(zhǔn)確可靠。

酸性橙Ⅱ 黃魚(yú) HPLC

色素酸性橙Ⅱ又名金橙Ⅱ，二號(hào)橙，桔黃橙，酸性金黃Ⅱ或酸性艷橙GR，俗名金黃粉，化學(xué)名為2-萘酚偶氮對(duì)苯磺酸鈉。酸性橙Ⅱ是一種工業(yè)染料，主要用于蠶絲、羊毛織品和皮革的染色，禁止作為食品添加劑使用。在食品中違規(guī)添加酸性橙Ⅱ，極大危害消費(fèi)者的身體健康。衛(wèi)生部重新匯總發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中“產(chǎn)品類(lèi)別”增加“鮑汁、腌鹵肉制品、紅殼瓜子、辣椒面和豆瓣醬”。但因酸性橙為化工原料，目前對(duì)食品中酸性橙Ⅱ的檢測(cè)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)中仍是空白。

文獻(xiàn)報(bào)道酸性橙Ⅱ的測(cè)定方法有紙層析法、分光光度法、反相高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[1-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究和優(yōu)化酸性橙Ⅱ的試驗(yàn)參數(shù)，建立快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的高效液相色譜檢測(cè)方法，為黃魚(yú)的市場(chǎng)質(zhì)量監(jiān)督以及安全檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國(guó)安捷倫公司)，二極管陣列檢測(cè)器及數(shù)據(jù)處理器；超聲波清洗器(KH-250DB，昆山禾創(chuàng)公司)；食品粉粹機(jī)(歐科電器有限公司)；離心機(jī)(H-1850R，湘儀儀器廠(chǎng))；漩渦混勻器(SI-T256，美國(guó)Scientific Industries公司)；氮吹儀(DB-3D，英國(guó)TECHENE公司)；固相萃取裝置(DG-12，美國(guó)Supelco公司)。酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，批號(hào)：213031462)；甲醇(色譜純，批號(hào)：1205254)；乙醇、氨水等均為分析純；聚酰胺固相萃取柱(1000 mg/6 mL，北京康農(nóng)興牧科技發(fā)展中心)；黃魚(yú)購(gòu)自市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將黃魚(yú)樣品打碎成肉泥狀，混勻后準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g粉碎樣品于15 mL具塞離心管中，加入10 mL乙醇震蕩提取5 min，以5000 r/min的速度離心5min，取上清液于另一離心管中，在殘?jiān)屑右掖?0mL，再重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，備用。聚酰胺固相萃取柱依次用3mL水、3mL乙醇活化，提取上清液過(guò)柱，控制流速小于2mL/min。用3 mL水和3 mL 乙醇淋洗，乙醇-氨水-水溶液4 mL洗脫，收集洗脫液，于80 ℃氮?dú)夥諊麓蹈?，?.0 mL流動(dòng)相溶解殘余物，渦旋1 min，以10000 r/min的速度離心5 min，取上清液，供高效液相色譜測(cè)定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液；流速：1 mL/min，梯度洗脫見(jiàn)表1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：484 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

精確稱(chēng)取0.100 g酸性橙Ⅱ，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)貯備液。吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用流動(dòng)相稀釋配制成濃度分別為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線(xiàn)。

1.2.4 測(cè)定方法

取試樣溶液和相應(yīng)的對(duì)照溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算。對(duì)照溶液及試樣溶液中酸性橙Ⅱ的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的線(xiàn)性范圍之內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長(zhǎng)選擇

取5.0 μg/mL的酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.2的色譜條件進(jìn)樣，在波長(zhǎng)為200 nm～600 nm的范圍內(nèi)對(duì)酸性橙Ⅱ進(jìn)行全掃描(圖1)，選定484 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 酸性橙Ⅱ的吸收光譜圖

2.2 流動(dòng)相及洗脫方式的選擇

試驗(yàn)中采用了甲醇-乙酸銨(80∶20)溶液、甲醇-乙酸銨(15∶85)溶液和甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫3種流動(dòng)相。結(jié)果表明，采用甲醇-乙酸銨(80∶20)溶液洗脫時(shí)，出峰時(shí)間過(guò)短，甚至不出峰，色素和干擾物之間均不能實(shí)現(xiàn)很好的分離；采用甲醇-乙酸銨(15∶85)溶液洗脫時(shí)，出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，峰型較寬與干擾物難以分離；采用甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫，從圖2中可以看出效果理想，基線(xiàn)穩(wěn)定，靈敏度高，峰型尖銳，雜質(zhì)干擾少。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫方式。

圖2 酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖(濃度為5.0 μg/mL)

2.3 抗干擾實(shí)驗(yàn)

考慮到樣品中的常見(jiàn)添加劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜等(1mg/mL)，對(duì)上述添加劑進(jìn)行全掃描，上述物質(zhì)在可見(jiàn)波長(zhǎng)下無(wú)響應(yīng)，不干擾測(cè)定(圖3)。向樣品中分別按通常使用量加入常用人工合成食用色素檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅等，均不干擾測(cè)定(圖4)。

圖3 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜混合紫外-可見(jiàn)掃描圖

圖4 檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅及酸性橙Ⅱ混合色譜圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系及檢測(cè)限

酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)工作液系列，按方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，以所得峰面積A對(duì)濃度C(μg/mL)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明在0.1μg/mL～20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)，酸性橙Ⅱ濃度與響應(yīng)值有良好的線(xiàn)性關(guān)系(圖5)，其回歸方程為：y=34.94x-2.697；相關(guān)系數(shù)：r=0.9998。根據(jù)色譜響應(yīng)值S/N≥3標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，酸性橙Ⅱ檢出限為0.08 mg/L。

圖5 酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)圖

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

以酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 μg/mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)得酸性橙Ⅱ平均峰面積為162.17，RSD為0.13%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 μg/mL，每隔2 h進(jìn)樣，每次10 μL，測(cè)得酸性橙平均峰面積為164.57，RSD為0.150%。結(jié)果表明：供試品溶液在12 h內(nèi)所測(cè)得的結(jié)果基本一致。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一黃魚(yú)樣品6份，按1.4.2的方法制成供試溶液。在上述色譜條件下，測(cè)定酸性橙Ⅱ(圖4)平均含量為4.45 mg/kg，RSD為1.54%。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取已知酸性橙Ⅱ含量(4.45 mg/kg)的陽(yáng)性樣品9份，分別作5.00 mg/kg、10.00 mg/kg、15.00 mg/kg 3種濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按1.4.2的方法制成供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定堿性橙的含量，計(jì)算回收率(表2)。結(jié)果表明，這3種濃度的加標(biāo)回收率在97.4%～99.2%之間，RSD在3.39%～4.72%之間。

表2 陽(yáng)性樣品中性橙Ⅱ的添加回收率、精密度(n=3)

另取一陰性樣品(圖5)進(jìn)行低濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。該陰性樣品中添加水平為0.50 mg/kg、1.00 mg/kg、2.00 mg/kg，回收率在95.6%～97.3%之間，RSD在4.32%～7.31%之間。

表3 空白樣品中性橙Ⅱ的添加回收率、精密度(n=3)

3 結(jié)論

本方法操作簡(jiǎn)便，精密度高，回收率好，在0.1μg/mL～20 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，為酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)方法制定提供理論支持及市場(chǎng)上染色黃魚(yú)制品的衛(wèi)生監(jiān)督提供較好的判定依據(jù)。

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Determination of acid orangeⅡin yellow croaker by HPLC.

Feng Xiaoqing1，Liu Hualiang2,Ruan Liping2, Wang Qin1, Wang Lu1,Wang Yi1,Hang Xueyu1

(1.HuaianCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian223001,China;2.JiangsuCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China)

A method for determination of acid orangeⅡ in yellow croaker, was developed.Samples were homogenized, 2 grams of sample were extracted with ethanol for 5 minutes. The extract was separated and purified by polyamide solid phase extraction column. The HPLC separation was achieved by using C18(250 mm×4.6 mm，5μm) with a mobile phase consisting of methanol and acetate buffer, and the gradient program was used at a flow rate of 1 ml/min.The column temperature was set at 30 ℃ and the injection volume was 10 μl. The detection wavelength was at 485 nm for acid orangeⅡ, then we selected the best chromatograph conditions to determine the concentration of acid orangeⅡ in yellow croaker and its added standard recoveries. This method exhibited a linear relation within 0.1-20 μg/ml acid orangeⅡ content. The regression equation was y=34.94x2.697 ( r=0.9998) and the minimum detectable limit of this method was 0.08μg/ml. The recoveries were 96%-99%, the relative standard deviations(RSDs) were 3.39%-7.31% while the contents of added standard were 0.5-10 mg/kg. The method is simple, accurate and reliable.

acid orangeⅡ; yellow croaker; HPLC

馮曉青, 男 ,技師 ,研究方向?yàn)樾l(wèi)生檢驗(yàn),Email:fengxiaoqing-20@163.com.。

杭學(xué)宇 ，男 ，副主任技師 ，研究方向?yàn)槔砘瘷z驗(yàn)，Email:664686545@qq.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2015.04.004

2015-01-19